Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie podatnych macierzy do modulowania i kwantyfikowania skurczu komórkowego. Osiąga się to najpierw poprzez aktywację szkiełka podstawowego, aby umożliwić zakotwiczenie macierzy. Drugim krokiem procedury jest polimeryzacja żelu poliakryloamidowego na aktywowanym szkiełku podstawowym.

Trzecim krokiem procedury jest wysianie komórek na żel i pozostawienie ich do przywiernięcia. Ostatnim etapem procedury jest obrazowanie żelu w celu wygenerowania danych, które zostaną poddane analizie zgodnie z protokołami mikroskopii sił trakcyjnych. W efekcie można uzyskać wyniki pokazujące siły trakcyjne wywierane przez komórki na macierz, mierzone za pomocą mikroskopii sił trakcyjnych.

Witajcie, jestem Yvonne Eons z laboratorium Margaret ELL w Katedrze Fizyki oraz Instytucie Dynamiki Biofizycznej na Uniwersytecie w Chicago. Jestem Steven Winter, również z laboratorium Guard. Dzisiaj chcielibyśmy zaprezentować procedurę przygotowania podatnych matryc do pomiaru skurczu komórkowego.

W naszym laboratorium stosujemy te procedury do badania kurczliwych sieci aktynowo-miozynowych. Zatem zacznijmy. Przed aktywacją szkiełek podstawowych, należy wcześniej przygotować kilka szkiełek o wymiarach 22 by 40 mm i grubości nr 1.5.

Przepłucz w 70% etanolu w stojaku ze stali nierdzewnej w taki sposób, aby szkiełka nakrywkowe były oddzielone od siebie i się nie dotykały. Pracując w dygestorium, przygotuj 2% roztwór three or minor profile trimeth w izopropanolu w kwadratowym naczyniu szklanym. Użyj szklanej pipety Pasteura, aby dodać three or minoro profile.

Ze względu na reaktywność trimetoksy z tworzywami sztucznymi, całkowicie zanurz szkiełka nakrywkowe w tym roztworze i inkubuj przez 10 minut, mieszając na mieszadle magnetycznym w dygestorium. Po namoczeniu szkiełka nakrywkowe przemyj, zanurzając je w wodzie dwukrotnie destylowanej. Wymień wodę czterokrotnie; po ostatniej wymianie zakończ proces.

Pozostaw do namaczania na 10 minut przy ciągłym mieszaniu. Następnie wysusz szkiełka nakrywkowe w inkubatorze w temperaturze około 37 °C przez 10 minut. Po wysuszeniu pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.

Zanurz szkiełka nakrywkowe w 1% roztworze glutaraldehydu w wodzie podwójnie destylowanej. Proces należy przeprowadzić w szklanym naczyniu kwadratowym na mieszadle magnetycznym przez 30 minut. Należy upewnić się, że użyte naczynie jest czyste.

W przeciwnym razie roztwór może później stać się mętny. Przepłucz szkiełka nakrywki, wymieniając trzykrotnie wodę dwukrotnie destylowaną, przez 10 minut przy każdym płukaniu z mieszaniem. Następnie przykryj szkiełka nakrywki folią aluminiową, aby zapobiec osadzaniu się kurzu, i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.

Po wyschnięciu przechowywać szkiełka nakrywkowe w suchym miejscu, z dala od kurzu, przez okres do dwóch miesięcy. Aby przygotować żel poliakrylamidowy lub PAA, należy najpierw przygotować roztwory stokowe akrylamidu i bis-akrylamidu. Mieszankę akrylamidową przygotowuje się z 40% akrylamidu i 2% bis-akrylamidu zgodnie z opisem w protokole RI.

Odgazuj roztwór akryloamidu w komorze próżniowej przez 20 minut. Redukuje to zawartość tlenu w żelu, co zapobiega polimeryzacji. W międzyczasie przygotuj 10% roztwór persiarczanu amonu lub roztwór PS.

Następnie przetrzyj szkiełka przedmiotowe o wymiarach jeden na trzy cale chusteczkami Rain X, aby nadać powierzchni szkła właściwości hydrofobowe. Usuń wszelki kurz za pomocą chusteczki Kim wipe, aby zapewnić gładką powierzchnię żelu. Przykryj szkiełko folią aluminiową i odstaw.

Następnie należy wyjąć roztwór akryloamidu z komory próżniowej i dodać paciorki fluorescencyjne. Aby zainicjować polimeryzację żelu, należy dodać 0,75 µL TM E oraz 2,5 µL 10%a PS. Roztwór należy krótko wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Następnie nanosi się od 10 do 12 µL roztworu akryloamidu na wcześniej przygotowane hydrofobowe szkiełko mikroskopowe.

Połóż aktywowaną lamellkę o wymiarach 22 by 40 millimeter na kropli. Roztwór żelu powinien pokryć całą powierzchnię lamellki. Wygładź wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogą pojawić się w roztworze.

Pozostaw roztwór żelu do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez około 10 minut. Po spolimeryzowaniu żel oddzieli się od krawędzi szkiełka zakryjącego. Za pomocą cienkiej końcówki pęsety ostrożnie zdejmij szkiełko zakryjące wraz z przytwierdzonym do niego żelem z powierzchni szkiełka przedmiotowego.

Zanurz żel w szalce Petri zawierającej wodę podwójnie destylowaną, aby utrzymać uwodnioną powierzchnię żelu w celu sieciowania białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) z żelem. Najpierw przygotuj 40 µL alikwoty robocze sulfur san par, rozpuszczając proszek SULF san par w bezwodnym dimetylosulfoksydzie (DMSO). Następnie usuń wodę podwójnie destylowaną z powierzchni żelu, krótko korzystając z wirówki do szkiełek nakrywkowych.

Należy zadbać o to, aby żel nie wyschł bezpośrednio przed użyciem. Alikwoty sampa siarkowego w DMSO należy rozcieńczyć w wodzie dwukrotnie destylowanej i nanieść około 200 µL na środek powierzchni żelu. Następnie powierzchnię żelu należy naświetlić światłem UV w urządzeniu do sieciowania UV.

Po ekspozycji na promieniowanie UV zanurz szkiełka podstawowe w zlewce ze świeżą wodą dwukrotnie destylowaną. Usuń wszelkie pozostałości roztworu z powierzchni żelu za pomocą wirówki do szkiełek podstawowych. Następnie umieść param w naczyniu typu szalka Petri i nanieś 50 µL zimnej fibronektyny na param.

Odwrócić szkiełko nakrywkowe i położyć stronę z żelem na fibronektynie. Pozostawić szkiełka nakrywkowe do reakcji w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin lub w temperaturze 4 °C przez noc. Po inkubacji w sterylnej, wentylowanej komorze do hodowli tkanek.

Umieść szkiełka nakrywkowe w sześciocentymetrowych szalkach do hodowli tkankowej zawierających PBS w celu ich pokrycia. Następnie, w warunkach sterylnych, dokładnie przemyj szkiełka nakrywkowe, kilkukrotnie wymieniając PBS. Sterylizuj szkiełka nakrywkowe za pomocą promieniowania UV przez 30 minut.

Następnie inkubować szkiełka podstawowe w pożywce komórkowej przez 30 do 45 minut przed wysianiem komórek. W kolejnym kroku załadować szkiełko podstawowe o wymiarach 22 by 30 mm do górnego uchwytu na szkiełko w komorze do obrazowania konfokalnego firmy Warner Instruments, używając smaru próżniowego w celu unieruchomienia szkiełka. Na wierzchu szkiełka podstawowego umieścić gumową uszczelkę formującą komorę, zapewniając dostęp do polietylenowych rurek doprowadzających i odprowadzających ciecz.

Umożliwi to uzyskanie odstępu od 150 do 1000 mikronów między górnym szkiełkiem podstawowym a pokrytym żelem szkiełkiem podstawowym o wymiarach 22 na 40 milimetrów, w zależności od rozmiaru zastosowanej uszczelki. Następnie należy załadować strzykawki zawierające podgrzaną pożywkę komórkową do rurki wlotowej za pomocą zestawu złączy i sprawdzić, czy pożywka przepływa przez rurkę na górne szkiełko podstawowe. Nanieść smar próżniowy na podstawę komory i umieścić pokryte żelem szkiełko podstawowe o wymiarach 22 na 40 milimetrów stroną z komórkami do góry.

Nanieś ogrzane medium na komórki. Umieść górny uchwyt szkiełka nakrywkowego na podstawie komory, tak aby uszczelki komory oddzielały go od pokrytego żelem szkiełka nakrywkowego. Upewnij się, że piny pozycjonujące w podstawie komory znajdują się w otworach pozycjonujących w górnym szkiełku nakrywkowym.

Przyłożyć płytkę dociskową do podstawy komory, a następnie za pomocą klucza do płytki dociskowej wkręcić i zabezpieczyć płytkę dociskową. Sprawdzić przepływ medium przez cewkę i komorę, aby monitorować ewentualne wycieki wewnątrz komory oraz wyeliminować strefy wolne od medium na powierzchni komórek.

Zamocuj komorę do obrazowania konfokalnego do adaptera stolika znajdującego się w uchwycie mikroskopu, aby obrazować białko znakowane fluorescencyjnie oraz kuleczki fluorescencyjne zatopione w podłożu żelowym za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego, w celu uzyskania obrazu pozycji kuleczek bez odkształceń wewnątrz przepływającego żelu. Wykonaj kroki w celu odłączenia adhezji komórkowych od żelu i wykonaj obraz kuleczek fluorescencyjnych w tym samym polu widzenia, w którym znajdują się komórki. Przy prawidłowym przeprowadzeniu protokołu powierzchnia żelu będzie stosunkowo płaska i gładka, a kuleczki fluorescencyjne będą równomiernie rozmieszczone w całej jego objętości.

Macierz pozakomórkową (ECM) można również zwizualizować za pomocą immunofluorescencji fibronektyny. W przypadku pomiaru kurczenia się żelu w miejscu adhezji ogniskowych, obrazowanie żelu i komórek powinno być przeprowadzone w konfokalnej płaszczyźnie optycznej adhezji ogniskowych. Poniżej przedstawiono wizualizację adhezji ogniskowych w eksperymencie siły przyciągania w ludzkiej komórce osteosarcoma lub U2 OS oznakowanej GFP pxi.

Kurczenie się żelu można zwizualizować poprzez przemieszczenie zatopionych w nim kulek fluorescencyjnych znajdujących się pod adhezjami ogniskowymi. Porównanie pozycji kulek poddanych naprężeniom (kolor zielony) oraz kulek nienaprężonych (kolor czerwony) umożliwia ilościowe określenie przemieszczenia podłoża żelowego podczas kurczenia; przedstawiony tutaj jest reprezentatywny wynik dla rozprzestrzenionej komórki, która zostaje oddzielona od powierzchni żelu za pomocą trypsyny. Tutaj znajduje się reprezentatywny wynik porównania pozycji kulek naprężonych i nienaprężonych.

Zastosowanie zaawansowanych algorytmów obliczeniowych pozwala na wyznaczenie naprężeń ścinających związanych z przemieszczeniem kulek oraz modułu sprężystości żeli. Naprężenia te są tutaj przedstawione za pomocą mapy cieplnej oraz wektorów, gdzie cieplejsze kolory na mapie i większe strzałki oznaczają silniejsze siły. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak przygotować podatne macierze do pomiaru kontrakcji komórkowej podczas wykonywania tej procedury.

Ważne jest, aby zaplanować pracę z wyprzedzeniem, tak aby kroki zależne od czasu można było przeprowadzić szybko. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.