Przygotowanie matryc skargowych do ilościowego określania skurczu komórkowego

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie podatnych matryc do modulacji i ilościowego określania skurczu komórkowego. Osiąga się to poprzez uprzednią aktywację szkiełka nakrywkowego, aby umożliwić zakotwiczenie matrycy. Drugim etapem zabiegu jest polimeryzacja żelu poliakrylamidowego do aktywowanego szkiełka nakrywkowego.

Trzecim krokiem zabiegu jest umieszczenie komórek na żelu i umożliwienie im przylegania. Ostatnim etapem procedury jest obrazowanie żelu w celu wygenerowania danych, które będą analizowane za pomocą protokołów mikroskopii sił trakcyjnych. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, że komórki przykładają siły trakcyjne do swojej macierzy za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych.

Cześć, nazywam się Yvonne Eons i pracuję w laboratorium Margaret ELL na Wydziale Fizyki i w Instytucie Dynamiki Biofizycznej na Uniwersytecie w Chicago. Nazywam się Steven Winter i również pracuję w laboratorium Strażników. Dzisiaj chcielibyśmy pokazać Ci procedurę tworzenia zgodnych matryc do pomiaru skurczu komórek.

Używamy tych procedur w naszym laboratorium do badania kurczliwych sieci micyny aktyny. Więc zacznijmy. Przed aktywacją szkiełek nakrywkowych należy wcześniej umieścić kilka szkiełek nakrywkowych o wymiarach 22 na 40 milimetrów o wymiarach 1,5.

Spłucz 70% etanolem na stojaku ze stali nierdzewnej tak, aby szkiełka nakrywkowe były rozstawione i nie stykały się. Pracując w dygestorii chemicznej, przygotuj 2% trzyprocentowy lub mniejszy roztwór trimeth w izopropanolu w kwadratowym szklanym naczyniu. Użyj szklanej pipety do makaronu, aby dodać profil trzy lub minoro.

Tlenek glukozy ze względu na reaktywność z tworzywem sztucznym całkowicie zanurzyć pokrywę w tym roztworze i inkubować przez 10 minut, mieszając na płytce mieszającej w dygestorium. Po namoczeniu szkiełek nakrywkowych umyj je, zanurzając je w wodzie podwójnie destylowanej. Po ostatniej wymianie wymień wodę cztery razy.

Odczekaj 10 minut namaczania z mieszaniem. Następnie suszyć szkiełka nakrywkowe w inkubatorze w temperaturze około 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po wyschnięciu pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.

Zanurz szkiełka nakrywkowe w 1% roztworze aldehydu glutarowego w wodzie podwójnie destylowanej. W szklanym kwadratowym naczyniu na talerzu mieszającym przez 30 minut. Upewnij się, że używasz czystego naczynia.

W przeciwnym razie roztwór może wydawać się mętny. Umyj szkiełka nakrywkowe przez trzy wymiany podwójnie destylowanej wody przez 10 minut na wymianę z mieszaniem. Następnie przykryj szkiełka nakrywkowe folią aluminiową, aby uniknąć kurzu i wysusz je w temperaturze pokojowej.

Po wyschnięciu pokrowiec można przechowywać w suchym miejscu, z dala od kurzu, przez okres do dwóch miesięcy. Aby przygotować poliakryloamid lub żel PAA, najpierw przygotuj roztwory podstawowe bisu akrylamidu. Mieszanka akryloamidu z 40% akrylamidu i 2% biskryloamidu zgodnie z opisem w protokole RI.

DGA roztwór akrylamidu umieszcza w komorze próżniowej przez 20 minut. Zmniejsza to ilość tlenu w żelu, co zapobiega polimeryzacji. W międzyczasie przygotuj 10% amonu na siarczan lub roztwór PS.

Następnie przetrzyj szkiełka mikroskopowe o wymiar jeden na trzy cale chusteczkami przeciwdeszczowymi X, aby powierzchnia szkiełka była hydrofobowa. Usuń kurz chusteczką Kim, aby zapewnić gładką żelową powierzchnię. Przykryj szkiełko folią aluminiową i odłóż na bok.

Następnie wyjmij roztwór akrylamidu z komory próżniowej i dodaj kulki fluorescencyjne. Aby zainicjować polimeryzację żelu, dodaj 0,75 mikrolitra TM E i 2,5 mikrolitra 10% PS. Krótko wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół. Następnie nanieść od 10 do 12 mikrolitrów roztworu akrylamidu na wcześniej przygotowany hydrofobowy szkiełko mikroskopowe.

Umieść aktywowane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 40 milimetrów na wierzchu kropli. Roztwór żelu powinien pokrywać całe szkiełko nakrywkowe. Wygładź wszelkie pęcherzyki, które mogą pojawić się w roztworze.

Pozostaw roztwór żelu do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez około 10 minut. Po polimeryzacji żel odsunie się od krawędzi szkiełka nakrywkowego. Za pomocą cienkiej końcówki pęsety ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe z powierzchni szkiełka mikroskopu z dołączonym żelem.

Zanurz żel na szalce Petriego zawierającej podwójnie destylowaną wodę, aby utrzymać uwodnioną powierzchnię żelu, aby połączyć macierz zewnątrzkomórkową lub białko ECM z żelem. Najpierw przygotuj 40 mikrolitrów roboczych podwielokrotności siarki san par, rozpuszczając proszek SULF san par w bezwodnym tlenku dimetylosulfosulku lub DMSO. Następnie usuń podwójnie destylowaną wodę z powierzchni żelu za pomocą naszego wirka do szkiełek nakrywkowych.

Uważając, aby nie wysuszyć żelu bezpośrednio przed użyciem. Rozcieńczyć podwielokrotności siarki sampa DMSO w podwójnie destylowanej wodzie i pokryć środek powierzchni żelu około 200 mikrolitrami. Następnie wystaw powierzchnię żelu na działanie światła UV w piecu sieciującym UV.

Po wystawieniu na działanie promieni UV zanurz szkiełka nakrywkowe w zlewce ze świeżą, podwójnie destylowaną wodą. Usunąć roztwór z powierzchni żelu za pomocą wirówki do szkiełek nakrywkowych. Następnie umieść param w pojemniku na szalkę Petriego przez zwierzę domowe 50 mikrolitrów zimnej fibronektyny na param.

Odwróć szkiełko nakrywkowe i umieść stronę z żelem na wierzchu fibronektyny. Pozwól, aby szkiełka nakrywkowe reagowały w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Po inkubacji w sterylnej hodowli tkankowej wentylowany kaptur.

Umieścić szkiełka nakrywkowe w sześciocentymetrowych szalkach do hodowli tkankowych zawierających PBS, aby pokryć szkiełka nakrywkowe. Szkiełka nakrywkowe należy dokładnie umyć, kilkakrotnie wymieniając PBS w sterylnych warunkach po praniu. Sterylizuj szkiełka nakrywkowe przez obróbkę UV przez 30 minut.

Następnie inkubować szkiełka nakrywkowe w pożywce komórkowej przez 30 do 45 minut przed posiewem komórek. Następny ładowacz, szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 30 milimetrów na górnym uchwycie szkiełka nakrywkowego komory obrazowania konfokalnego Warner Instruments za pomocą smaru próżniowego, aby utrzymać szkiełko nakrywkowe na miejscu. Umieść gumową uszczelkę tworzącą komorę na wierzchu szkiełka nakrywkowego, umożliwiając dostęp zarówno do rurki polietylenowej, jak i wlotowej.

Pozwoli to na zachowanie odstępu od 150 do 1000 mikronów między górnym szkiełkiem nakrywkowym a pokrytym żelem szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 na 40 milimetrów, w zależności od rozmiaru zastosowanej uszczelki. Następnie załaduj strzykawki zawierające media z ciepłymi komórkami na rurkę wlotową za pomocą zestawu złączy i sprawdź, czy media przepływają przez rurkę i na górną szkiełko pokrywy. Nałóż smar próżniowy na podstawę komory i załaduj pokrytą żelem komórkę z poślizgu nakrywkowego o wymiarach 22 na 40 milimetrów do góry.

Nałóż ciepły nośnik na komórki. Umieść górny uchwyt szkiełka nakrywkowego na podstawie komory tak, aby uszczelki komory oddzielały go od szkiełka nakrywkowego pokrytego żelem. Upewnij się, że kołki ustalające w podstawie komory znajdują się w otworach ustalających w górnej szkiełku pokrywy.

Przyłóż płytę dociskową do podstawy komory i użyj klucza do płyty dociskowej, aby przykręcić i zabezpieczyć płytę dociskową. Sprawdź przepływ mediów przez rurkę i komorę, aby monitorować wszelkie potencjalne nieszczelności w komorze. I aby wyeliminować wszelkie strefy wolne od mediów na powierzchni komórki.

Zastosuj konfokalną komorę obrazowania do adaptera stolika umieszczonego w uchwycie mikroskopu do obrazowania obrazu, znakowanego fluorescencyjnie białka i kulek fluorescencyjnych osadzonych w podłożu żelowym na konfokalnym mikroskopie fluorescencyjnym, aby uzyskać obraz nienapiętej pozycji kulki w perfuse żelowym. Potyka się, aby odłączyć zrosty komórkowe od żelu i zrobić zdjęcie koralików fluorescencyjnych w tym samym polu obrazowania, w którym odważono się umieścić piwnice. Jeśli protokół jest przestrzegany prawidłowo, powierzchnia żelu będzie stosunkowo płaska i gładka, z równomiernie osadzonymi kulkami fluorescencyjnymi.

ECM można również uwidocznić za pomocą immunofluorescencji fibronektyny. W przypadku pomiaru skurczu żelu w miejscu zrostów ogniskowych, obrazowanie żelu i komórek należy wykonać w konfokalnej płaszczyźnie optycznej zrostów ogniskowych. Tutaj zrosty ogniskowe są wizualizowane w eksperymencie siły przyciągania w ludzkim kostniakomięsaku lub komórce U2 OS oznaczonej GFP pxi.

Skurcz żelu można uwidocznić poprzez przemieszczenie osadzonych kulek fluorescencyjnych Leżących pod zrostami ogniskowymi. Porównanie odkształconych kulek w kolorze zielonym i nienapiętych pozycji kulek w kolorze czerwonym pozwala na ilościowe określenie przemieszczenia substratu żelu pod wpływem skurczu, oto reprezentatywny wynik rozprzestrzeniania się komórki, która odrywa się od powierzchni żelu przez trypsynę. Oto reprezentatywny wynik przy porównaniu pozycji ściegu napiętego i nienapiętego.

Zastosowanie zaawansowanych algorytmów obliczeniowych może dać naprężenia trakcyjne związane z przemieszczeniem ściegu i modułem sprężystości żeli. Naprężenia te są tutaj wizualizowane za pomocą mapy skali ciepła i wektorów, gdzie cieplejsze kolory na mapie ciepła i większe strzałki oznaczają silniejsze siły. Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać zgodne matryce do pomiaru skurczu komórek podczas wykonywania tej procedury.

Ważne jest, aby planować z wyprzedzeniem, aby kroki, w których liczy się czas, można było wykonać szybko. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.