Name: Przygotowanie matryc skargowych do ilościowego określania skurczu komórkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: Naucz się przygotowywać podatne matryce z poliakrylamidu do pomiaru skurczu komórkowego metodą mikroskopii sił trakcyjnych. Technika ta pozwala ilościowo określić siły generowane przez komórki w odpowiedzi na sztywność macierzy pozakomórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy laboratorium Ulricha Schwarza za oprogramowanie do śledzenia obliczeniowego wykorzystane w kwantyfikacji komórkowych sił trakcyjnych (Sabass et al., 2008). Praca ta była wspierana przez Burroughs Wellcome Career Award oraz NIH Director's Pioneer Award (DP10D00354) dla M.L. Gardela oraz Medical Scientist National Research Service Award (5 T32 GM07281) dla S.P. Wintera.

<ol><li>Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamid+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays.</a> Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+compliance+versus+ligand+in+cell+on+gel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Substrate compliance versus ligand in cell on gel responses.</a> Biophys J. 86 ((1 Pt 1)), 617-628 (2004).</li>
<li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> J Cell Biol. 183, 999-1005 (2008).</li>
<li>Rajagopalan, P., Marganski, W. A., Brown, X. Q., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+the+spread+area%2C+contractility%2C+and+migration+of+balb%2Fc+3T3+fibroblasts+adhered+to+fibronectin-+and+RGD-modified+substrata%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata.</a> Biophys J. 87 (4), 2818-2827 (2004).</li>
<li>Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+and+mechanics+of+endothelial+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The dynamics and mechanics of endothelial cell spreading.</a> Biophys J. 89, 676-689 (2005).</li>
<li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> J. Phys: Condensed Matter. 22, 194104-194114 (2010).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophys J. 94, 207-220 (2008).</li>
<li>Yeung, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+on+cell+morphology%2C+cytoskeletal+structure%2C+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2Forganelle+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule/organelle motility assays.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 13.1.1-13.1.21 (1998).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Opisana tutaj procedura przygotowania eksperymentu mikroskopii sił trakcyjnych (TFM), wraz z implementacją obliczeniowych rutyn śledzenia (Sabass et al., 2008), umożliwia kwantyfikację sił komórkowych z rozdzielczością przestrzenną w skali mikronowej. Aby zoptymalizować protokół eksperymentalny, kluczowe jest utworzenie czystego i jednorodnego podłoża żelowego z równomierną powłoką ligandu ECM. Poniżej omawiamy potencjalne problemy:

Nierównomierna powierzchnia żelu lub rozdarcia:...

<table><tbody><tr><td>3-aminopropyltrimetoksysilan</td><td>Aldrich</td><td>28, 177-8</td><td></td></tr><tr><td>40% akrylamid</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% bisakryloamidu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1404</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 150-20</td><td></td></tr><tr><td>Wodoronadtiosiarczan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179</td><td></td></tr><tr><td>fluorescencyjne mikrosfery 40 nm</td><td>Invitrogen</td><td>F8789</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Komora do obrazowania konfokalnego (RC-30)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0320</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do szkiełek nakrywkowych</td><td>Własnej roboty</td><td>ND</td><td></td></tr><tr><td>Lampa ultrafioletowa CL1000</td><td>UVP Inc.</td><td>95-0228-01</td><td></td></tr><tr><td>Stojak ze stali nierdzewnej</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>72239-04</td><td></td></tr><tr><td>acryloyl-X, SE (kwas 6-((akryloilo)amino)heksanowy)</td><td>Invitrogen</td><td>A-20770</td><td></td></tr><tr><td>Hydrazyna hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>225819</td><td></td></tr><tr><td>Metajodynian sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>20504</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Fibonektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Kryszalki (#1,5)</td><td>Corning</td><td>2940&amp;#8208;224</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td>Produkty SOPUS</td><td>www.rainx.com</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Acros Organics</td><td>64-19-7</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

Regulacja adhezji komórkowej do macierzy pozakomórkowej (ECM) jest niezbędna dla migracji komórek i przebudowy ECM. Adhezje ogniskowe to makromolekularne kompleksy, które łączą kurczliwy cytoszkielet z F-aktyny z ECM. Połączenie to umożliwia przekazywanie wewnątrzkomórkowych sił mechanicznych przez błonę komórkową do znajdującego się pod nią podłoża. Niedawne badania wykazały, że właściwości mechaniczne ECM regulują morfologię adhezji ogniskowych i F-aktyny, a także liczne procesy fizjologiczne, w tym różnicowanie, podział, proliferację i migrację komórek. W związku z tym stosowanie podłoży do hodowli komórkowej stało się coraz bardziej rozpowszechnioną metodą precyzyjnego kontrolowania i modulowania właściwości mechanicznych ECM.
Aby ilościowo określić siły trakcyjne w adhezjach ogniskowych w komórce przylegałej, stosuje się podatne podłoża w połączeniu z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości oraz technikami obliczeniowymi w metodzie zwanej mikroskopią sił trakcyjnych (TFM). Technika ta opiera się na pomiarach lokalnej wartości i kierunku deformacji podłoża wywołanych skurczem komórkowym. W połączeniu z wysokorozdzielczą mikroskopią fluorescencyjną białek znakowanych fluorescencyjnie, możliwe jest skorelowanie organizacji i przebudowy cytoszkieletu z siłami trakcyjnymi.
W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół eksperymentalny przygotowania dwuwymiarowych, podatnych macierzy w celu stworzenia podłoża do hodowli komórkowej o dobrze scharakteryzowanej, regulowanej sztywności mechanicznej, odpowiedniego do pomiaru skurczu komórkowego. Protokoły te obejmują wytwarzanie hydrożeli poliakryloamidowych, powlekanie takich żeli białkami ECM, wysiew komórek na żele oraz wysokorozdzielczą mikroskopię konfokalną z wykorzystaniem komory perfuzyjnej. Dodatkowo przedstawiamy reprezentatywną próbkę danych obrazujących lokalizację i wielkość sił komórkowych przy użyciu cytowanych protokołów TFM.

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Regulacja adhezji komórkowej do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) jest niezbędna dla migracji komórek oraz przebudowy ECM. Adhezje ogniskowe to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie podatnych macierzy do modulowania i kwantyfikowania skurczu komórkowego. Osiąga się to najpierw poprzez aktywację szkiełka podstawowego, aby umożliwić zakotwiczenie macierzy. Drugim krokiem procedury jest polimeryzacja żelu poliakryloamidowego na aktywowanym szkiełku podstawowym.Trzecim krokiem procedury jest wysianie komórek na żel i pozostawienie ich do przywiernięcia. Ostatnim etapem procedury jest obrazowanie żelu w celu wygenerowania danych, które zostaną poddane analizie zgodnie z protokołami mikroskopii sił trakcyjnych. W efekcie można uzyskać wyniki pokazujące siły trakcyjne wywierane przez komórki na macierz, mierzone za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych.Witajcie, jestem Yvonne Eons z laboratorium Margaret ELL w Katedrze Fizyki oraz Instytucie Dynamiki Biofizycznej na Uniwersytecie w Chicago. Jestem Steven Winter, również z laboratorium Guard. Dzisiaj chcielibyśmy zaprezentować procedurę przygotowania podatnych matryc do pomiaru skurczu komórkowego.W naszym laboratorium stosujemy te procedury do badania kurczliwych sieci aktynowo-miozynowych. Zatem zacznijmy. Przed aktywacją szkiełek podstawowych, należy wcześniej przygotować kilka szkiełek o wymiarach 22 by 40 mm i grubości nr 1.5.Przepłucz w 70% etanolu w stojaku ze stali nierdzewnej w taki sposób, aby szkiełka nakrywkowe były oddzielone od siebie i się nie dotykały. Pracując w dygestorium, przygotuj 2% roztwór three or minor profile trimeth w izopropanolu w kwadratowym naczyniu szklanym. Użyj szklanej pipety Pasteura, aby dodać three or minoro profile.Ze względu na reaktywność trimetoksy z tworzywami sztucznymi, całkowicie zanurz szkiełka nakrywkowe w tym roztworze i inkubuj przez 10 minut, mieszając na mieszadle magnetycznym w dygestorium. Po namoczeniu szkiełka nakrywkowe przemyj, zanurzając je w wodzie dwukrotnie destylowanej. Wymień wodę czterokrotnie; po ostatniej wymianie zakończ proces.Pozostaw do namaczania na 10 minut przy ciągłym mieszaniu. Następnie wysusz szkiełka nakrywkowe w inkubatorze w temperaturze około 37 °C przez 10 minut. Po wysuszeniu pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.Zanurz szkiełka nakrywkowe w 1% roztworze glutaraldehydu w wodzie podwójnie destylowanej. Proces należy przeprowadzić w szklanym naczyniu kwadratowym na mieszadle magnetycznym przez 30 minut. Należy upewnić się, że użyte naczynie jest czyste.W przeciwnym razie roztwór może później stać się mętny. Przepłucz szkiełka nakrywki, wymieniając trzykrotnie wodę dwukrotnie destylowaną, przez 10 minut przy każdym płukaniu z mieszaniem. Następnie przykryj szkiełka nakrywki folią aluminiową, aby zapobiec osadzaniu się kurzu, i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.Po wyschnięciu przechowywać szkiełka nakrywkowe w suchym miejscu, z dala od kurzu, przez okres do dwóch miesięcy. Aby przygotować żel poliakrylamidowy lub PAA, należy najpierw przygotować roztwory stokowe akrylamidu i bis-akrylamidu. Mieszankę akrylamidową przygotowuje się z 40% akrylamidu i 2% bis-akrylamidu zgodnie z opisem w protokole RI.Odgazuj roztwór akryloamidu w komorze próżniowej przez 20 minut. Redukuje to zawartość tlenu w żelu, co zapobiega polimeryzacji. W międzyczasie przygotuj 10% roztwór persiarczanu amonu lub roztwór PS.Następnie przetrzyj szkiełka przedmiotowe o wymiarach jeden na trzy cale chusteczkami Rain X, aby nadać powierzchni szkła właściwości hydrofobowe. Usuń wszelki kurz za pomocą chusteczki Kim wipe, aby zapewnić gładką powierzchnię żelu. Przykryj szkiełko folią aluminiową i odstaw.Następnie należy wyjąć roztwór akryloamidu z komory próżniowej i dodać paciorki fluorescencyjne. Aby zainicjować polimeryzację żelu, należy dodać 0,75 µL TM E oraz 2,5 µL 10%a PS. Roztwór należy krótko wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Następnie nanosi się od 10 do 12 µL roztworu akryloamidu na wcześniej przygotowane hydrofobowe szkiełko mikroskopowe.Połóż aktywowaną lamellkę o wymiarach 22 by 40 millimeter na kropli. Roztwór żelu powinien pokryć całą powierzchnię lamellki. Wygładź wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą pojawić się w roztworze.Pozostaw roztwór żelu do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez około 10 minut. Po spolimeryzowaniu żel oddzieli się od krawędzi szkiełka zakryjącego. Za pomocą cienkiej końcówki pęsety ostrożnie zdejmij szkiełko zakryjące wraz z przytwierdzonym do niego żelem z powierzchni szkiełka przedmiotowego.Zanurz żel w szalce Petri zawierającej wodę podwójnie destylowaną, aby utrzymać uwodnioną powierzchnię żelu w celu sieciowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) z żelem. Najpierw przygotuj 40 µL alikwoty robocze sulfur san par, rozpuszczając proszek SULF san par w bezwodnym dimetylosulfoksydzie (DMSO). Następnie usuń wodę podwójnie destylowaną z powierzchni żelu, krótko korzystając z wirówki do szkiełek nakrywkowych.Należy zadbać o to, aby żel nie wyschł bezpośrednio przed użyciem. Alikwoty sampa siarkowego w DMSO należy rozcieńczyć w wodzie dwukrotnie destylowanej i nanieść około 200 µL na środek powierzchni żelu. Następnie powierzchnię żelu należy naświetlić światłem UV w urządzeniu do sieciowania UV.Po ekspozycji na promieniowanie UV zanurz szkiełka podstawowe w zlewce ze świeżą wodą dwukrotnie destylowaną. Usuń wszelkie pozostałości roztworu z powierzchni żelu za pomocą wirówki do szkiełek podstawowych. Następnie umieść param w naczyniu typu szalka Petri i nanieś 50 µL zimnej fibronektyny na param.Odwrócić szkiełko nakrywkowe i położyć stronę z żelem na fibronektynie. Pozostawić szkiełka nakrywkowe do reakcji w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin lub w temperaturze 4 °C przez noc. Po inkubacji w sterylnej, wentylowanej komorze do hodowli tkanek.Umieść szkiełka nakrywkowe w sześciocentymetrowych szalkach do hodowli tkankowej zawierających PBS w celu ich pokrycia. Następnie, w warunkach sterylnych, dokładnie przemyj szkiełka nakrywkowe, kilkukrotnie wymieniając PBS. Sterylizuj szkiełka nakrywkowe za pomocą promieniowania UV przez 30 minut.Następnie inkubować szkiełka podstawowe w pożywce komórkowej przez 30 do 45 minut przed wysianiem komórek. W kolejnym kroku załadować szkiełko podstawowe o wymiarach 22 by 30 mm do górnego uchwytu na szkiełko w komorze do obrazowania konfokalnego firmy Warner Instruments, używając smaru próżniowego w celu unieruchomienia szkiełka. Na wierzchu szkiełka podstawowego umieścić gumową uszczelkę formującą komorę, zapewniając dostęp do polietylenowych rurek doprowadzających i odprowadzających ciecz.Umożliwi to uzyskanie odstępu od 150 do 1000 mikronów między górnym szkiełkiem podstawowym a pokrytym żelem szkiełkiem podstawowym o wymiarach 22 na 40 milimetrów, w zależności od rozmiaru zastosowanej uszczelki. Następnie należy załadować strzykawki zawierające podgrzaną pożywkę komórkową do rurki wlotowej za pomocą zestawu złączy i sprawdzić, czy pożywka przepływa przez rurkę na górne szkiełko podstawowe. Nanieść smar próżniowy na podstawę komory i umieścić pokryte żelem szkiełko podstawowe o wymiarach 22 na 40 milimetrów stroną z komórkami do góry.Nanieś ogrzane medium na komórki. Umieść górny uchwyt szkiełka nakrywkowego na podstawie komory, tak aby uszczelki komory oddzielały go od pokrytego żelem szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że piny pozycjonujące w podstawie komory znajdują się w otworach pozycjonujących w górnym szkiełku nakrywkowym.Przyłożyć płytkę dociskową do podstawy komory, a następnie za pomocą klucza do płytki dociskowej wkręcić i zabezpieczyć płytkę dociskową. Sprawdzić przepływ medium przez cewkę i komorę, aby monitorować ewentualne wycieki wewnątrz komory oraz wyeliminować strefy wolne od medium na powierzchni komórek.Zamocuj komorę do obrazowania konfokalnego do adaptera stolika znajdującego się w uchwycie mikroskopu, aby obrazować białko znakowane fluorescencyjnie oraz kuleczki fluorescencyjne zatopione w podłożu żelowym za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego, w celu uzyskania obrazu pozycji kuleczek bez odkształceń wewnątrz przepływającego żelu. Wykonaj kroki w celu odłączenia adhezji komórkowych od żelu i wykonaj obraz kuleczek fluorescencyjnych w tym samym polu widzenia, w którym znajdują się komórki. Przy prawidłowym przeprowadzeniu protokołu powierzchnia żelu będzie stosunkowo płaska i gładka, a kuleczki fluorescencyjne będą równomiernie rozmieszczone w całej jego objętości.Macierz pozakomórkową (ECM) można również zwizualizować za pomocą immunofluorescencji fibronektyny. W przypadku pomiaru kurczenia się żelu w miejscu adhezji ogniskowych, obrazowanie żelu i komórek powinno być przeprowadzone w konfokalnej płaszczyźnie optycznej adhezji ogniskowych. Poniżej przedstawiono wizualizację adhezji ogniskowych w eksperymencie siły przyciągania w ludzkiej komórce osteosarcoma lub U2 OS oznakowanej GFP pxi.Kurczenie się żelu można zwizualizować poprzez przemieszczenie zatopionych w nim kulek fluorescencyjnych znajdujących się pod adhezjami ogniskowymi. Porównanie pozycji kulek poddanych naprężeniom (kolor zielony) oraz kulek nienaprężonych (kolor czerwony) umożliwia ilościowe określenie przemieszczenia podłoża żelowego podczas kurczenia; przedstawiony tutaj jest reprezentatywny wynik dla rozprzestrzenionej komórki, która zostaje oddzielona od powierzchni żelu za pomocą trypsyny. Tutaj znajduje się reprezentatywny wynik porównania pozycji kulek naprężonych i nienaprężonych.Zastosowanie zaawansowanych algorytmów obliczeniowych pozwala na wyznaczenie naprężeń ścinających związanych z przemieszczeniem kulek oraz modułu sprężystości żeli. Naprężenia te są tutaj przedstawione za pomocą mapy cieplnej oraz wektorów, gdzie cieplejsze kolory na mapie i większe strzałki oznaczają silniejsze siły. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak przygotować podatne macierze do pomiaru kontrakcji komórkowej podczas wykonywania tej procedury.Ważne jest, aby zaplanować pracę z wyprzedzeniem, tak aby kroki zależne od czasu można było przeprowadzić szybko. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

preparation-of-complaint-matrices-for-quantifying-cellular-contraction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przygotowanie macierzy skarg w celu ilościowego określenia kurczenia się komórek

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Ten film opisuje pomiar skurczu komórek mięśni gładkich aorty (SMC) za pomocą wykrywania impedancji elektrycznej komórki-substratu (ECIS). ECIS mierzy lokomocję komórek i jest wiarygodną metodą pomiaru skurczów.

Pomiar skurczu SMC in vitro: nieinwazyjna metoda oceny skurczu komórek mięśni gładkich za pomocą wykrywania impedancji elektrycznego podłoża ogniwa

Ten protokół opisuje użycie mikroskalowych wsporników krzemowych jako giętkich powierzchni hodowlanych do pomiaru kurczliwości komórek mięśniowych in vitro. Skurcz komórkowy powoduje zginanie wspornika, które można zmierzyć, zarejestrować i przekształcić w odczyty siły, zapewniając nieinwazyjny i skalowalny system pomiaru funkcji skurczu in vitro.

Wykorzystanie mikroskalowych wsporników krzemowych do oceny funkcji kurczliwości komórkowej in vitro

Tutaj opisujemy rozwój i zastosowanie testu skurczu żelu do oceny funkcji skurczu w komórkach mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne.

Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Przedstawiamy protokół oceny elektromechanicznych efektów aktywacji GtACR1 w kardiomiocytach królików. Dostarczamy szczegółowych informacji na temat izolacji komórek, hodowli i transdukcji adenowirusa oraz na temat eksperymentów funkcjonalnych z użyciem technik patch-clamp i włókna węglowego.

Elektromechaniczna ocena optogenetycznie modulowanej aktywności kardiomiocytów

Ten artykuł opisuje metodę opartą na hodowli eksplantatów do izolacji i hodowli pierwotnych, specyficznych dla pacjenta ludzkich komórek mięśni gładkich aorty i fibroblastów skóry. Ponadto przedstawiono nowatorską metodę pomiaru skurczu komórek i późniejszej analizy, która może być wykorzystana do badania specyficznych dla pacjenta różnic w tych komórkach.

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Ta praca przedstawia elastyczny protokół wykorzystania technologii fluorescencyjnie znakowanych elastomerowych powierzchni skurczowych (FLECS) w formacie mikrostudzienki do uproszczonej, bezobsługowej kwantyfikacji sił skurczu pojedynczej komórki na podstawie wizualizacji przemieszczeń mikrowzorów białek fluorescencyjnych.

Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

Analiza zmian w funkcji skurczowej i integralności komórkowej ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC ma ogromne znaczenie dla nieklinicznego rozwoju leków. Hybrydowy system analizy komórek z 96 dołkami analizuje oba parametry w czasie rzeczywistym i w sposób fizjologiczny, zapewniając wiarygodne wyniki istotne dla człowieka, niezbędne do bezpiecznego przejścia do etapów klinicznych.

Hybrydowy system analizy komórek do oceny zmian strukturalnych i kurczliwych ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC do przedklinicznej oceny ryzyka kardiologicznego

Ten protokół opisuje, jak mierzyć kurczliwość u pierwotnych kardiomiocytów dorosłych ludzi z serc dawców za pomocą systemu MyoBLAZER, niezawodnej platformy do oceny zmian kurczliwości wywołanych lekiem podczas rozwoju przedklinicznego.

Pomiar kurczliwości serca w izolowanych kardiomiocytach pierwotnych u dorosłych ludzi

Naucz się przygotowywać podatne matryce z poliakrylamidu do pomiaru skurczu komórkowego metodą mikroskopii sił trakcyjnych. Technika ta pozwala ilościowo określić siły generowane przez komórki w odpowiedzi na sztywność macierzy pozakomórkowej.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Przeglądaj więcej filmów