Name: Przygotowanie matryc skargowych do ilościowego określania skurczu komórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Naucz się przygotowywać podatne matryce z poliakrylamidu do pomiaru skurczu komórkowego metodą mikroskopii sił trakcyjnych. Technika ta pozwala ilościowo określić siły generowane przez komórki w odpowiedzi na sztywność macierzy pozakomórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy laboratorium Ulricha Schwarza za oprogramowanie do śledzenia obliczeniowego wykorzystane w kwantyfikacji komórkowych sił trakcyjnych (Sabass et al., 2008). Praca ta była wspierana przez Burroughs Wellcome Career Award oraz NIH Director's Pioneer Award (DP10D00354) dla M.L. Gardela oraz Medical Scientist National Research Service Award (5 T32 GM07281) dla S.P. Wintera.

<ol><li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+compliance+versus+ligand+in+cell+on+gel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses.</a> Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).</li>
<li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+the+spread+area%2C+contractility%2C+and+migration+of+balb%2Fc+3T3+fibroblasts+adhered+to+fibronectin-+and+RGD-modified+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata.</a> Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+mechanics+of+endothelial+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading.</a> Biophys J. 89, 676-689 (2005).</li>
<li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li>
<li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2Forganelle+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisana tutaj procedura przygotowania eksperymentu mikroskopii sił trakcyjnych (TFM), wraz z implementacją obliczeniowych rutyn śledzenia (Sabass et al., 2008), umożliwia kwantyfikację sił komórkowych z rozdzielczością przestrzenną w skali mikronowej. Aby zoptymalizować protokół eksperymentalny, kluczowe jest utworzenie czystego i jednorodnego podłoża żelowego z równomierną powłoką ligandu ECM. Poniżej omawiamy potencjalne problemy:

Nierównomierna powierzchnia żelu lub rozdarcia:...

<table><tbody><tr><td>3-aminopropyltrimetoksysilan</td><td>Aldrich</td><td>28, 177-8</td><td></td></tr><tr><td>40% akrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% bisakryloamidu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 150-20</td><td></td></tr><tr><td>Wodoronadtiosiarczan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>fluorescencyjne mikrosfery 40 nm</td><td>Invitrogen</td><td>F8789</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Komora do obrazowania konfokalnego (RC-30)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0320</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do szkiełek nakrywkowych</td><td>Własnej roboty</td><td>ND</td><td></td></tr><tr><td>Lampa ultrafioletowa CL1000</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0228-01</td><td></td></tr><tr><td>Stojak ze stali nierdzewnej</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>72239-04</td><td></td></tr><tr><td>acryloyl-X, SE (kwas 6-((akryloilo)amino)heksanowy)</td><td>Invitrogen</td><td>A-20770</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazyna hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225819</td><td></td></tr><tr><td>Metajodynian sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20504</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Fibonektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Kryszalki (#1,5)</td><td>Corning</td><td>2940&amp;#8208;224</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>Produkty SOPUS</td><td>www.rainx.com</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Acros Organics</td><td>64-19-7</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

Regulacja adhezji komórkowej do macierzy pozakomórkowej (ECM) jest niezbędna dla migracji komórek i przebudowy ECM. Adhezje ogniskowe to makromolekularne kompleksy, które łączą kurczliwy cytoszkielet z F-aktyny z ECM. Połączenie to umożliwia przekazywanie wewnątrzkomórkowych sił mechanicznych przez błonę komórkową do znajdującego się pod nią podłoża. Niedawne badania wykazały, że właściwości mechaniczne ECM regulują morfologię adhezji ogniskowych i F-aktyny, a także liczne procesy fizjologiczne, w tym różnicowanie, podział, proliferację i migrację komórek. W związku z tym stosowanie podłoży do hodowli komórkowej stało się coraz bardziej rozpowszechnioną metodą precyzyjnego kontrolowania i modulowania właściwości mechanicznych ECM.
Aby ilościowo określić siły trakcyjne w adhezjach ogniskowych w komórce przylegałej, stosuje się podatne podłoża w połączeniu z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości oraz technikami obliczeniowymi w metodzie zwanej mikroskopią sił trakcyjnych (TFM). Technika ta opiera się na pomiarach lokalnej wartości i kierunku deformacji podłoża wywołanych skurczem komórkowym. W połączeniu z wysokorozdzielczą mikroskopią fluorescencyjną białek znakowanych fluorescencyjnie, możliwe jest skorelowanie organizacji i przebudowy cytoszkieletu z siłami trakcyjnymi.
W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół eksperymentalny przygotowania dwuwymiarowych, podatnych macierzy w celu stworzenia podłoża do hodowli komórkowej o dobrze scharakteryzowanej, regulowanej sztywności mechanicznej, odpowiedniego do pomiaru skurczu komórkowego. Protokoły te obejmują wytwarzanie hydrożeli poliakryloamidowych, powlekanie takich żeli białkami ECM, wysiew komórek na żele oraz wysokorozdzielczą mikroskopię konfokalną z wykorzystaniem komory perfuzyjnej. Dodatkowo przedstawiamy reprezentatywną próbkę danych obrazujących lokalizację i wielkość sił komórkowych przy użyciu cytowanych protokołów TFM.

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Regulacja adhezji komórkowej do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest niezbędna dla migracji komórek oraz przebudowy ECM. Adhezje ogniskowe to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie podatnych macierzy do modulowania i kwantyfikowania skurczu komórkowego. Osiąga się to najpierw poprzez aktywację szkiełka podstawowego, aby umożliwić zakotwiczenie macierzy. Drugim krokiem procedury jest polimeryzacja żelu poliakryloamidowego na aktywowanym szkiełku podstawowym.Trzecim krokiem procedury jest wysianie komórek na żel i pozostawienie ich do przywiernięcia. Ostatnim etapem procedury jest obrazowanie żelu w celu wygenerowania danych, które zostaną poddane analizie zgodnie z protokołami mikroskopii sił trakcyjnych. W efekcie można uzyskać wyniki pokazujące siły trakcyjne wywierane przez komórki na macierz, mierzone za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych.Witajcie, jestem Yvonne Eons z laboratorium Margaret ELL w Katedrze Fizyki oraz Instytucie Dynamiki Biofizycznej na Uniwersytecie w Chicago. Jestem Steven Winter, również z laboratorium Guard. Dzisiaj chcielibyśmy zaprezentować procedurę przygotowania podatnych matryc do pomiaru skurczu komórkowego.W naszym laboratorium stosujemy te procedury do badania kurczliwych sieci aktynowo-miozynowych. Zatem zacznijmy. Przed aktywacją szkiełek podstawowych, należy wcześniej przygot

preparation-of-complaint-matrices-for-quantifying-cellular-contraction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przygotowanie macierzy skarg w celu ilościowego określenia kurczenia się komórek

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Ten film opisuje pomiar skurczu komórek mięśni gładkich aorty (SMC) za pomocą wykrywania impedancji elektrycznej komórki-substratu (ECIS). ECIS mierzy lokomocję komórek i jest wiarygodną metodą pomiaru skurczów.

Pomiar skurczu SMC in vitro: nieinwazyjna metoda oceny skurczu komórek mięśni gładkich za pomocą wykrywania impedancji elektrycznego podłoża ogniwa

Ten protokół opisuje użycie mikroskalowych wsporników krzemowych jako giętkich powierzchni hodowlanych do pomiaru kurczliwości komórek mięśniowych in vitro. Skurcz komórkowy powoduje zginanie wspornika, które można zmierzyć, zarejestrować i przekształcić w odczyty siły, zapewniając nieinwazyjny i skalowalny system pomiaru funkcji skurczu in vitro.

Wykorzystanie mikroskalowych wsporników krzemowych do oceny funkcji kurczliwości komórkowej in vitro

Tutaj opisujemy rozwój i zastosowanie testu skurczu żelu do oceny funkcji skurczu w komórkach mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne.

Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Przedstawiamy protokół oceny elektromechanicznych efektów aktywacji GtACR1 w kardiomiocytach królików. Dostarczamy szczegółowych informacji na temat izolacji komórek, hodowli i transdukcji adenowirusa oraz na temat eksperymentów funkcjonalnych z użyciem technik patch-clamp i włókna węglowego.

Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Ten artykuł opisuje metodę opartą na hodowli eksplantatów do izolacji i hodowli pierwotnych, specyficznych dla pacjenta ludzkich komórek mięśni gładkich aorty i fibroblastów skóry. Ponadto przedstawiono nowatorską metodę pomiaru skurczu komórek i późniejszej analizy, która może być wykorzystana do badania specyficznych dla pacjenta różnic w tych komórkach.

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Ta praca przedstawia elastyczny protokół wykorzystania technologii fluorescencyjnie znakowanych elastomerowych powierzchni skurczowych (FLECS) w formacie mikrostudzienki do uproszczonej, bezobsługowej kwantyfikacji sił skurczu pojedynczej komórki na podstawie wizualizacji przemieszczeń mikrowzorów białek fluorescencyjnych.

Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

Analiza zmian w funkcji skurczowej i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC ma ogromne znaczenie dla nieklinicznego rozwoju leków. Hybrydowy system analizy komórek z 96 dołkami analizuje oba parametry w czasie rzeczywistym i w sposób fizjologiczny, zapewniając wiarygodne wyniki istotne dla człowieka, niezbędne do bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych.

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Ten protokół opisuje, jak mierzyć kurczliwość u pierwotnych kardiomiocytów dorosłych ludzi z serc dawców za pomocą systemu MyoBLAZER, niezawodnej platformy do oceny zmian kurczliwości wywołanych lekiem podczas rozwoju przedklinicznego.

Pomiar kurczliwości serca w izolowanych kardiomiocytach pierwotnych u dorosłych ludzi

Naucz się przygotowywać podatne matryce z poliakrylamidu do pomiaru skurczu komórkowego metodą mikroskopii sił trakcyjnych. Technika ta pozwala ilościowo określić siły generowane przez komórki w odpowiedzi na sztywność macierzy pozakomórkowej.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Przeglądaj więcej filmów