Name: Mikroskopia przyżyciowa mikrokrążenia mózgu myszy przy użyciu zamkniętego okienka czaszkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj mikroskopię przyżyciową mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okienka czaszkowego. Ta metoda pozwala śledzić zmiany hemodynamiczne i zapalne w mikrokrążeniu oponowym w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana z grantów R01-HL87290, R01-HL87290-S1 oraz R01-AI082610 przyznanych przez National Institutes of Health dla LJMC.

1. Kraniotomia
Kraniektomię u myszy w wieku od 8 do 10 tygodni należy przeprowadzić wcześniej zgodnie z opisem1, z wyjątkiem tego, że w głowie zwierzęcia nie umieszcza się tytanowego pręta. Przewlekłe okno czaszkowe jest stabilną preparacją umożliwiającą badanie mikrokrążenia opon miękkich nawet kilka miesięcy po implantacji. Zazwyczaj badania przeprowadzamy 2-3 tygodnie po implantacji okna czaszkowego.
2. Mikroskopia intravitalna
<ol>
 <li>Dwa lub trzy tygodnie po kraniotomii sprawdza się temperaturę ciała, a następnie mysz poddaje się lekkiej anestezji izofluranem (4% do indukcji, 1-2% do podtrzymania). Lekką anestezję stosuje się, aby zapobiec stresowi i dyskomfortowi zwierzęcia podczas procedury eksperymentalnej.</li>
 <li>Zwierzęta są następnie umieszczane w pozycji brzusznej w ramie stereotaktycznej, a głowę starannie mocuje się za pomocą prętów usznych. Poziom reguluje się za pomocą dźwigni prawej i lewej. Temperaturę głęboką ciała utrzymuje się za pomocą maty grzewczej. Ponieważ u myszy z malarią mózgową rozwija się hipotermia, ustawienia temperatury muszą być dostosowane do każdego zwierzęcia.</li>
 <li>Kryształy okładkowe w oknie czaszkowym są delikatnie czyszczone patyczkiem nasączonym olejem mineralnym, a następnie za pomocą stereomikroskopu i kamery cyfrowej (Nikon Coolpix 995, Japonia) wykonuje się panoramiczne zdjęcie naczyń pod oknem. Zdjęcie jest drukowane, opisane i datowane; służy ono jako mapa do pomiarów średnicy naczyń i prędkości erytrocytów (RBC).</li>
 <li>Mysz jest następnie przenoszona na stoлик mikroskopu intravitalnego (zmodyfikowany Leica-McBain, San Diego, CA). Wykorzystując zagłębienie utworzone przez akryl dentystyczny, na okno czaszkowe nakłada się kroplę wody i reguluje ostrość. Pomiary wykonuje się przy użyciu obiektywu imersyjnego wodnego 20X (LUMPFL-WIR, apertura numeryczna 0,6, Olympus). Śledzi się te same naczynia, aby umożliwić bezpośrednie porównania z ich poziomami bazowymi, co pozwala na uzyskanie bardziej wiarygodnych statystyk dla małych populacji próbek. Obrazy są rejestrowane za pomocą cyfrowej, szybkiej kamery do niskiego oświetlenia (Hamamatsu C9300-221, Japonia) lub analogowej kamery do niskiego oświetlenia (COHU 4815, San Diego, CA) podłączonej do magnetowidu (JVC, Japonia), urządzenia do znakowania czasu (MicroImage Video Systems, Boyertown, PA) i monitora kolorowego (PELCO, Clovis, CA). Taśma jest odpowiednio opisana przed rozpoczęciem nagrywania, a znacznik czasu pozwala na identyfikację zdarzeń poprzez dokumentację ram czasowych, w których zostały one zarejestrowane.</li>
 <li>W pierwszej kolejności sprawdzane są naczynia w celu oceny jakości preparatu oraz weryfikacji, czy krew przepływa we wszystkich naczyniach. Następnie wybiera się naczynia do pomiaru, które powinny obejmować venule i arteriole o różnych średnicach (w naszych preparatach pialnych myszy większość naczyń ma średnicę od 20 do 80 µm) i obejmować różne obszary w strefie odsłoniętej przez okno. Arteriole i venule można łatwo rozróżnić, sprawdzając kierunek przepływu krwi w rozgałęzieniach naczynia (czy rozdziela, czy zbiera krew). W naszych badaniach pomiary wykonuje się w 12 naczyniach. Dokładna lokalizacja każdego miejsca do pomiaru jest zaznaczona na zdjęciu naczyń pialnych.</li>
 <li>Dla każdego punktu średnicę naczynia mierzy się za pomocą urządzenia do przesunięcia obrazu (Image Shear, Vista Electronics, San Diego, CA)2. Po wybraniu punktu obraz naczynia jest ustawiany w pozycji pionowej, a następnie przesuwany, aż przeciwległe krawędzie zostaną wyrównane, po czym odczyt jest dokumentowany. Wartość tę można przeliczyć na mikrometry dzięki wcześniejszej kalibracji dla każdego konkretnego powiększenia przy użyciu mikrometru kalibracyjnego siatki (Edmund Optics Inc., Barrington, NJ).</li>
 <li>Każdy punkt jest rejestrowany przez co najmniej 30 sekund w celu śledzenia erytrocytów. Do śledzenia pobiera się próbkę krwi, erytrocyty znakuje się fluorescencyjnie barwnikiem karbocyjaninowym Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) i wprowadza przez żyłę ogonową, aby uzyskać stężenie in vivo wynoszące ok. 0,4-0,5%3. U zwierząt zainfekowanych szczepem Plasmodium berghei ANKA (PbA) wykazującym ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (PbA-GFP, dar z Malaria Research and Reference Reagent Resource Center MR4, Manassas, VA; przekazany przez CJ Janse i AP Waters), infuzja znakowanych komórek nie jest konieczna. Obrazy wideo są rejestrowane w częstotliwości 150 klatek na sekundę. Szybkość ta została dobrana tak, aby uzyskać od jednej do sześciu obrazów komórki na jednej klatce wideo dla wyznaczenia prędkości do 8 mm/s. Obrazy wideo są digitalizowane za pomocą komputera osobistego przy użyciu oprogramowania Adobe Premier 4.0, a dane współrzędnych x-y dla każdego obrazu komórki są uzyskiwane za pomocą oprogramowania SigmaScan Pro 4.0 (SPSS Chicago, IL)4. Pozycje komórek są wyznaczane ręcznie, a nie poprzez analizę obrazu, ponieważ wykazano, że oko przeszkolonego obserwatora zapewnia dobrą estymację położenia środka komórki, co zazwyczaj odpowiada miejscu maksymalnej fluorescencji obserwowanej dla większości orientacji komórek. Dla każdej komórki wykonuje się wielokrotne oznaczenia pozycji i prędkości, a następnie wyciąga się średnią, aby uzyskać średnią prędkość RBC.</li>
 <li>Gdy pomiary prędkości RBC są wykonywane offline, całkowity czas obserwacji dla każdej myszy nie przekracza 10-15 minut, co minimalizuje kardiodepresyjne efekty anestezji.</li>
 <li>Po uzyskaniu pomiarów średnicy naczyń i prędkości RBC można obliczyć przepływ krwi w każdym naczyniu, korzystając ze wzoru: Q = V x π(D/2)2, gdzie Q = przepływ krwi, V = prędkość RBC a D = średnica naczynia.</li>
 <li>Procedury te można powtarzać w czasie. Na przykład w mysim modelu malarii mózgowej wykonujemy codzienne pomiary zaczynając od 4. dnia infekcji. Wartości uzyskiwane każdego dnia dla każdej myszy są normalizowane w stosunku do dnia 0 (przed infekcją), który przyjmuje się za 100%.</li>
 <li>Oprócz pomiarów średnicy naczyń i przepływu krwi można przeprowadzić dodatkowe oceny, np. ulepszoną ocenę perfuzji oraz analizę toczenia i adhezji leukocytów i/lub płytek krwi w naczyniach pialnych. Pomiary te wykonuje się przy użyciu markerów znakowanych fluorescencyjnie. W przypadku malarii możemy również wykryć krążące lub przylegające pasożyty, stosując szczep PbA wykazujący ekspresję GFP.</li>
 <li>Do oceny perfuzji stosujemy roztwór albuminy znakowanej FITC (Sigma, St Louis, MO, 50 µg/mysz), a do ilościowego oznaczenia adhezji leukocytów do naczyń pialnych stosujemy przeciwciała przeciwko pan-leukocytowemu markerowi CD45 znakowane Texas Red (TxR) (Invitrogen, Carlsbad, CA, 4 µg/mysz). W tym celu 25 µL albuminy-FITC (2 mg/mL) i 20 µL przeciwciał anti-CD45-PE (200 µg/mL) miesza się i wstrzykuje do uprzednio ogrzanej żyły ogonowej. Obrazowanie myszy może nastąpić natychmiast, jednak jeśli planowane są pomiary przecieku, pozwala się albuminie-FITC krążyć przez 15 minut. Zieloną fluorescencję (518 nm) emitowaną przez albuminę-FITC i GFP (PbA-GFP pRBC) rejestruje się za pomocą ALPHA Vivid: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), a fluorescencję anti-CD45-TxR (615 nm) wzbudza się i rejestruje za pomocą Vivid Standard: XF42.</li>
 <li>Albuminy znakowane fluorescencyjnie pozwalają na lepszą wizualizację sieci naczyniowej, w tym naczyń penetrujących, i są szczególnie przydatne w stanach chorobowych, takich jak malaria mózgowa, do sprawdzania naczyń nieperfundowanych lub niedoperfundowanych. Mogą być również użyte do pomiaru przecieku naczyniowego5.</li>
 <li>Przeciwciała anti-CD45 znakowane fluorescencyjnie ułatwiają identyfikację i ilościowe określenie toczenia i adhezji leukocytów do naczyń pialnych. Aby uniknąć błędów w ilościowym określaniu, analizujemy toczenie i adhezję w tych samych punktach, które wcześniej zdefiniowano do pomiaru przepływu krwi. Ilościowe określenie adhezji leukocytów odbywa się poprzez zliczanie liczby leukocytów na 100 µm długości naczynia. Toczenie określa się poprzez zliczanie liczby leukocytów poruszających się z prędkością znacznie mniejszą niż prędkość krwi na tej samej długości 100 µm, w czasie 30 sekund.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="Schemat badania siatkówki myszy, ilustracja procedury i obrazowanie siatkówki, badania biologiczne." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. (Krok 2.6) Zdjęcia sieci naczyniowej oponopławnej myszy dostępnej przez okno czaszkowe.
<img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="Schemat układu mikroskopowego do pomiaru prędkości RBC i analizy adhezji leukocytów." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. (Kroki 3.1-3.5) Schematyczne przedstawienie układu do mikroskopii wewnątrzorganizmowej mikrokrążenia opon miękkich myszy. 1: mikroskop wewnątrzorganizmowy; 2: obiektyw imersyjny wodny 20X; 3: źródło światła; 4a: cyfrowa szybka kamera do pomiarów w niskim świetle; 4b: kamera analogowa; 5: mysz w ramie stereotaktycznej; 6: monitor komputera; 7: analogowy monitor przesunięcia obrazu pokazujący, w jaki sposób wykonuje się przesunięcie (strzałka) w celu pomiaru średnicy naczynia.
<img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="Sekwencyjne obrazy mikroskopowe do śledzenia ruchu cząstek; przedstawiają sześć etapów A-F w serii czasowej." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. (Krok 3.6-3.8) Pomiary prędkości erytrocytów w naczyniach mikrokąskowych poprzez śledzenie komórek na podstawie szybkich nagrań wideo w fluorescencji. Zdjęcia od A do F stanowią sekwencję obrazów jednego naczynia oplątawego, ukazującą pojedynczy poruszający się erytrocyt przecinający pole mikroskopowe ograniczone przez kamerę. Ręczne wyznaczanie pozycji klatka po klatce dla 15 lub więcej komórek przecinających pole, przy zastosowaniu uprzednio skalibrowanego dystansu, umożliwia obliczenie średniej prędkości erytrocytów w każdym naczyniu za pomocą arkusza kalkulacyjnego Excel.
<img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="Wykres przepływu krwi wtórniczkach; myszy zakażone PbA vs niezakażone; dni zakażenia; procentowa zmiana względem wartości bazowej." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. (Krok 3.9) Dane z reprezentatywnego eksperymentu pokazujące zmiany w przepływie krwi oponopławnej w czasie u myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA (PbA) (n = 5) oraz u niezakażonych myszy kontrolnych (n = 5). Podczas gdy u myszy kontrolnych przepływ krwi oponopławnej pozostaje stosunkowo stabilny w czasie, u myszy zakażonych PbA widoczny jest wyraźny spadek przepływu krwi w momencie rozwoju malarii mózgowej (dzień 6). Dane przedstawiono jako średnia ± SEM.
<img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="Obraz mikroskopowy wzrostu biofilmu bakteryjnego; mikroskopia fluorescencyjna; monitorowanie w czasie rzeczywistym." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. (Krok 4.3) Duża liczba leukocytów przylegających do naczyń oponowych myszy zainfekowanej Plasmodium berghei ANKA, uwidoczniona poprzez barwienie fluorescencyjnymi przeciwciałami anty-CD45-Texas Red.

<ol><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li>
<li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li>
<li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li>
<li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li>
<li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li>
<li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction%2C+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda mikroskopii intravitalnej stanowi wyjątkowe i potężne narzędzie do szczegółowej obserwacji mikrokrążenia opon miękkich u myszy. Pozwala ona na wyodrębnienie poszczególnych tętniczek i żyłek oraz pomiar zmian szeregu parametrów, takich jak średnice naczyń, prędkości RBC, przepływ krwi, przyleganie i toczenie się leukocytów, płytek krwi i innych elementów krwi, przeciekanie naczyniowe, pH tkanki i pO2, a potencjalnie wiele innych zastosowań. Odpowiedź naczyniową in vivo można bezzwłocznie ocen...

<table><tbody><tr><td>Izofluran</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik karbocyjaninowy Dil</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D306</td><td></td></tr><tr><td>Albumin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Anti-CD45-TxR</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4517</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;P. berghei&lt;/em&gt; ANKA-GFP</td><td>MR4</td><td>MRA-865</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Niniejszy model eksperymentalny został opracowany w celu oceny pialnego mikrokrążenia u myszy podczas ostrych i przewlekłych, fizjologicznych i patofizjologicznych stanów hemodynamicznych, zapalnych i metabolicznych, z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej in vivo. Nad lewą korą ciemieniowo-potyliczną myszy umieszcza się zamknięte okno czaszkowe. Lokalny mikrokrążenie jest rejestrowane w czasie rzeczywistym przez okno przy użyciu oświetlenia epi i fluorescencyjnego, a następnie wykonuje się pomiary średnic naczyń oraz prędkości erytrocytów (RBC). Prędkość RBC jest mierzona za pomocą korelacji wzajemnej w czasie rzeczywistym i/lub z użyciem erytrocytów znakowanych fluorescencyjnie. Adhezję leukocytów i płytek krwi do naczyń pialnych oraz ocenę perfuzji i przecieku naczyniowego przeprowadza się przy pomocy markerów znakowanych fluorescencyjnie, takich jak Albumin-FITC i przeciwciała anty-CD45-TxR. Mikrokrążenie może być wielokrotnie rejestrowane w formie wideo przez kilka dni. Po raz pierwszy zastosowaliśmy intravitalną mikroskopię mózgu z zamkniętym oknem do badania mikrokrążenia pialnego w celu śledzenia dynamicznych zmian w przebiegu zakażenia myszy szczepem Plasmodium berghei ANKA, wykazując, że ekspresja CM wiąże się z dysfunkcjami mikrokrążenia charakteryzującymi się skurczem naczyń, głębokim spadkiem przepływu krwi, a ostatecznie zapadnięciem się naczyń.

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Ten model eksperymentalny został opracowany w celu oceny pialnej mikrokrążenia u myszy podczas ostrego i przewlekłego, fizjologicznego i patofizjologicznego hemodynamicznego...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest badanie mikrokrążenia w mózgu myszy za pomocą mikroskopii intravitalnej, która umożliwia śledzenie dynamicznych zmian markerów hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu w dłuższych okresach czasu. Technika ta została opracowana w La Jolla Bioengineering Institute, gdzie wykorzystano ją w wielu rodzajach badań. Przykładowo, do monitorowania zmian hemodynamicznych w przebiegu infekcji plasmodium burgi onca oraz w czasie występowania malarii mózgowej.Osiąga się to najpierw poprzez implantację przewlekłego okna czaszkowego na dwa tygodnie przed badaniami z wykorzystaniem mikroskopii intravitalnej. Drugim krokiem procedury jest zarejestrowanie ogólnej morfologii okna czaszkowego za pomocą cyfrowego obrazu o wysokiej rozdzielczości przy niskim powiększeniu. Trzecim krokiem procedury jest pozyskanie obrazów z mikroskopii intravitalnej przy użyciu oświetlenia konwencjonalnego i fluorescencyjnego oraz wybór konkretnych obszarów badawczych do pomiarów w czasie rzeczywistym średnicy naczyń i prędkości RBC.Ostatnim krokiem procedury jest przeprowadzenie analizy intravitalnej przylegania leukocytów i płytek krwi w naczyniach pialnych przy użyciu specyficznych przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie. W efekcie można uzyskać wyniki wykazujące in vivo zmiany w mikrokrążeniu mózgowym w modelach odzwierciedlających warunki fizjologiczne, patofizjologiczne lub chorobowe za pomocą intravitalnej mikroskopii mózgu, aby określić zmiany hemodynamiczne związane z tymi stanami. Główną zaletą tej techniki jest możliwość obserwacji mózgu w jego fizjologicznym środowisku, bez narażania go na działanie czynników zewnętrznych lub sztucznych mediów; mikroskopia intravitalna, w porównaniu z rezonansem magnetycznym i angiografią, charakteryzuje się rozdzielczością przestrzenną i czasową, która pozwala na obserwację na poziomie mikroskopowym.Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące fizjologii i patofizjologii mikrokrążenia mózgowego, takie jak zmiany hemodynamiczne i zapalne podczas ostrej i przewlekłej choroby. Na dwa do trzech tygodni przed mikroskopią wewnątrzżyciową u myszy w wieku od 8 do 10 tygodni przeprowadza się kraniotomię zgodnie z wcześniej opisaną procedurą, z wyjątkiem tego, że w głowie zwierzęcia nie umieszcza się tytanowego pręta. Przewlekłe okno czaszkowe jest stabilnym preparatem, umożliwiającym badanie mikrokrążenia mózgu nawet kilka miesięcy po implantacji w dniu przeprowadzenia eksperymentu.Najpierw należy zmierzyć temperaturę ciała zwierzęcia, a następnie umieścić je w aparacie stereotaksycznym i wprowadzić wcześniej przygotowane, znakowane fluorescencyjnie erytrocyty przez żyłę ogonową myszy. Umożliwi to śledzenie erytrocytów, co zostanie zademonstrowane w dalszej części. Następnie mysz należy lekko znieczulić izofluranem.4% do indukcji, od 1 do 2% do podtrzymania. Następnie umieść zwierzę w pozycji brzusznej w ramie stereotaksycznej na podkładce grzewczej. Ostrożnie unieruchom głowę za pomocą prętów usznych i wyreguluj poziom za pomocą dźwigni prawej i lewej.Delikatnie oczyść szkiełko nakrywkowe okna czaszkowego za pomocą patyczka higienicznego zwilżonego olejem mineralnym. Następnie, używając stereomikroskopu podłączonego do kamery cyfrowej, wykonaj kilka zdjęć panoramicznych naczyń znajdujących się pod oknem. Po przesłaniu zdjęć panoramicznych na komputer wybierz najlepsze z nich, aby je wydrukować, zidentyfikować i opatrzyć datą.To zdjęcie zostanie wykorzystane jako mapa do pomiarów średnicy naczyń oraz prędkości erytrocytów, co zostanie zademonstrowane w dalszej części przed rozpoczęciem mikroskopii wewnątrzorganizacyjnej. Przenieś mysz na dostosowany stolik mikroskopu do obrazowania intravitalnego. Nanieś kroplę wody na okno czaszkowe, wykorzystując zagłębienie utworzone przez akryl dentystyczny.Użyto obiektywu imersyjnego 20x o aperturze numerycznej 0,5. Obrazy rejestrowano za pomocą dwóch kamer: cyfrowej kamery o wysokiej czułości i dużej prędkości, podłączonej do komputera i monitora, oraz analogowej kamery o wysokiej czułości, podłączonej do magnetowidu VCR, generatora znaczników czasu i monitora kolorowego. Przed wybraniem naczyń do pomiaru należy sprawdzić naczynia w celu oceny jakości preparatu oraz upewnić się, czy w ich wszystkich przepływa krew; następnie należy wybrać naczynia do pomiaru. Powinny one obejmować żyły i tętnice o różnych średnicach i znajdować się w różnych miejscach obszaru odsłoniętego przez okno.W naszym eksperymencie wybieramy 12 naczyń do pomiaru, przeglądając różne pola w obrębie okna czaszkowego. Aby wybrać naczynia, należy zaznaczyć dokładną lokalizację każdego punktu do pomiaru na zdjęciu unaczynienia PY wykonanym wcześniej dla każdego punktu; średnicę naczynia mierzy się za pomocą urządzenia do ścinania obrazu. Po wybraniu punktu obraz naczynia jest ustawiany w pozycji pionowej, a następnie obraz jest ścinany aż do przeciwległego brzegu.Wyrównano wartości ekstremalne i odnotowano odczyt. W celu śledzenia erytrocytów każda plamka jest rejestrowana przez kamerę cyfrową przez co najmniej 30 sekund, a obrazy wideo są zapisywane z częstotliwością 150 klatek na sekundę. Tempo to ustawiono w celu uzyskania od jednej do sześciu obrazów komórki na jednej klatce wideo, co pozwala na wyznaczenie prędkości do 6 mm/s.Po zakończeniu zbierania danych należy wyjąć mysz z aparatu stereotaksycznego i przenieść ją z powrotem do klatki, aby mogła dojść do siebie po znieczuleniu, korzystając z odpowiedniego oprogramowania. Uzyskane obrazy wideo są digitalizowane, a następnie pozyskiwane są dane o współrzędnych XY dla obrazu każdej komórki. Pozycje komórek są wyznaczane ręcznie, a nie za pomocą analizy obrazu.Biorąc pod uwagę, że oko doświadczonego obserwatora pozwala na dobrą ocenę położenia centrum komórki, które zazwyczaj odpowiada miejscu zaobserwowanej maksymalnej fluorescencji. Dla większości orientacji komórek pomiary pozycji i prędkości wykonuje się dla 15 komórek w każdym naczyniu. Po uzyskaniu pomiarów średnicy naczynia oraz prędkości RBC wyciąga się średnią w celu otrzymania średniej prędkości RBC.Obliczenie przepływu krwi w każdym naczyniu może być wykonane przy użyciu wzoru Q równe D przez dwa do kwadratu razy PI razy V, gdzie Q oznacza przepływ krwi, V oznacza prędkość RBC, a D oznacza średnicę naczynia, w celu oceny perfuzji i analizy adhezji leukocytów w naczyniach włosowatych. Mikroskopię witalną przeprowadza się u zwierzęcia, któremu podano mieszaninę albuminy znakowanej FSE oraz przeciwciał przeciwko panleukocytowemu markerowi CD 45 znakowanych Texas Red. Albumina znakowana fluorescencyjnie umożliwia lepszą wizualizację sieci naczyniowej, w tym naczyń penetrujących i jest szczególnie użyteczna w stanach chorobowych, takich jak malaria mózgowa, w celu sprawdzenia obecności naczyń nieperfundowanych lub słabo perfundowanych.Przeciwciała anty-CD 45 znakowane fluorescencyjnie ułatwiają identyfikację i kwantyfikację toczucia oraz adhezji leukocytów do naczyń włosowatych. Kwantyfikacja adhezji leukocytów odbywa się poprzez zliczanie liczby leukocytów na odcinku naczynia o długości 100 µm. Toczanie jest kwantyfikowane poprzez zliczanie liczby leukocytów poruszających się z prędkością znacznie niższą niż prędkość przepływu krwi na tym samym odcinku 100 µm w ciągu 30 sekund. Przedstawiono.Oto przykład pomiarów prędkości erytrocytów w naczyniach mikrokrążenia za pomocą śledzenia komórek w fluorescencyjnym obrazowaniu wysokiej częstotliwości. Nagrania wideo od A do F stanowią sekwencję obrazów mikrokrążenia. Każdy obraz przedstawia pozycję pojedynczego płynącego erytrocytu, rejestrowanego klatka po klatce przez kamerę wysokiej częstotliwości.Wykres z reprezentatywnego eksperymentu przedstawia zmiany przepływu krwi w obrębie stosu w czasie. U myszy zainfekowanych plasmodium, burgi oraz onca, w przeciwieństwie do myszy kontrolnych niezainfekowanych, u których przepływ krwi w stosie pozostaje stosunkowo stabilny w czasie, u myszy zainfekowanych PBA obserwuje się znaczny spadek przepływu krwi w momencie rozwoju malarii mózgowej.W szóstym dniu barwienie przeciwciałami anty-CD45 znakowanymi fluorescencyjnie Texas Red ujawnia liczne leukocyty przylegające do naczyń włosowatych myszy zakażonej Plasmodium berghei onca. Procedura ta znajduje szerokie zastosowanie poza zakresem prezentowanego tutaj zadania. Do niniejszego modelu można dostosować każdą technikę optyczną możliwą do zastosowania in vivo, co pozwala na badanie takich parametrów jak utlenowanie tkanek, pH tkanek, reaktywne formy tlenu oraz interakcje śródbłonka z leukocytami.

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikroskopia przyżyciowa mikrokrążenia mózgu myszy przy użyciu zamkniętego okienka czaszkowego

Dynamikę przepływu krwi w korze mózgu można badać in vivo, obrazując fluorescencyjne barwniki dekstranowe wstrzyknięte do żyły ogonowej gryzoni za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Niniejszy film pokazuje, jak obrazować dynamikę przepływu krwi w neocortex myszy przy użyciu preparatu okna czaszkowego przykrytego szkłem.

Metoda obrazowania przepływu krwi w neokorze za pomocą obrazowania dwufotonowego przez okno czaszkowe

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

W tym filmie wykonujemy obrazowanie dożylne wstępnie wstrzykniętych komórek rakowych w modelu mysim przez wszczepione okienko czaszkowe. Ta technika obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości umożliwia badanie dynamicznego zachowania komórek nowotworowych u żywej myszy.

Obrazowanie przyżyciowe oparte na oknie czaszkowym w modelu mysim: technika obrazowania służąca do badania zachowania wstępnie wstrzykniętych komórek rakowych w mózgu modelu mysiego

Źródło: Sweeney, A. M., et al. Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy przy użyciu makroskopii fluorescencyjnej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film przedstawia proces wizualizacji przepływu płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) w mózgu myszy za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Znacznik fluorescencyjny jest wstrzykiwany do cisterna magna (CM), umożliwiając śledzenie jego ruchu za pomocą płynu mózgowo-rdzeniowego przez przestrzenie podpajęczynówkowe i...

Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w mózgu myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej

Chirurgiczne zamknięcie dystalnej gałęzi środkowej tętnicy mózgowej (MCAo) jest często używanym modelem w eksperymentalnych badaniach nad udarem. Manuskrypt ten opisuje podstawową technikę stałego MCAo, połączoną z wstawieniem bocznego okna czaszki, które daje możliwość podłużnej mikroskopii przyżyciowej u myszy.

Przygotowanie bocznego przewlekłego okna czaszki umożliwia obserwację in vivo po niedrożności dystalnej tętnicy środkowej mózgu u myszy

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Przezczaszkowe obrazowanie optyczne umożliwia szerokie obrazowanie transportu płynu mózgowo-rdzeniowego w korze mózgowej żywych myszy przez nienaruszoną czaszkę.

Obrazowanie in vivo transportu płynu mózgowo-rdzeniowego przez nienaruszoną czaszkę myszy za pomocą makroskopii fluorescencyjnej

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Poznaj mikroskopię przyżyciową mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okienka czaszkowego. Ta metoda pozwala śledzić zmiany hemodynamiczne i zapalne w mikrokrążeniu oponowym w czasie rzeczywistym.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Przeglądaj więcej filmów