Name: Badanie wpływu sztywności matrycy na funkcję komórkową przy użyciu hydrożeli na bazie akrylamidu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Odkryj metodę badania wpływu sztywności matrycy na funkcję komórkową przy użyciu hydrożeli poliakrylamidowych. Technika obejmuje immunofluorescencję, PCR i western blotting.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w naszym laboratorium jest finansowana z grantów National Institutes of Health.

Przygotowanie
<ul>
<li>Kryszalki należy wysterylizować w autoklawie.</li>
<li>Do przygotowywania roztworów oraz płukania kryszalków należy używać sterylnej wody destylowanej lub dejonizowanej.</li>
<li>Roztwory AC (40% w/v) i bis-AC (1% w/v) sterylizuje się poprzez filtrację przez filtr 0,2 μm. Krótko przed użyciem należy przygotować 10% roztwór persiarczanu amonu (APS; 10μg/ml wody) i przefiltrować go sterylnie. Roztwór APS należy wymieniać co miesiąc.</li>
<li>Odczynniki chemiczne, których nie można autoklawować, takie jak 3-APTMS, chloroform, glutaraldehyd, NHS i SurfaSil, przechowuje się w wyznaczonej butelce służącej wyłącznie do przygotowywania hydrożeli.</li>
<li>Aby uzyskać najlepsze wyniki, hydrożele należy wykorzystać w ciągu kilku dni po nocnej inkubacji z odpowiednim białkiem ECM.</li>
<li>Przed wylaniem hydrożelu należy przygotować 10% roztwór SurfaSil w chloroformie (zazwyczaj 10 ml wystarcza na 20 górnych kryszalków) w 50 ml polipropylenowej probówce Falcon. (W naszym laboratorium górne kryszalki są zazwyczaj silikonizowane podczas etapu inkubacji w 0,5% glutaraldehydzie). Należy dodać kryszalki do probówki Falcon i kołysać przez co najmniej 10 min. Po odlaniu roztworu SurfaSil kryszalki należy wysuszyć na chusteczkach Kimwipes w komorze z laminarnym przepływem powietrza, w której będą przygotowywane hydrożele.</li>
<li>Roztwór BSA inaktywowany termicznie przygotowuje się w następujący sposób: roztwór BSA wolnej od kwasów tłuszczowych w stężeniu 20 mg/ml w PBS inkubuje się w kąpieli wodnej w temperaturze 68°C przez 30 min. Następnie roztwór filtruje się sterylnie i przechowuje w temperaturze 4°C.</li>
</ul>

Procedura
<ol>
<li> Na dolnej połowie płytki Petri o średnicy 150 mm umieść warstwę Parafilmu.</li>
<li> Na Parafilmie ułóż do 9 szkiełek podstawkowych o wymiarach 25 mm i pokryj je 1 ml 0,1 M NaOH. Inkubuj przez 3 min, a następnie odessij ciecz za pomocą linii próżniowej.</li>
<li> Pracując w dygestorium chemicznym, nanieś 0,5 ml 3-APTMS na każde szkiełko. Inkubuj przez 3 min, a następnie odessij APTMS. Zbyt długie oczekiwanie spowoduje powstanie piany. </li>
<li> Płukz szkiełka raz 20 ml wody dejonizowanej w tej samej płytce. Wyjmij szkiełka z płytki za pomocą pęsety zakrzywionej i przenieś je stroną potraktowaną do góry do nowej płytki 150-mm. Myj szkiełka wodą dejonizowaną trzykrotnie na wstrząsarce, po 10 min każdego mycia. Jeśli nie usunie się całego APTMS, zareaguje on z glutaraldehydem w kolejnym kroku, tworząc biały, mętny osad (Rysunek 1).</li>
<li> Rozmroź glutaraldehyd (~10 min przed użyciem).</li>
<li> Za pomocą pęsety zakrzywionej przenieś szkiełka do czystej płytki wyłożonej Parafilmem i odessij pozostałą ciecz. W razie potrzeby użyj linii próżniowej lub chusteczki Kimwipe, aby osuszyć pozostałą wodę.</li>
<li> Pokryj całkowicie każde szkiełko 0,5 ml 0,5% glutaraldehydu w sterylnej wodzie dejonizowanej i inkubuj przez 30 min w dygestorium chemicznym. Odessij glutaraldehyd. Płucz i myj szkiełka zgodnie z instrukcją z kroku 4. Całkowicie wysusz szkiełka. [Na tym etapie można przerwać procedurę i przechowywać szkiełka przez kilka tygodni w suchym miejscu]. </li>
<li> Gdy będziesz gotowy do przygotowania hydrożeli, przenieś za pomocą pęsety zakrzywionej szkiełka stroną reaktywną do góry na arkusz Parafilmu przyklejony do powierzchni komory bezpieczeństwa biologicznego. Upewnij się, że szkiełka leżą płasko na powierzchni Parafilmu.</li>
<li> Przygotuj nasycony roztwór NHS w toluenie. (Rozpuść niewielką ilość NHS w ilości toluenu odpowiedniej dla konkretnego eksperymentu. Dodawaj NHS stopniowo, aż przestanie się rozpuszczać. Roztwór nasycony jest zazwyczaj mętny i różowy).</li>
<li> Następnie przygotuj akrylamid, bis-akrylamid, wodę i APS, aby uzyskać pożądane stężenie akrylamidu. Dodaj odczynniki w probówkach do mikrocentryfugi, zgodnie z poniższymi wytycznymi, do całkowitej objętości 0,8 ml.</li>
<li> Następnie, dodając po jednej porcji, dodaj NHS i TEMED do 0,8 ml roztworu AC, krótko wymieszaj wstrząsarce Vortex i NATYCHMIAST wylej 3-5 żeli, używając 140 μl na każde szkiełko w komorze bezpieczeństwa biologicznego. W miarę możliwości wszystkie kolejne kroki powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego. [Uwaga: w zależności od potrzeb można zastosować szkiełka o innym rozmiarze. W przypadku szkiełek 18-mm użyj ~33 μl roztworu AC na szkiełko i silikonizowanego szkiełka górnego 18-mm.] 
 <table border="1">
 <tbody >
 <tr >
 <td > </td>
 <td colspan="4">Bis-AC (%)</td>
 </tr >
 <tr >
 <td > </td>
 <td >0,3 (sztywny)</td>
 <td >0,15</td>
 <td >0,06</td>
 <td >0,03 (miękki)</td>
 </tr >
 <tr >
 <td > </td>
 <td >μl</td>
 <td >μl</td>
 <td >μl</td>
 <td >μl</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Woda</td>
 <td >402</td>
 <td >52</td>
 <td >594</td>
 <td >618</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >AC</td>
 <td >150</td>
 <td >150</td>
 <td >150</td>
 <td >150</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >Bis-AC</td>
 <td >240</td>
 <td >120</td>
 <td >48</td>
 <td >24</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >APS</td>
 <td >8</td>
 <td >8</td>
 <td >8</td>
 <td >8</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >TEMED</td>
 <td >1</td>
 <td >1</td>
 <td >1</td>
 <td >1</td>
 </tr >
 <tr >
 <td >NHS</td>
 <td >28</td>
 <td >228</td>
 <td >28</td>
 <td >28</td>
 </tr >
 </tbody>
 </table>
 </li>
<li> Szybko połóż silikonizowane szkiełko 25-mm na każdym żelu, zanim rozpocznie się polimeryzacja. Nałożenie górnego szkiełka powinno pozwolić na całkowite pokrycie dolnego szkiełka przez AC. Inkubuj taką „kanapkę” w temperaturze pokojowej do czasu spolimeryzowania AC. (Sprawdź pozostały roztwór AC w probówce do mikrocentryfugi, aby określić, kiedy nastąpiła polimeryzacja. Zazwyczaj wystarczy kilka minut dla żeli sztywnych i nieco dłużej dla miękkich). </li>
<li> Ostrożnie podnieś „kanapkę” (używając sterylnych rękawiczek!) i zsuń górne szkiełko, aż będzie wystawać poza spolimeryzowany żel. Następnie można je podważyć i zdjąć z żelu. Jeśli będziesz zbyt długo zwlekać z usunięciem górnego szkiełka, żel może zostać rozerwany podczas jego zdejmowania.</li>
<li> Wyrzuć górne szkiełko. Umieść dolne szkiełka z żelem (dalej nazywane hydrożelem) w płytkach 6-dołkowych z 2 ml PBS na dołek. PBS można dodać do każdego dołka przed lub po umieszczeniu szkiełka z żelem. Myj hydrożele w PBS trzykrotnie na wstrząsarce, po 5 min każdego mycia. </li>
<li> Powtarzaj kroki 1-14, aż zostanie przygotowana wymagana liczba hydrożeli.</li>
<li> Pokryj każdy hydrożel 2 ml roztworu fibronektyny (3 μg/ml w PBS) lub innego białka ECM (szczegóły patrz w Klein et al.13). Białko ECM wiąże się kowalencyjnie z hydrożelem podczas nocnej inkubacji w temperaturze 4°C. </li>
<li> Odessij roztwór ECM i zablokuj nieprzereagowany NHS za pomocą 1 mg/ml BSA wolnego od kwasów tłuszczowych i inaktywowanego ciepłem w medium bezsurowiczym przez co najmniej 30 min w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli komórkowych. Wypłucz hydrożele raz sterylnym PBS lub medium do hodowli komórkowej.</li>
<li> Wysiej komórki w odpowiednim medium hodowlanym z dodatkiem FBS. Liczba komórek wysiewanych na hydrożel powinna zostać określona przez użytkownika na podstawie stopnia rozprzestrzeniania się komórek i konfluencji wymaganej do eksperymentu. Zazwyczaj około 105 komórek jest wystarczające do analizy western blotting i qPCR.</li>
<li> Po okresie inkubacji można wyekstrahować białko komórkowe lub mRNA. Szkiełka ostrożnie usuwa się z dołków za pomocą pęsety zakrzywionej i kładzie (stroną z komórkami dołu) na kropelkach 10 μl buforu lizującego, rozmieszczonych (co 2-3 cm) na arkuszu Parafilmu na blacie laboratoryjnym. (Do przygotowania próbek do western blottingu stosujemy standardowy bufor próbkowy SDS, a do izolacji RNA dla qPCR – TRIzol). Inkubuj komórki z buforem lizującym dokładnie przez jedną minutę. Zdejmij szkiełka i przenieś bufor lizujący do probówki do mikrocentryfugi. Alternatywnie, wyłącznie dla ekstrakcji RNA, użytkownik może przenieść każdy hydrożel do nowej płytki 6-dołkowej i dodać 1 ml TRIzolu na dołek. Inkubuj przez 3 minuty, a następnie pobierz roztwór TRIzolu do przechowywania w probówce do mikrocentryfugi.</li>
</ol>

Dodatkowe informacje na temat procedur takich jak immunofluorescencja, barwienie BrdU, transfekcja itp. dla komórek wysianych na hydrożelach opisano w pracy Klein et al. 20713.

Reprezentatywne wyniki
Dokładne przemycie szkiełek nakrywkowych po dodaniu APTMS jest kluczowym etapem przygotowania „reaktywnych” szkiełek. Jeśli APTMS nie zostanie całkowicie usunięty, wejdzie on w reakcję z glutaraldehydem w kolejnym kroku, co doprowadzi do powstania białego, mętnego osadu, jak pokazano na rysunku 1A. Rysunek 1B przedstawia prawidłowo przemyte i wysuszone szkiełko nakrywkowe. W przypadku powstania osadu całą procedurę należy rozpocząć od początku, ponieważ szkiełko nakrywkowe nie nadaje się już do użytku.
Po uformowaniu hydrożelu i inkubacji z białkami ECM przez noc, następnego dnia można przystąpić do wysiewania komórek. Jak pokazano na Rysunku 2, występuje wyraźna różnica w rozprzestrzenianiu się komórek na sztywnych i miękkich hydrożelach. Jak wynika z barwienia falloidyną embrionalnych fibroblastów mysich (MEF), komórki rozprzestrzeniają się w większym stopniu na hydrożelach sztywnych w porównaniu do miękkich. W rzeczywistości większość komórek przywierających do miękkiego hydrożelu pozostanie zwartymi skupiskami i będzie przytwierdzalać mniej efektywnie.
Chociaż na Rysunku 2 przedstawiono morfologię jedynie komórek MEF, różnica w rozprzestrzenianiu się komórek jest spójna dla kilku innych badanych linii komórkowych11-12,14.
Klucze do sukcesu
<ol>
<li>Po rozpoczęciu procedury bardzo ważne jest utrzymywanie szkiełek podstawkowych stroną „reaktywną” do góry oraz pamiętanie, która strona została pokryta.</li>
<li>Podczas całej procedury należy nosić rękawiczki, aby zapewnić jak najbardziej sterylne środowisko pracy.</li>
<li>Większość początkowych etapów wykonuje się pomiędzy wyciągiem chemicznym a blatem laboratoryjnym. Wszystkie kroki następujące po usunięciu nadmiaru glutaraldehydu ze szkiełek podstawkowych powinny być przeprowadzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
<li>Ze względu na różnice w rozprzestrzenianiu się komórek (Rysunek 2), zalecamy wysiewanie dwukrotnie większej liczby komórek na hydrożele miękkie w porównaniu do hydrożeli sztywnych.</li>
<li>Proces polimeryzacji AC jest niezwykle szybki. Osoby wykonujące tę procedurę po raz pierwszy mogą zmniejszyć ilość APS lub TEMED w roztworze, aby wydłużyć proces polimeryzacji. Nie należy próbować przygotowywać więcej niż kilku szkiełek podstawkowych jednocześnie.</li>
<li>W badaniach cyklu komórkowego, w których wymagana jest synchronizacja w fazie G0, zazwyczaj stosujemy głodzenie surowicze komórek w plastikowych naczyniach hodowlanych, po czym komórki trypsynizujemy i wysiewamy ponownie na hydrożele o różnej sztywności w obecności mitogenów (FBS i/lub czynników wzrostu). Procedura ta zapewnia, że początkowa populacja komórek zsynchronizowanych w fazie G0 jest identyczna we wszystkich próbkach. Jednak w przypadku wielu badań nad transdukcją sygnału wymagany czas stymulacji mitogenem może być zbyt krótki, aby umożliwić adhezję i rozprzestrzenianie się komórek. W takim przypadku komórki głodzimy surowiczo bezpośrednio na hydrożelach, a następnie stymulujemy je mitogenem.</li>
</ol>
 <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1a.jpg" alt="Obraz mikroskopowy rozwijającego się zarodka; analiza struktury komórkowej w badaniach wzrostu embrionalnego." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1a"> 
 Rysunek 1A. Nieprawidłowo umyta szkiełko nakrywkowe. Po dodaniu APTMS szkiełko przykrywkę przemyto przez 1–2 minuty przed dodaniem roztworu glutaraldehydu. Na szkiełku przykrywce, którego nie przemyto zgodnie z krokami opisanymi w procedurze, powstaje osad.
 <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig1b.jpg" alt="Kolisty obraz dyfrakcyjny; ustawienie eksperymentu optycznego do badania interferencji światła." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1b"> 
Rysunek 1B. Prawidłowo umyte szkiełko nakrywkowe. Po dodaniu APTMS szkiełko nakrywki przemyto trzykrotnie, po 10 minut each, przed dodaniem roztworu glutaraldehydu. Na szkiełku nakrywki nie powstaje osad.
 <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig2.jpg" alt="Adhezja komórek do podłoży o różnej sztywności; porównanie z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej; wpływ sztywności." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2. Morfologia komórek na hydrożelach o różnej sztywności. Ustanowione linie MEF wysiano na hydrożelach powlekanych fibronektyną o wysokiej lub niskiej sztywności na 9 godzin. Po okresie inkubacji komórki utrwalono, poddano permeabilizacji i zabarwiono FITC-falloidyną, która wiąże się z f-aktyną. Komórki MEF na żelach o wysokiej sztywności wykazują obecność włókien stresowych i są dobrze rozpostarte w porównaniu z komórkami wysianymi na hydrożelach o niskiej sztywności. Pasek skali = 50μm.
 <img src="/files/ftp_upload/2089/2089fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący poziomy mRNA cykliny D1/18S w różnych warunkach sztywności: G0, H, L." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywny wynik ilościowej PCR dla poziomów mRNA cykliny D1 u myszy. Mysie fibroblasty zarodkowe poddane głodzeniu surowiczemu wysiano na hydrożele o wysokiej (3% akrylamidu) lub niskiej (0,3% akrylamidu) sztywności, a następnie stymulowano 10% FBS przez 9 godzin. Po ekstrakcji RNA przeprowadzono analizę ilościową metodą real-time PCR w celu oznaczenia poziomu mRNA cykliny D1 (znormalizowanego do RNA 18S). G0 oznacza poziom mRNA cykliny D1 w komórkach spoczywających. Poziomy mRNA cykliny D1 wzrastają znacząco na sztywnych hydrożelach, ale nie na hydrożelach miękkich. Dane przedstawiono jako średnia +/- SD dla powtórzonych reakcji PCR.

<ol><li>Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+analysis+of+heterogeneous%2C+atherosclerotic+human+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta.</a> J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).</li>
<li>Bernini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness%2C+intima-media+thickness+and+carotid+artery+fibrosis+in+patients+with+primary+aldosteronism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibrosis in patients with primary aldosteronism.</a> J Hypertens. 26, 2399-2405 (2008).</li>
<li>Boonyasirinant, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+stiffness+is+increased+in+hypertrophic+cardiomyopathy+with+myocardial+fibrosis%3A+novel+insights+in+vascular+function+from+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aortic stiffness is increased in hypertrophic cardiomyopathy with myocardial fibrosis: novel insights in vascular function from magnetic resonance imaging.</a> J Am Coll Cardiol. 54, 255-2562 (2009).</li>
<li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Duprez, D. A., Cohn, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+stiffness+as+a+risk+factor+for+coronary+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Arterial stiffness as a risk factor for coronary atherosclerosis.</a> Curr Atheroscler Rep. 9, 139-144 (2007).</li>
<li>Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+mechanical+properties+of+human+atherosclerotic+tissue+by+high-frequency+intravascular+ultrasound+imaging.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb%22%5BJournal%5D)">Prediction of mechanical properties of human atherosclerotic tissue by high-frequency intravascular ultrasound imaging. An in vitro study.</a> Arterioscler Thromb. 12, 1-5 (1992).</li>
<li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li>
<li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues%3A+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples.</a> Phys Med Biol. 52, 1565-1576 (2007).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc. Natl. Acad Sci USA. 94, 13661-13665 (1997).</li>
<li>Klein, E. A., Yung, Y., Castagnino, P., Kothapalli, D., Assoian, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%2C+cellular+tension%2C+and+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion, cellular tension, and cell cycle control.</a> Methods Enzymol. 426, 155-175 (2007).</li>
<li>Klein, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+control+by+physiological+matrix+elasticity+and+in+vivo+tissue+stiffening%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening.</a> Current Biology. 19, 1511-1518 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Kluczowym elementem procesu polimeryzacji hydrożelu jest unikanie powstawania pęcherzyków powietrza, które mogłyby spowodować wiązanie się komórek z szklanym szkiełkiem nakrywką zamiast z samym hydrożelem pokrytym ECM. Można temu zapobiec, ostrożnie pipetując roztwór do polimeryzacji po wymieszaniu w wortexie i wizualnie upewniając się, że w żelu nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Zawsze zalecamy przygotowanie dodatkowych „reaktywnych” szkiełek nakrywkowych i hydrożeli, aby mieć pewność, że ich liczba będzie wystarczająca...

<table><tbody><tr><td>Glutarialdehyd, 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7776</td><td>Przechowywać w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>3-APTMS (3-aminopropyltrimetoksysilan 97%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>SurfaSil Siliconizing Fluid</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>42800</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>NHS (ester N-hydroksysuccynimidowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-8060</td><td>Przechowywać w 4&amp;#x00B0;C. Wymieniać co miesiąc</td></tr><tr><td>Albuminy, z surowicy bydlęcej, w zasadzie wolne od kwasów tłuszczowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-100G</td><td>Przechowywać w 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Kryszalki (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-86 25 Cir 1D</td><td></td></tr><tr><td>Kryszalki (18mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-84 18 Cir 1D</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Sztywność tkanki jest istotnym czynnikiem determinującym funkcje komórkowe, a zmiany sztywności tkanek są powszechnie powiązane z włóknieniem, nowotworami oraz chorobami układu sercowo-naczyniowego1-11. Tradycyjne podejścia biologii komórki do badania funkcji komórkowych polegają na hodowli komórek na sztywnym podłożu (szalkach plastikowych lub szkiełkach nakrywkowych), co nie pozwala uwzględnić wpływu elastycznej macierzy pozakomórkowej (ECM) ani różnic w sztywności ECM między poszczególnymi tkankami. Aby modelować in vitro warunki podatności tkanek in vivo, my oraz inne zespoły stosujemy hydrożele powlekane ECM. W naszym laboratorium hydrożele opierają się na poliakryloamidzie, który może naśladować zakresy podatności tkanek występujące w naturze12. „Reaktywne” szkiełka nakrywkowe otrzymuje się poprzez inkubację z NaOH, a następnie dodanie 3-APTMS. Do sieciowania 3-APTMS i żelu poliakryloamidowego wykorzystuje się glutaraldehyd. Do polimeryzacji hydrożelu używa się roztworu akryloamidu (AC), bis-akryloamidu (Bis-AC) i persiarczanu amonu. Do roztworu AC wprowadza się N-hydroksysukcynimid (NHS), aby połączyć białka ECM z hydrożelem. Po polimeryzacji hydrożelu powierzchnia żelu jest powlekana wybranym białkiem ECM, takim jak fibronektyna, witronektyna, kolagen itd.
Sztywność hydrożelu można określić za pomocą reologii lub skaningowej mikroskopii sił atomowych (AFM) i regulować poprzez zmianę procentowej zawartości AC i/lub bis-AC w roztworze12. W ten sposób można dopasować sztywność podłoża do sztywności tkanek biologicznych, którą również można ilościowo określić za pomocą reologii lub AFM. Następnie na tych hydrożelach można wysiać komórki i hodować je zgodnie z wymaganymi warunkami eksperymentalnymi. Obrazowanie komórek oraz ich odzyskiwanie do analizy molekularnej jest proste. W niniejszym artykule definiujemy podłoża miękkie jako takie, których moduły sprężystości (E) wynoszą &lt;3000 Pascal, a podłoża/tkanki sztywne jako takie, których E wynosi &gt;20,000 Pascal.

Wpływ sztywności podłoża na funkcje komórkowe można modelować in vitro, wykorzystując hydrożele poliakryloamidowe o różnym stopniu podatności.

Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

Sztywność tkanki jest istotnym determinantem funkcji komórkowych, a zmiany sztywności tkanki są powszechnie powiązane z włóknieniem, nowotworami i ...

Celem jest modelowanie podatności tkanek in vivo przy użyciu hydrożeli akryloamidowych. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie reaktywnych szkiełek nakrywkowych dolnych oraz silikonizowanych szkiełek nakrywkowych górnych. Drugim krokiem procedury jest wylanie i utworzenie hydrożeli akryloamidowych.Trzecim krokiem procedury jest sieciowanie wybranego białka macierzy zewnątrzkomórkowej z hydrożelem. Ostatnim etapem procedury jest inkubacja i analiza komórek. W rezultacie można uzyskać dane pokazujące, w jaki sposób zmienna sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej in vitro reguluje zachowanie komórek, co potwierdza analiza z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej, ilościowego PCR w czasie rzeczywistym oraz techniki western blotting.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę otrzymywania i wykorzystania hydrożeli akryloamidowych. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać, w jaki sposób sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej reguluje morfologię, sygnalizację i proliferację komórek. Zatem zacznijmy.Procedurę należy rozpocząć od przygotowania reaktywnych szkiełek nakrywkowych. Najpierw należy nałożyć warstwę parafilmu na dolną połowę 150 milimetrowej szalki Petriego. Następnie należy przenieść do dziewięciu autoklawowanych szkiełek nakrywkowych o średnicy 25 milimetrów na parafilm i przykryć je 1 mililitrem 0,1 molarnego wodorotlenku sodu.Inkubuj szkiełka podstawowe przez trzy minuty. Po inkubacji odessij wodorotlenek sodu za pomocą linii próżniowej, pracując w dygestorium. Pipetuj 0,5 ml 3-aminopropylotrimetylosilanu (3-APTMS) na każde szkiełko. Inkubuj szkiełka przez trzy minuty, a następnie odessij 3-APTMS. Zachowaj ostrożność i nie inkubuj zbyt długo, aby uniknąć powstania piany na szkiełku.Kolejne etapy po obróbce. Przepłucz szkiełka nakrywkowe raz 20 mililitrami wody dejonizowanej w tej samej szalce. Wyjmij szkiełka nakrywkowe z szalki za pomocą pęsety zakrzywionej i przenieś je stroną poddaną obróbce do góry do nowej szalki o średnicy 150 milimetrów.Następnie ponownie przemyj szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną i umieść je na kołysarce na 10 minut. Po inkubacji usuń wodę i przemyj szkiełka dodatkowo dwa razy. Bardzo ważne jest całkowite usunięcie APTMS, aby nie zareagował on z glutaraldehydem i nie pozostawił mętnego białego osadu na 10 minut przed użyciem glutaraldehydu.Za pomocą zakrzywionej pęsety przenieś szkiełka nakrywkowe do czystej szalki wyłożonej paramem i odessij pozostały płyn za pomocą linii próżniowej, a następnie całkowicie pokryj każde szkiełko nakrywkowe 0,5 milliliters 0,5% glutaraldehydu w sterylnej wodzie dejonizowanej, aby przeprowadzić sieciowanie trzech A-P-T-M-S i żelu poliakrylamidowego. Inkubuj szkiełka nakrywkowe przez 30 minutes w dygestorium. Następnie odessij glutaraldehyd i ponownie przemyj szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną.Następnie całkowicie wysuszyć szkiełka nakrywkowe. Przenieść nowe szkiełka nakrywkowe do probówki Falcon o pojemności 50 ml zawierającej 10% roztwór surface seal w chloroformie i inkubować w ruchu kołyszącym przez co najmniej 10 minut. Odlać roztwór surface seal i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.Połóż szkiełka nakrywkowe na chusteczkach Kim wipes w komorze z laminarnym przepływem powietrza, w której będą przygotowywane hydrożele, aby rozpocząć proces ich przygotowania. Używając pęsety zakrzywionej, przenieś szkiełka nakrywkowe stroną reaktywną do góry na arkusz paraflemonu przyklejony taśmą do powierzchni komory. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe przylegają płasko do powierzchni paraflemonu.Następnie należy przygotować nasycony roztwór NHS w toluenie, rozpuszczając niewielką ilość NHS w odpowiedniej ilości toluenu. W przypadku konkretnych eksperymentów dodawaj małe ilości NHS, aż przestanie się ona rozpuszczać. Nasycony roztwór jest zazwyczaj mętny i różowy.Następnie przygotować akrylamid, BIS-akrylamid, wodę oraz PS, aby uzyskać pożądane stężenie procentowe akrylamidu. Dodać odczynniki do probówek mikrocentryfużkowych zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie dodawać po jednej alikwocie na raz.Dodać NHS oraz TM me. Krótko zawirrować probówkę i niezwłocznie rozlać między trzy do pięciu żeli, używając 140 µL na szkiełko nakrywkowe, w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Szybko położyć silikonizowane szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm na wierzchu każdego żelu, zanim rozpocznie się polimeryzacja.Nałożenie górnego szkiełka zakryjącego pozwoli akrylamidowi na całkowite pokrycie dolnego szkiełka zakrywającego. Inkubować tak przygotowaną kanapkę w temperaturze pokojowej do czasu spolimeryzowania akrylamidu; moment zakończenia polimeryzacji można określić, sprawdzając pozostałość roztworu akrylamidu w probówce do mikrocentryfugi.Polimeryzacja zajmie kilka minut w przypadku żeli sztywnych i nieco więcej czasu w przypadku żeli miękkich. Po zakończeniu polimeryzacji ostrożnie podnieś kanapkę, używając sterylnych rękawiczek. Następnie przesuń górną szkiełko nakrywkowe, aż będzie wystawać poza spolimeryzowany żel.Następnie podważ pokrywkę. Zsuń żel i wyrzuć górne szkiełko zakrywkowe. Umieść każde dolne szkiełko zakrywkowe z żelem, zwane w dalszej części hydrożelem, w płytce sześciodołkowej.Następnie do każdego dołka płytki 6-dołkowej należy dodać 2 mL soli fizjologicznej fosforanowej (PBS). Potem hydrożele należy przemyć PBS i inkubować na potrząsaczkie przez 5 minut. Czynność przemywania należy powtórzyć dwukrotnie.Aby rozpocząć eksperyment, należy pokryć każdy hydrożel dwiema mililitrami roztworu fibronektyny lub innego białka macierzy zewnątrzkomórkowej. Inkubować białko na hydrożelu przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić jego kowalencyjne związanie z hydrożelem; po nocnej inkubacji odessać roztwór ECM. Następnie zablokować nieaktywne grupy NHS, stosując 1 mg/mL aktywowanej termicznie albuminy surowicy bydlęcej wolnej od kwasów tłuszczowych w medium bezsurowiczym, i inkubować przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C.Po inkubacji przemyj hydrożele raz sterylnym PBS. Następnie wysiej komórki w odpowiedniej pożywce hodowlanej zawierającej płodową surowicę bydlęcą. Bezpośrednio na hydrożel.Wykorzystuje się ustabilizowane embrionalne fibroblasty mysie. Liczbę komórek wysiewanych na hydrożel należy określić na podstawie stopnia rozprzestrzeniania się komórek oraz konfluencji wymaganej do przeprowadzenia doświadczenia. Do analizy western blot oraz ilościwego PCR niezbędne są około 10⁵ komórek.Następnie inkubuj komórki w warunkach odpowiednich dla danego typu komórek. Po zakończeniu okresu inkubacji wyizoluj białko komórkowe lub mRNA, w zależności od potrzeb.Nanieś pipetą krople 100 µL buforu lizującego na arkusz paraformy na blacie laboratoryjnym, zachowując odstęp około dwóch do trzech centymetrów między poszczególnymi kroplami. Następnie ostrożnie wyjmij każdy hydrożel, podnosząc dolną szkiełko nakrywkowe z dołka. Używając zakrzywionej pęsety, umieść hydrożel stroną z komórkami skierowaną w dół na kroplach.Inkubować komórki w buforze lizującym przez dokładnie jedną minutę. Następnie zdjąć szkiełka nakrywkowe i przenieść bufor lizujący do probówki do mikrowirówki. Alternatywnie, podczas ekstrakcji RNA przenieść każdy hydrożel do nowej płytki 6-dołkowej i dodać jeden mililitr triazolu do każdego dołka.Inkubuj żele przez trzy minuty po zakończeniu inkubacji. Usuń roztwór triazolu i przechowuj go w probówce do mikrocentryfugi. Dokładne przemycie szkiełek podstawowych po dodaniu A-P-T-M-S jest kluczowym etapem w przygotowaniu reaktywnych szkiełek.Właściwie umyte i wysuszone szkiełka nakrywkowe są wolne od jakichkolwiek pozostałości osadu. A-P-T-M-S zareaguje z glutaraldehydem, tworząc biały, mętny osad. W przypadku pojawienia się osadu całą procedurę należy powtórzyć, ponieważ szkiełko nakrywkowe nie nadaje się już do użytku.Po sformowaniu hydrożelu i pokryciu go białkami ECM, komórki wysiewa się na noc. Istnieje wyraźna różnica w rozprzestrzenianiu się komórek na sztywnych i miękkich hydrożelach, co można zaobserwować w barwieniu phalloidiną; komórki fibroblastów embrionalnych myszy rozprzestrzeniają się w większym stopniu na hydrożelach sztywnych w porównaniu do miękkich. Rzeczywiście większość komórek przywierających do miękkiego hydrożelu pozostaje zwarta i przytwierdza się mniej efektywnie.Reprezentatywne wyniki ilościowej PCR poziomu mRNA cykliny D1 w zarodkowych fibroblastach mysich wykazują, że ekspresja cykliny D1 jest znacząco podwyższona na sztywnej matrycy, ale nie na matrycy miękkiej. Sugeruje to, że sztywność matrycy reguluje progresję cyklu komórkowego in vitro. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wytwarzania hydrożeli o różnej sztywności, co pozwala na modelowanie fizjologicznych warunków in vivo. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o przygotowaniu dodatkowych reaktywnych szkiełek podstawkowych, ponieważ mogą wystąpić błędy lub wypadki.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

studying-effects-matrix-stiffness-on-cellular-function-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie wpływu sztywności matrycy na funkcjonowanie komórki z wykorzystaniem żeli akryloamidowych

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Ten film demonstruje test do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Hydrożele poliakrylamidowe o różnej sztywności, pokryte kolagenem, są ułożone warstwami w płytce wielodołkowej, aby naśladować sztywność fizjologicznego ECM. Po nałożeniu ludzkich komórek śródbłonka na hydrożele i zakażeniu komórek bakteriami Listeria monocytogenes zmodyfikowanymi do ekspresji białka fluorescencyjnego po wejściu do komórki, cytometria...

Test do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną

Prezentujemy nowy hydrożel poliakrylamidowy, zwany hydroksy-PAAm, który umożliwia bezpośrednie wiązanie białek ECM przy minimalnych kosztach i specjalistycznej wiedzy. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z nadrukiem mikrokontaktowym ułatwia niezależną kontrolę wielu sygnałów naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania mechanostransdukcji komórkowej.

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Nasze laboratorium opracowało usieciowane DNA hydrożele poliakrylamidowe, dynamiczny system hydrożelowy, aby lepiej zrozumieć wpływ modulacji sztywności tkanek na funkcjonowanie komórek. Tutaj podajemy schematy, opisy i protokoły przygotowania tych hydrożeli.

Otrzymywanie usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych

Tutaj opisana jest metoda, która umożliwia szybkie, efektywne i niedrogie przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie wielodołkowej płytki. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być z łatwością zaadoptowana przez każde laboratorium badawcze. Byłoby to szczególnie przydatne w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Szczegółowe protokoły krok po kroku są opisane tutaj do badania sygnałów mechanicznych in vitro przy użyciu multipotencjalnych komórek grzebienia nerwowego O9-1 i hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności.

Zoptymalizowany system O9-1/Hydrogel do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Prezentujemy protokoły trójwymiarowej (3D) enkapsulacji komórek w syntetycznych hydrożelach. Procedura enkapsulacji została opisana dla dwóch powszechnie stosowanych metod sieciowania (addycji typu Michaela oraz mechanizmów wolnorodnikowych inicjowanych światłem), a także dla szeregu technik oceny zachowania enkapsulowanych komórek.

Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

Odkryj metodę badania wpływu sztywności matrycy na funkcję komórkową przy użyciu hydrożeli poliakrylamidowych. Technika obejmuje immunofluorescencję, PCR i western blotting.

Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

Przeglądaj więcej filmów