Badanie wpływu sztywności matrycy na funkcję komórkową przy użyciu hydrożeli na bazie akrylamidu

Do modelowania podatności tkanek in vivo przy użyciu hydrożeli akrylamidowych. Osiąga się to poprzez wygenerowanie najpierw reaktywnych dolnych szkiełek nakrywkowych i silikonowanych górnych szkiełek nakrywkowych. Drugim etapem zabiegu jest wlanie i wytworzenie hydrożeli akrylowych.

Trzecim etapem zabiegu jest sieciowanie wybranego białka macierzy zewnątrzkomórkowej z hydrożelem. Ostatnim etapem zabiegu jest inkubacja i analiza komórek. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, w jaki sposób zmienna zgodność macierzy zewnątrzkomórkowej in vitro reguluje zachowanie komórek poprzez analizę za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i western blot.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę wytwarzania i stosowania hydrożeli akrylowych. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania sztywności naszej macierzy zewnątrzkomórkowej, regulacji morfologii komórek, sygnalizacji komórkowej i proliferacji. Więc zacznijmy.

Rozpocznij tę procedurę od wygenerowania reaktywnych szkiełek nakrywkowych. Najpierw umieść warstwę paraformy na dolnej połowie 150-milimetrowej szalki Petriego. Następnie przenieś do dziewięciu 25-milimetrowych szkiełek z autoklawu na folię para i przykryj je jednym mililitrem 0,1 molowego wodorotlenku sodu.

Inkubować szkiełka nakrywkowe przez trzy minuty Po inkubacji odessać wodorotlenek sodu za pomocą przewodu próżniowego pracującego w chemicznej pipecie kapturowej 0,5 mililitra trzech trimetylo-aminokwasowych lub trzech A-P-T-M-S na każdym szkiełku nakrywkowym. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez trzy minuty, a następnie zassać trzy A-P-T-M-S. Uważaj, aby nie inkubować zbyt długo, aby uniknąć tworzenia się piany na pokrywie.

Poślizgnięcia po leczeniu. Opłucz szkiełka nakrywkowe raz 20 mililitrami wody dejonizowanej w tym samym naczyniu. Usuń szkiełka nakrywkowe z naczynia za pomocą zakrzywionych kleszczy i przenieś je stroną do strony skierowanej do nowej 150-milimetrowej naczynia.

Następnie ponownie umyj szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną i umieść je na bujaku na 10 minut. Po inkubacji usuń wodę i umyj ją dodatkowo dwa razy. Bardzo ważne jest, aby usunąć wszystkie trzy A-P-T-M-S, aby nie reagowały z aldehydem glutarowym i pozostawiały mętny biały osad na 10 minut przed użyciem aldehydu glutarowego.

Za pomocą zakrzywionych kleszczyków przenieś szkiełka nakrywkowe do czystego naczynia pokrytego param i odessaj pozostałą ciecz Za pomocą linii próżniowej, a następnie całkowicie przykryj każde szkiełko nakrywkowe 0,5 mililitra 0,5% aldehydu glutarowego w sterylnej wodzie dejonizowanej, aby usieciować trzy A-P-T-M-S i żel poliakrylamidowy. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w kapturze chemicznym. Następnie odessać aldehyd glutarowy, spłukać i ponownie umyć szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną.

Następnie całkowicie wysusz szkiełka okładki. Dodać nowe szkiełka nakrywkowe do 50-mililitrowej probówki Falcon zawierającej 10% roztwór uszczelniający powierzchnię w chloroformie i skale przez co najmniej 10 minut. Zdekantować roztwór do uszczelniania powierzchni i wysuszyć na powietrzu.

Okładka nasunia się na chusteczki Kim w komorze bezpieczeństwa biologicznego, gdzie hydrożele zostaną przygotowane do rozpoczęcia przygotowania hydrożelu. Użyj zakrzywionych kleszczyków, aby przenieść szkiełka nakrywkowe stroną reaktywną do arkusza paraformu, który został przyklejony do powierzchni szafy bezpieczeństwa biologicznego. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są płasko przylegające do powierzchni paraformy.

Następnie przygotuj nasycony i hydroksy roztwór CIN aide lub NHS w toluenie, rozpuszczając niewielką ilość NHS w wystarczającej ilości toluenu. W przypadku konkretnych eksperymentów należy dodawać niewielkie ilości NHS, aż NHS przestanie się rozpuszczać. Nasycony roztwór jest zwykle mętny i różowy.

Następnie przygotuj wodę akryloamidową BIS i PS, aby osiągnąć pożądaną zawartość procentową akrylamidu. Dodaj odczynniki do probówek do mikro zastosowań, jak opisano w pisemnym protokole. Następnie po jednej porcji na raz.

Dodaj NHS i TM mnie. Krótko i natychmiast przemieszać probówkę Wlać od trzech do pięciu żeli, używając 140 mikrolitrów na szkiełko nakrywkowe w komorach bezpieczeństwa biologicznego. Szybko umieść SILIKONOWANE 25-milimetrowe szkiełko nakrywkowe na wierzchu każdego żelu, zanim zacznie polimeryzować.

Dodanie górnego szkiełka nakrywkowego pozwoli akrylamidowi całkowicie pokryć dolne szkiełko nakrywkowe. Inkubuj tę kanapkę w temperaturze pokojowej, aż akryloamid ulegnie polimeryzacji, aby określić, kiedy nastąpiła polimeryzacja. Sprawdź pozostały roztwór akrylamidu w probówce z mikrowirówką.

Polimeryzacja potrwa kilka minut w przypadku sztywnych żeli i nieco dłużej w przypadku miękkich żeli. Po zajściu polimeryzacji ostrożnie podnieś kanapkę w sterylnych rękawiczkach. Następnie zsuń górne szkiełko nakrywkowe, aż wystaje poza spolimeryzowany żel.

Następnie podważ pokrywę. Zsunąć żel, wyrzucić górne szkiełko nakrywkowe. Umieść każde dolne żelowe szkiełko nakrywkowe, zwane dalej hydrożelem, w płytce z sześcioma dołkami.

Następnie dodaj dwa mililitry soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS na dołek sześciodołkowej płytki. Następnie umyj hydrożele PBS i inkubuj na bujaku przez pięć minut. Powtórz to pranie dwa razy.

Aby rozpocząć eksperyment, przykryj każdy hydrożel dwoma mililitrami roztworu fibronektyny lub innego białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Inkubować białko na hydrożelu przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić mu kowalencyjne związanie się z hydrożelem po całonocnej inkubacji, zassać roztwór ECM. Następnie zablokuj niereaktywny NHS jednym miligramem na mililitr ogrzewania aktywowanej albuminy surowicy bydlęcej wolnej od kwasów tłuszczowych w pożywce wolnej od surowicy i inkubuj przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po inkubacji przemyć hydrożele raz sterylnym PBS. Następnie umieść komórki w odpowiedniej pożywce hodowlanej zawierającej płodową surowicę bydlęcą. Na hydrożel tutaj.

Stosuje się fibroblasty embrionalne myszy. Określ liczbę komórek, które mają zostać wysiane na hydrożelu w oparciu o stopień rozprzestrzeniania się komórek i zbieganie się wymaganych do eksperymentów. Około 10 do pięciu komórek niezbędnych do analizy western blot i ilościowej analizy PCR.

Następnie inkubuj komórki w odpowiednich warunkach dla określonego typu komórek. Po okresie inkubacji. Wyodrębnij białko komórkowe lub mRNA w zależności od potrzeb.

Odpipetuj 100 mikrolitrów kropelek buforu do lizy na arkuszu paraformu na stole laboratoryjnym, pozostawiając około dwóch do trzech centymetrów między każdą kroplą. Następnie ostrożnie usuń każdy hydrożel, podnosząc dolną szkiełko pokrywy ze studzienki. Za pomocą zakrzywionych kleszczy i umieszczenia jego komórki stroną do dołu na kropelkach.

Inkubować komórki z buforem do lizy dokładnie przez jedną minutę. Na koniec usuń szkiełka nakrywkowe i przenieś bufor do lizy do mikroprobówki wirówkowej. Alternatywnie, podczas ekstrakcji RNA przenieś każdy hydrożel na nową płytkę sześciodołkową i dodaj jeden mililitr triazolu na dołek.

Inkubować żele przez trzy minuty po inkubacji. Usunąć roztwór triazolu do przechowywania w probówce z mikrowirówką. Dokładne mycie szkiełek nakrywkowych po dodaniu A-P-T-M-S jest ważnym krokiem w produkcji reaktywnych szkiełek nakrywkowych.

Prawidłowo umyte i wysuszone szkiełka nakrywkowe są wolne od jakichkolwiek pozostałości osadu. A-P-T-M-S zareaguje z aldehydem glutarowym i wytworzy biały, mętny osad. Jeśli osad się wytrąci, całą procedurę należy powtórzyć, ponieważ szkiełko nakrywkowe nie nadaje się już do użytku.

Po utworzeniu hydrożelu i pokryciu białkami ECM, komórki w nocy są wysiewane. Istnieje wyraźna różnica między komórkami rozprzestrzeniającymi się na sztywnych i miękkich hydrożelach, co można zaobserwować po foid w barwieniu i komórkach fibroblastów embrionalnych myszy rozprzestrzeniających się w większym stopniu na sztywno, w porównaniu z miękkimi hydrożelami. Rzeczywiście, większość komórek przyczepiających się do miękkiego hydrożelu pozostanie zwarta i przyczepi się mniej wydajnie.

Reprezentatywne ilościowe wyniki PCR cyklicznych poziomów mRNA D 1 w mysich fibroblastach embrionalnych pokazują, że cykliczne D one jest znacznie regulowane w górę na sztywnej matrycy, ale nie na miękkiej matrycy. Sugeruje to, że sztywność macierzy reguluje progresję cyklu komórkowego in vitro. Właśnie pokazaliśmy, jak wygenerować hydrożel odcinający sztywność, modelując warunki fizjologiczne in vivo Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wykonaniu dodatkowych reaktywnych szkiełek nakrywkowych, ponieważ może dojść do wypadku i błędu.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.