Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie podatnych macierzy do modulowania i ilościowego określania skurczu komórkowego. Osiąga się to poprzez wstępną aktywację szkiełka nakrywki, aby umożliwić przytwierdzenie macierzy. Drugim krokiem procedury jest polimeryzacja żelu poliakrylamidowego na aktywowanej szklance nakrywkowej.

Trzecim krokiem procedury jest wysianie komórek na żel i umożliwienie im adhezji. Ostatnim etapem procedury jest obrazowanie żelu w celu wygenerowania danych, które zostaną poddane analizie zgodnie z protokołami mikroskopii sił trakcyjnych. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, że komórki wywierają siły trakcyjne na macierz, co jest obrazowane za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych.

Witajcie, jestem Yvonne Eons z laboratorium Margaret ELL w Katedrze Fizyki oraz Instytucie Dynamiki Biofizycznej na Uniwersytecie w Chicago. Jestem Steven Winter, również z laboratorium Guard. Chcielibyśmy zaprezentować Państwu procedurę przygotowania podatnych macierzy do pomiaru skurczu komórkowego.

W naszym laboratorium stosujemy te procedury do badania kurczliwych sieci aktynowo-miozynowych. Zacznijmy zatem. Przed aktywacją szkiełek podstawowych należy wcześniej przygotować kilka szkiełek o wymiarach 22 by 40 mm i grubości nr 1.5.

Opłucz w 70% etanolu, umieszczając szkiełka nakrywkowe w stojaku ze stali nierdzewnej w taki sposób, aby były od siebie oddzielone i nie stykały się. Pracując w dygestorium chemicznym, przygotuj 2% roztwór three or minor profile trimeth w izopropanolu w kwadratowym szklanym naczyniu. Użyj szklanej pipety Pasteura, aby dodać three or minoro profile.

Ze względu na reaktywność z tworzywem sztucznym, całkowicie zanurz szkiełka nakrywki w tym roztworze i inkubuj przez 10 minut, mieszając na mieszadle magnetycznym w dygestorium. Po namoczeniu szkiełek nakrywki, przemyj je, zanurzając w wodzie dwukrotnie destylowanej. Wymień wodę czterokrotnie, kończąc na ostatniej wymianie.

Pozostaw szkiełka nakrywki na 10 minut w celu namoczenia, mieszając zawiesinę. Następnie wysusz szkiełka w inkubatorze w temperaturze około 37°C przez 10 minut. Po wysuszeniu pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.

Zanurz szkiełka nakrywki w 1% roztworze glutaraldehydu w wodzie dwukrotnie destylowanej. Proces należy przeprowadzić w szklanym naczyniu kwadratowym na mieszalce magnetycznej przez 30 minut. Należy upewnić się, że naczynie jest czyste.

W przeciwnym razie roztwór może po pewnym czasie stać się mętny. Przepłucz szkiełka nakrywkowe, trzykrotnie wymieniając wodę dwukrotnie destylowaną, przy czym każda wymiana powinna trwać 10 minut z mieszaniem. Następnie przykryj szkiełka nakrywkowe folią aluminiową, aby zapobiec osiadaniu kurzu, i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.

Po wyschnięciu należy przechowywać szkiełka nakrywki w suchym miejscu, z dala od kurzu, przez maksymalnie dwa miesiące. Aby przygotować żel poliakrylamidowy (PAA), w pierwszej kolejności należy sporządzić roztwory zapasowe akrylamidu i bis-akrylamidu. Mieszaninę akrylamidu przygotowuje się z 40% akrylamidu i 2% bis-akrylamidu zgodnie z opisem w protokole RI.

Odgazuj roztwór akryloamidu w komorze próżniowej przez 20 minut. Pozwala to na usunięcie tlenu z żelu, co zapobiega polimeryzacji. W międzyczasie przygotuj 10% roztwór nadsiarczanu amonu lub roztwór APS.

Następnie przetrzyj szkiełka przedmiotowe o wymiarach 1x3 cale chusteczkami Rain X, aby powierzchnia szkiełka stała się hydrofobowa. Usuń wszelki kurz za pomocą chusteczki Kim wipe, aby zapewnić gładką powierzchnię żelu. Przykryj szkiełko folią aluminiową i odstaw.

Następnie wyjmij roztwór akryloamidu z komory próżniowej i dodaj koraliki fluorescencyjne. Aby rozpocząć polimeryzację żelu, dodaj 0,75 µL TM E oraz 2,5 µL 10%a PS. Krótko wymieszaj roztwór, pipetując go w górę i w dół. Następnie nanieś od 10 do 12 µL roztworu akryloamidu na wcześniej przygotowane hydrofobowe szkiełko mikroskopowe.

Umieść aktywowane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 by 40 milimetrów na kropli. Roztwór żelu powinien pokryć całe szkiełko nakrywkowe. Wygładź wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą pojawić się w roztworze.

Pozostaw roztwór żelu do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez około 10 minut. Po polimeryzacji żel oddzieli się od krawędzi szkiełka nakrywki. Za pomocą precyzyjnej końcówki pęsety ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywkowe wraz z przytwierdzonym do niego żelem z powierzchni preparatu.

Zanurz żel w czalce Petriego zawierającej wodę dwukrotnie destylowaną, aby utrzymać nawodnioną powierzchnię żelu w celu sieciowania białek macierzy pozakomórkowej (ECM) z żelem. Najpierw przygotuj 40 µL aliquoty robocze SULF san par, rozpuszczając proszek SULF san par w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO). Następnie usuń wodę dwukrotnie destylowaną z powierzchni żelu, używając krótko wirówki do szkiełek nakrywkowych.

Należy dopilnować, aby żel nie wyschnął bezpośrednio przed użyciem. Alikwoty sulfur sampa w DMSO należy rozcieńczyć w wodzie dwukrotnie destylowanej i nanieść około 200 µL na środek powierzchni żelu. Następnie powierzchnię żelu należy naświetlić światłem UV w urządzeniu do sieciowania UV (UV crosslinker).

Po ekspozycji na UV zanurz szkiełka nakrywkowe w zlewce ze świeżą wodą podwójnie destylowaną. Usuń wszelkie pozostałości roztworu z powierzchni żelu za pomocą wirówki do szkiełek nakrywkowych. Następnie umieść param w naczyniu typu szalka Petriego i nanieś 50 µL zimnej fibronektyny na param.

Odwróć szkiełko nakrywkowe i umieść stronę z żelem na fibronektynie. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do reakcji w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin lub w temperaturze 4 °C przez noc. Inkubację przeprowadź w sterylnej, wentylowanej komorze do hodowli tkanek.

Umieść szkiełka podstawowe w sześciocentymetrowych naczyniach do hodowli tkankowej zawierających PBS w celu ich pokrycia. Po przemyciu dokładnie wypłucz szkiełka podstawowe, kilkakrotnie wymieniając PBS w warunkach sterylnych. Sterylizuj szkiełka podstawowe za pomocą promieniowania UV przez 30 minut.

Następnie inkubuj szkiełka nakrywki w pożywce komórkowej przez 30 do 45 minut przed wysiewaniem komórek. W kolejnym kroku umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 by 30 milimetrów w górnym uchwycie na szkiełko nakrywkowe komory do obrazowania konfokalnego firmy Warner Instruments, używając smaru próżniowego, aby utrzymać szkiełko na miejscu. Na szkiełku nakrywkowym umieść gumową uszczelkę tworzącą komorę, zapewniając dostęp do polietylenowych rurek wlotowych i wylotowych.

Pozwoli to na uzyskanie odstępu od 150 do 1000 mikronów pomiędzy górną lamellą a pokrytą żelem lamellą o wymiarach 22 by 40 milimetrów, w zależności od rozmiaru zastosowanej uszczelki. Następnie należy załadować strzykawki zawierające ciepłą pożywkę komórkową do przewodów wlotowych za pomocą zestawu złączy i sprawdzić, czy pożywka przepływa przez przewody na górną lamellę. Nanieść smar próżniowy na podstawę komory i włożyć pokrytą żelem lamellę o wymiarach 22 by 40 milimetrów stroną z komórkami do góry.

Nanieś podgrzaną pożywkę na komórki. Umieść górny uchwyt szkiełka nakrywkowego na podstawie komory, tak aby uszczelki komory oddzielały go od pokrytego żelem szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że piny pozycjonujące w podstawie komory znajdują się w otworach pozycjonujących w górnym szkiełku nakrywkowym.

Przystaw płytkę dociskową do podstawy komory, a następnie za pomocą klucza do płytki dociskowej wkręć i zabezpiecz płytkę. Sprawdź przepływ medium przez rurkę i komorę, aby monitorować ewentualne nieszczelności wewnątrz komory oraz wyeliminować strefy wolne od medium na powierzchni komórek.

Przymocuj komorę do obrazowania konfokalnego do adaptera stolika znajdującego się w uchwycie mikroskopu, aby obrazować białko znakowane fluorescencyjnie oraz kulki fluorescencyjne zatopione w podłożu żelowym za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego, w celu uzyskania obrazu pozycji kulek bez odkształceń wewnątrz przepływowego żelu. Wykonaj czynności w celu odseparowania adhezji komórkowych od żelu i wykonaj zdjęcie kulek fluorescencyjnych w tym samym polu widzenia, w którym znajdują się komórki. Przy prawidłowym przeprowadzeniu protokołu powierzchnia żelu będzie stosunkowo płaska i gładka, z równomiernie rozłożonymi w całej objętości kulkami fluorescencyjnymi.

ECM można również zwizualizować za pomocą immunofluorescencjiy fibonektyny. W przypadku pomiaru kurczenia się żelu w miejscu adhezji ogniskowych, obrazowanie żelu i komórek powinno być przeprowadzone w konfokalnej płaszczyźnie optycznej adhezji ogniskowych. W niniejszym przypadku adhezje ogniskowe są wizualizowane w eksperymencie siły przyciągania w ludzkich komórkach osteosarcoma lub U2 OS znakowanych GFP pxi.

Kurczenie się żelu można zwizualizować poprzez przemieszczenie zatopionych kulek fluorescencyjnych znajdujących się pod adhezjami ogniskowymi. Porównanie pozycji kulek odkształconych (zaznaczonych na zielono) i nieodkształconych (zaznaczonych na czerwono) pozwala na ilościowe określenie przemieszczenia podłoża żelowego podczas kurczenia się; poniżej przedstawiono reprezentatywny wynik dla rozpostartej komórki, która zostaje oddzielona od powierzchni żelu za pomocą trypsyny. Poniżej znajduje się reprezentatywny wynik porównania pozycji kulek odkształconych i nieodkształconych.

Zastosowanie zaawansowanych algorytmów obliczeniowych pozwala na wyznaczenie naprężeń ścinających związanych z przemieszczeniem kulek oraz modułu sprężystości żeli. Naprężenia te przedstawiono tutaj za pomocą mapy cieplnej i wektorów, gdzie cieplejsze kolory na mapie oraz większe strzałki oznaczają silniejsze oddziaływania. W ramach tej procedury pokazaliśmy, jak przygotować podatne macierze do pomiaru skurczu komórkowego.

Ważne jest odpowiednie zaplanowanie pracy, aby kroki wrażliwe na czas można było przeprowadzić sprawnie. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.