Mikroskopia przyżyciowa mikrokrążenia mózgu myszy przy użyciu zamkniętego okienka czaszkowego

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie mikrokrążenia w mózgu myszy za pomocą mikroskopii przyżyciowej, która umożliwia śledzenie dynamicznych zmian markerów hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu włosowym przez dłuższy czas. Technika ta została opracowana w Instytucie Bioinżynierii La Jolla, gdzie była wykorzystywana do wielu rodzajów badań. Na przykład obserwacja zmian hemodynamicznych w przebiegu zakażenia Plasmodium burgi onca oraz w czasie ekspresji malarii mózgowej.

Osiąga się to poprzez pierwsze wszczepienie przewlekłego okna czaszkowego na dwa tygodnie przed badaniami mikroskopowymi w trybie przyżyciowym. Drugim etapem procedury jest zarejestrowanie ogólnej morfologii okna czaszki za pomocą obrazu cyfrowego o wysokiej rozdzielczości przy małym powiększeniu. Trzecim etapem procedury jest uzyskanie obrazów mikroskopowych przyżyciowych przy użyciu oświetlenia konwencjonalnego i fluorescencyjnego oraz wybór konkretnych miejsc badawczych do pomiarów online średnicy naczynia i prędkości RBC.

Ostatnim etapem zabiegu jest przeprowadzenie przyżyciowej analizy przylegania leukocytów i płytek krwi do naczyń włosowych za pomocą specyficznych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują in vivo, mikrokrążeniowe zmiany w mózgowych modelach lustrzanych fizjologicznych patofizjologicznych lub chorobowych stanów za pomocą mikroskopii przyżyciowej mózgu w celu ustalenia zmian hemodynamicznych związanych z tymi stanami. Główną zaletą tej techniki jest to, że obserwujemy mózg w jego środowisku fizjologicznym bez narażania go na działanie czynników zewnętrznych lub sztucznego podłoża, mikroskopia przyżyciowa w porównaniu z obrazem, rezonansem magnetycznym i angiografią ma rozdzielczość przestrzenną i czasową oraz pozwala nam spojrzeć od poziomu mikroskopowego do mikroskopowego.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu fizjologii i patofizjologii mikrokrążenia mózgowego, takie jak zmiany hemodynamiczne i zapalne podczas ostrej i przewlekłej choroby Dwa do trzech tygodni przed mikroskopią przyżyciową. Kraniotomia jest wykonywana u myszy w wieku od 8 do 10 tygodni, co zostało wcześniej zademonstrowane, z wyjątkiem tego, że tytanowy pręt nie jest umieszczany w głowie zwierzęcia. Przewlekłe okno czaszkowe jest stabilnym preparatem, pozwalającym na badanie mikrokrążenia włosowego nawet po miesiącach od wszczepienia implantu w dniu eksperymentu.

Po pierwsze, sprawdź temperaturę ciała zwierzęcia przed umieszczeniem go w stereotaktycznej ramce, w której podawano wcześniej przygotowane, znakowane fluorescencyjnie erytrocyty przez żyłę ogonową myszy. Umożliwi to śledzenie erytrocytów, co zostanie wykazane później. Następnie lekko znieczulij mysz izofluorem.

4% do indukcji, od jednego do 2% do konserwacji. Następnie ułóż zwierzę w pozycji leżącej w stereotaktycznej ramie na poduszce grzewczej. Ostrożnie zabezpiecz głowę za pomocą nauszników i wyreguluj poziom za pomocą prawej i lewej dźwigni.

Delikatnie wyczyść szkiełko nakrywkowe na oknie czaszki bawełnianym wacikiem zwilżonym olejem mineralnym. Następnie za pomocą mikroskopu stereoskopowego podłączonego do aparatu cyfrowego zrób kilka panoramicznych zdjęć naczyń pod oknem. Po przesłaniu zdjęć panoramicznych do komputera wybierz najlepsze do wydrukowania, zidentyfikowania i datowania.

Zdjęcie to zostanie wykorzystane jako mapa do pomiarów średnicy naczynia i prędkości czerwonych krwinek, które zostaną zademonstrowane przed rozpoczęciem mikroskopii intrażyciowej. Przenieś mysz do dostosowanego stolika mikroskopu przyżyciowego. Umieść kroplę wody na oknie czaszki, korzystając z dobrze utworzonej przez akrylowy materiał dentystyczny.

Używany jest obiektyw zanurzony w wodzie 20 razy z aperturą numeryczną 0,5. Obrazy są rejestrowane za pomocą dwóch kamer, cyfrowej kamery o niskiej prędkości przy słabym oświetleniu podłączonej do komputera i monitora oraz kamery analogowej o słabym oświetleniu podłączonej do taśmy magnetowidowej, znacznika czasu i kolorowego monitora przed wyborem naczyń do pomiaru, sprawdź naczynia w celu oceny jakości preparatu i czy krew płynie we wszystkich naczyniach, Następnie wybierz naczynia, które mają zostać zmierzone. Powinny one obejmować miejsca i arterie o różnych średnicach i obejmować różne miejsca w obszarze odsłoniętym przez okno.

W naszym eksperymencie wybieramy 12 naczyń do pomiaru, gdy oglądasz różne pola w oknie czaszki. Aby wybrać naczynia, opisz dokładną lokalizację każdego miejsca, które ma być mierzone, na zdjęciu układu naczyniowego PY, które zostało wykonane wcześniej dla każdego miejsca, średnicę naczynia mierzy się za pomocą urządzenia do ścinania obrazu. Po wybraniu miejsca obraz naczynia jest wyrównywany w pozycji pionowej, a obraz jest ścinany do przeciwnego poziomu.

Skrajności są wyrównane, a odczyt jest dokumentowany. W przypadku śledzenia erytrocytów każde miejsce jest rejestrowane przez kamerę cyfrową przez co najmniej 30 sekund, a obrazy wideo są rejestrowane z prędkością 150 klatek na sekundę. Szybkość ta jest ustawiona na uzyskanie od jednego do sześciu obrazów komórki na jednej klatce wideo w celu określenia prędkości do sześciu milimetrów na sekundę.

Po zakończeniu zbierania danych wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej i umieść ją z powrotem w klatce, aby odzyskać sprawność po znieczuleniu za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Pozyskane obrazy wideo są digitalizowane i XY. Uzyskiwane są dane współrzędnych dla każdego obrazu komórki. Pozycje komórek są określane ręcznie, a nie przez analizę obrazu.

Biorąc pod uwagę, że oko wprawnego obserwatora dobrze ocenia położenie środka komórki, co na ogół odpowiada lokalizacji obserwowanej maksymalnej fluorescencji. Dla większości orientacji komórek określa się położenie i prędkość dla 15 komórek w każdym naczyniu. Średnia w celu uzyskania średniej prędkości RBC, gdy dostępne są pomiary średnicy naczynia i prędkości RBC.

Obliczenie przepływu krwi w każdym naczyniu można wykonać za pomocą wzoru Q równego D przez dwa razy kwadrat PI razy V, gdzie Q równa się przepływowi krwi, V równa się prędkości RBC, a D równa się średnicy naczynia do oceny obfitości i analizy przylegania leukocytów w naczyniach palowych. Mikroskopia przyżyciowa jest wykonywana na zwierzęciu, któremu podawano mieszaninę albuminy znakowanej FSE i przeciwciał przeciwko markerowi leukocytów pan CD 45 znakowanemu czerwienią teksańską. Albumina znakowana fluorescencyjnie umożliwia lepszą wizualizację sieci naczyniowej, w tym naczyń penetrujących i jest szczególnie przydatna w stanach chorobowych, takich jak malaria mózgowa, w celu sprawdzenia, czy naczynia nie są perfundowane lub nie są pod perfuzją.

Znakowane fluorescencyjnie przeciwciała anty CD 45 ułatwiają identyfikację i ilościowe określenie toczenia leukocytów i adhezji do naczyń włosowych. Kwantyfikacja adhezji leukocytów odbywa się poprzez zliczenie liczby leukocytów w naczyniu o długości 100 mikronów. Walcowanie określa się ilościowo, zliczając liczbę leukocytów poruszających się z prędkością znacznie mniejszą niż prędkość krwi o tej samej długości 100 mikronów w ciągu 30 sekund. Pokazano.

Oto przykład mikrokrążeniowych pomiarów prędkości czerwonych krwinek poprzez śledzenie komórek z szybkiej fluorescencji. Nagrania wideo, obrazy od A do F są sekwencyjnymi obrazami mikrokrążenia. Każde zdjęcie przedstawia pozycję pojedynczej przepływającej czerwonej krwinki, która jest rejestrowana klatka po klatce przez szybką kamerę.

Ten wykres z reprezentatywnego eksperymentu pokazuje zmiany w przepływie krwi w stosie w czasie. U myszy zakażonych plasmodium, burgi, onca i u niezakażonych myszy kontrolnych, podczas gdy u myszy kontrolnych przepływ krwi w stosie jest stosunkowo stabilny w czasie. Myszy zakażone PBA wykazują spadek przepływu krwi na rynku w czasie rozwoju malarii mózgowej.

W szóstym dniu, barwienie anty CD 45, czerwone przeciwciała fluorescencyjne z Teksasu ujawniają dużą liczbę leukocytów przylegających do naczyń włosowych myszy zakażonej Plasmodium burgi onca. Ta procedura ma szeroki zakres zastosowań poza jedną pracą tutaj dzisiaj. Każda technika optyczna, która może być stosowana in vivo, może być dostosowana do tego modelu, a parametry takie jak tkanka, poziom tlenu w tkance, formy tlenu reagujące na pH i interakcja śródbłonka z leukocytami mogą być badane w tym modelu.