Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

Ogólnym celem niniejszej procedury jest umożliwienie szybkiego, wydajnego i niedrogiego przygotowania żeli poliakrylamidowych w formacie wielodotworowej płytki. Osiąga się to poprzez umieszczenie roztworu prekursora żelu pomiędzy szklaną płytką z powłoką hydrofobową a elastycznym podłożem plastikowym z klejem akrylamidowym. Drugim krokiem jest odklejenie żelu od szklanej płytki, który po polimeryzacji kowalencyjnie przytwierdził się do elastycznego podłoża plastikowego, i pozostawienie go do wyschnięcia.

Następnie suchy żel wraz z znajdującym się pod nim elastycznym wsparciem plastikowym wycina się w pożądane kształty i przykleja stroną plastikową do dna studni płytki wielodołkowej lub innego naczynia do hodowli komórek. Ostatnim krokiem jest pokrycie zmontowanych na płytce wielodołkowej żeli poliakrylamidowych powłoką adhezyjną dla komórek, taką jak monowarstwa kolagenu typu I. Ostatecznie do obserwacji wpływu poliakrylamidowego podłoża wykorzystuje się mikroskopię oraz inne techniki charakterystyki komórek.

W szczególności wpływu jego sztywności na zachowanie komórek. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi rozwiązaniami jest możliwość zastosowania dowolnej sztywności i grubości żeli polimerowych, a także ich przygotowania w formacie wielodołkowej płytki w sposób niskokosztowy i czasochłonny, co nie jest możliwe przy użyciu innych metod. Demonstracja procedury zostanie przeprowadzona przez studenta w moim laboratorium.

W pierwszej kolejności należy przygotować roztwór prekursorowy żelu poliakrylamidowego poprzez zmieszanie akrylamidu, sieciującego bis-akrylamidu oraz wody dejonizowanej. Sul OPA należy rozpuścić w dimetylosulfoksydzie w stężeniu 50 mg/ml. Odmierzyć 20 µl roztworu stokowego do 10 probówek do mikrocentryfugi. Następnie roztwory należy gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Następnie rozpuścić wodorostran ammonium w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać końcowe stężenie wodorostranu ammonium wynoszące 10% w/v. Odmierzyć 25 µL roztworu wodorostranu ammonium do 10 probówek do mikro wirówki i przechowywać go w temperaturze -20 °C. Przygotować roztwór kolagenu o stężeniu 0,2 mg/mL poprzez rozcieńczenie roztworu zapasu kolagenu typu I w 1x PBS o pH 7,4.

Wszystkie roztwory należy przechowywać w lodzie do momentu użycia. Na tym etapie nanieś kilka kropli roztworu hydrofobowego na szklaną płytkę i rozprowadź go po całej powierzchni za pomocą ręcznika papierowego. Po wysuszeniu płytki na powietrzu, przetrzyj ją ponownie ręcznikiem papierowym, aby wyrównać powłokę hydrofobową.

Przytnij elastyczną plastikową podkładkę tak, aby pasowała rozmiarem do szklanej płytki z powłoką hydrofobową. Następnie zaznacz stronę hydrofobową elastycznej plastikowej podkładki, lekko wydrapując powierzchnię ostrym narzędziem, takim jak skalpel. W celu przygotowania żelu dodaj 4972,5 µL roztworu prekursora poliakryloamidu o pożądanej stężeniu końcowym do probówki stożkowej o objętości 50 mL.

Umieść probówkę w komorze degazacyjnej na 30 minut z otwartym nakrętką. Następnie dodaj 25 µL wcześniej przygotowanego roztworu wodorostranu amonu do roztworu żelu DGAs, aby uzyskać końcowe stężenie wodorostranu amonu wynoszące 0,05%. Następnie dodaj 2,5 µL TM me, aby uzyskać końcowe stężenie TM ME wynoszące 0,5%. Delikatnie wymieszaj roztwór, pipetując go w górę i w dół od trzech do pięciu razy. Następnie umieść silikonowe przekładki o żądanej grubości na hydrofilowej stronie elastycznego plastikowego podłoża.

Następnie pipetuj roztwór żelu na elastyczną plastikową podkładkę pomiędzy dystansery i przykryj go delikatnie szkiełkiem przedmiotowym z powłoką hydrofobową. Po pozostawieniu żelu do polimeryzacji przez 45 minut, odklej elastyczną plastikową podkładkę z kowalencyjnie przyłączonym żelem poliakrylamidowym i pozostaw go stroną żelową do góry do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu potnij żel poliakrylamidowy na pożądane kształty.

Przygotować około 500 µL polimetylosiloksanu na każdą płytkę 96-dołkową zgodnie z instrukcjami producenta, aby przykleić żele do dna płytki wielodołkowej. Za pomocą pęsety nanieść małą kroplę polimetylosiloksanu na środek każdego dołka. Umieścić po jednym żelu poliakrylamidowym w każdym dołku, stroną z elastycznym plastikowym wspornikiem skierowaną w dół.

Po utwardzeniu polidimetylosiloksanu, za pomocą pipety transferowej nanieś niewielką ilość wcześniej przygotowanej próbki celulozy do każdego dołka i delikatnie zamieszaj z boku na bok, aby równomiernie pokryć powierzchnię żelu. Umieść płytkę z dołkami pod lampą UV o wysokiej intensywności na pięć minut. Po zakończeniu procesu przepłucz żele buforem PBS, aby usunąć nadmiar celulozy.

Za pomocą tej pipety nanieś około 50 µL wcześniej przygotowanego roztworu kolagenu typu I do każdego dołka. Pozostaw płytkę przykrytą w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny, a następnie wypłucz ją PBS w celu usunięcia nadmiaru roztworu kolagenu. Sterylizuj żele pod światłem UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez dwie godziny.

Na koniec namocz żele w pożywce kompletnej przez noc, aby je nawodnić i wyrównać. Żele należy wykorzystać do osadzania komórek niezwłocznie lub przechowywać w lodówce do dwóch dni. Przedstawiono tu przewidywaną zależność modułu Younga od kilku stężeń akryloamidu i bis-akryloamidu, oznaczonych odpowiednio jako A i B.

Zarówno moduł zachowawczy G' (G prim), jak i moduł strat G'' (G double prim) są niezależne od częstotliwości. Potwierdzono również, że suszenie, a następnie rehydratacja żeli nie wpłynęła na ich moduł Younga. Dzięki zastosowaniu sieciującego Sulo sampa można uzyskać jednorodną powłokę kolagenową na hydrożelach o dowolnej sztywności.

Zaobserwowano, że po wysianiu na żelach poliakrylamidowych na 24 godziny, komórki raka piersi M-D-A-M-B 2 31 zachowały okrągły kształt na miękkich żelach o sztywności 0,5 i 1 kPa, natomiast były w stanie rozprzestrzenić się i wydłużyć na sztywnym żelu o sztywności 100 kPa. Ponadto hydrożele wykonane na elastycznym podłożu plastikowym są przezroczyste, co umożliwia łatwą wizualizację i obrazowanie mikroskopowe. Co więcej, elastyczne podłoże plastikowe nie wykazuje autofluorescencji, a zatem nie zakłóca obrazowania komórek znakowanych fluorescencyjnie.

Morfologię komórek ilościowo określono ponadto pod kątem całkowitej powierzchni rozprzestrzenienia komórek oraz ich kolistości. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak w sposób wydajny i niedrogi przygotować żele poliamidowe w formacie płytek wielodołkowych do badań nad biologią komórki zależną od sztywności podłoża.