Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie szybkiego, wydajnego i niedrogiego przygotowania żeli poliakrylamidowych w formacie płytki wielodołkowej. Osiąga się to poprzez pierwsze przekładanie, żelowy roztwór prekursora między płytką szklaną pokrytą hydrofobem a elastycznym nośnikiem z tworzywa sztucznego z kleju akrylowego. Drugim krokiem jest oderwanie żelu od szklanej płytki, która kowalencyjnie przyczepiła się do elastycznego plastikowego nośnika podczas polimeryzacji i pozostawienie go do wyschnięcia.

Następnie suchy żel i leżący pod nim elastyczny plastikowy nośnik są cięte na pożądane kształty i przyklejane plastikową stroną do dołu do dna studzienki płytki wielodołkowej lub innego naczynia do hodowli komórkowej. Ostatnim krokiem jest pokrycie wielodołkowych żeli poliakrylamidowych zmontowanych na płytkach z powłoką adhezyjną komórkową, taką jak monowarstwa kolagenu typu pierwszego. Ostatecznie mikroskopia, a także inne techniki charakteryzacji komórek są wykorzystywane do obserwacji wpływu leżącego pod spodem substratu poliakrylamidu.

W szczególności jego sztywność na zachowania komórek. Główną przewagą tej metody nad istniejącymi metodami jest to, że pozwala na obsługę dowolnej sztywności i grubości żeli poliamidowych, a także ich montaż w formacie płytki wielodołkowej, w sposób ekonomiczny i efektywny czasowo, niedostępny innymi metodami. Demonstracja procedury zostanie wykonana jako student w moim laboratorium.

Najpierw przygotuj roztwór prekursora żelu poliakrylamidowego, mieszając akrylamid, środek sieciujący bis akrylamid i wodę dejonizowaną, rozpuść Sul OPA w dimetylosulfosulfoxie w ilości 50 miligramów na mililitr. Podzielić 20 mikrolitrów roztworu podstawowego na 10 mikroprobówek wirówkowych. Następnie flashuj, zamrażaj roztwory w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Następnie rozpuść amonu na siarczan w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać końcowe stężenie amonu na siarczan 10% wagowo. Eloqua 25 mikrolitrów amonu na roztwór siarczanu do 10 mikroprobówek wirówek i przechowywać go w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza. Przygotuj 0,2 miligrama na mililitr roztworu kolagenu, rozcieńczając roztwór podstawowy kolagenu typu pierwszego w jednym XPBS o pH 7,4.

Wszystkie roztwory są trzymane na lodzie do czasu użycia. W tym momencie umieść kilka kropel roztworu hydrofobowego na szklanej płytce i za pomocą bibuły rozprowadź po powierzchni. Po pozostawieniu płytki do wyschnięcia na powietrzu należy ponownie przetrzeć ją bibułą, aby wyrównać powłokę hydrofobową.

Wytnij elastyczną plastikową podporę, aby dopasować ją do rozmiaru płyty szklanej pokrytej hydrofobem. Następnie zaznacz hydrofobową stronę elastycznego plastikowego wspornika, lekko rysując powierzchnię ostrym narzędziem, takim jak skalpel. Do przygotowania żelu dodać 4972,5 mikrolitrów roztworu prekursora poliakrylamidu o pożądanym stężeniu końcowym do 50-mililitrowej stożkowej probówki.

Umieść probówkę w komorze odgazowującej na 30 minut z otwartą nakrętką. Następnie dodaj 25 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu amonu na siarczan do roztworu żelu DGAs, aby uzyskać końcowe stężenie amonu na siarczan 0,05%Następnie dodaj 2,5 mikrolitra TM me, aby uzyskać końcowe stężenie TM ME 0,5%Delikatnie wymieszaj roztwór, pipetując w górę iw dół trzy do pięciu razy. Następnie umieść silikonowe przekładki o pożądanej grubości po hydrofilowej stronie elastycznego plastikowego wspornika.

Następnie odpipetuj roztwór żelu na elastyczną plastikową podstawkę między przekładkami a kanapką za pomocą hydrofobowej szklanej lampy szkiełkowej. Po pozostawieniu żelu do polimeryzacji przez 45 minut, zdejmij elastyczną plastikową podpórkę z kowalencyjnie przymocowanym żelem poliakrylamidowym na wierzchu i ustaw żelową stroną do góry do wyschnięcia na powietrzu. Po wyschnięciu pokrój żel poliakrylamidowy w pożądane kształty.

Przygotuj około 500 mikrolitrów polimetylosoanu na płytkę 96-dołkową zgodnie z instrukcjami producenta, aby przykleić żele do dna płytki wielodołkowej. Umieść małą kropelkę polimetylu soanu na środku każdej studzienki za pomocą kleszczy. Umieść jeden żel poliakrylamidowy w każdym dołku elastycznym plastikowym wspornikiem do dołu.

Po utwardzeniu polidimetylu suboksanu umieścić niewielką ilość wcześniej przygotowanej sampy celulozowej w każdym dołku za pomocą pipety transferowej i obracać z boku na bok, aby równomiernie pokryć powierzchnię żelu. Umieść studzienkę pod lampą UV o wysokiej intensywności na pięć minut. Po zakończeniu spłucz żele PBS, aby usunąć nadmiar wiolonczeli.

Po tej pipecie około 50 mikrolitrów wcześniej przygotowanego kolagenu Wpisz po jednym roztworze do każdego. Dobrze pozostaw płytkę przykrytą w temperaturze pokojowej na co najmniej dwie godziny po spłukaniu PBS, aby usunąć nadmiar roztworu kolagenu. Sterylizuj żele w świetle UV w kapturze do hodowli tkankowych przez dwie godziny.

Na koniec namocz żele w kompletnym podłożu przez noc, aby nawodnić i zrównoważyć. Natychmiast użyj żeli do osadzania komórek lub przechowuj w lodówce do dwóch dni modułu młodego w funkcji kilku akrylamidów i bis. Stężenia akryloamidu oznaczone odpowiednio jako A i B są tutaj pokazane zgodnie z przewidywaniami.

Zarówno moduł pamięci G prime, jak i moduł strat G double prime są niezależne od częstotliwości. Potwierdzono również, że wysuszenie, a następnie ponowne nawodnienie żeli nie wpłynęło na moduł ich młodych. Dzięki zastosowaniu środka sieciującego Sulo sampa można uzyskać jednolitą powłokę kolagenową na hydrożelach o dowolnej sztywności.

Zaobserwowano, że po wysiewie na żelach poliakrylamidowych przez 24 godziny, rak piersi M-D-A-M-B 2 31 komórek pozostał okrągły na miękkich żelach o wadze 0,5 i 1 kilograma, ale był w stanie rozprzestrzeniać się i wydłużać na sztywnym 100-kilogramowym żelu Paskal. Ponadto hydrożele wykonane na elastycznym plastikowym wsporniku są przezroczyste i pozwalają na łatwą wizualizację i mikroskopię. Co więcej, elastyczny nośnik z tworzywa sztucznego nie ulega automatycznej fluorescencji, a tym samym nie zakłóca obrazowania komórek znakowanych fluorescencyjnie.

Morfologię komórek określono następnie ilościowo pod względem ogólnego obszaru rozprzestrzeniania się komórek i kolistości komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wydajnie i niedrogo montować żele poliamidowe w formacie płytki wielodołkowej. Do badania biologii komórki zależnej od sztywności.