Kwantyfikacja synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego określania liczby synaps

Jednym z najważniejszych celów neurobiologii jest zrozumienie sygnałów molekularnych, które instruują wczesne etapy tworzenia synaps. W związku z tym konieczne stało się opracowanie obiektywnych podejść do ilościowego określania zmian w połączeniach synaptycznych. Aby określić ilościowo liczbę synaps w różnych preparatach eksperymentalnych, hodowane neurony lub preparaty tkanki mózgowej kriosekcji są barwione selektywnymi markerami przed i po synaptycznych w celu oznaczenia punktów kontaktu synaptycznego między neuronami.

Komórki lub tkanki są następnie obrazowane pod mikroskopem fluorescencyjnym i wymagane są ośmiobitowe obrazy dla każdego z kanałów odpowiadających dwóm markerom immunohistochemicznym. Obrazy są analizowane za pomocą obrazu J 1.29 z analizatorem puncta. Aby określić zakres kolokalizacji między markerami synaptycznymi pre i post, punkty kolokalizacji można następnie wykorzystać do określenia liczby synaps obecnych w preparacie.

Główną przewagą opisanej tutaj techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia elektronowa, jest to, że test synaps pozwala na znacznie wyższą przepustowość analizy i kwantyfikację liczby synaps. Główne implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy i terapii zaburzeń klinicznych, takich jak choroba Alzheimera, padaczka lub autyzm, w których nieprawidłowości i połączenia synaptyczne zostały zaangażowane jako podstawa podstawowej patologii. Technika ta może być wykorzystana do zidentyfikowania form interwencji, które mogą zmniejszyć lub złagodzić braki, które obserwujemy w zdolności dotkniętych neuronów do tworzenia synaps ze sobą.

Chociaż ta metoda jest przydatna do badania rozwoju mózgu, może być również stosowana do innych organizmów modelowych lub układów narządów, w których jesteś zainteresowany badaniem lub ilościowym określaniem liczby kontaktów między komórkami, dla których masz możliwość selektywnego oznaczania każdej przeciwnej powierzchni w każdym miejscu kontaktu. Przygotować hodowle neuronów poprzez posiew komórek zwojowych siatkówki szczura oczyszczonych z siatkówki szczura, zebranych od pięciu do siedmiu zwierząt P na szklanych szkiełkach pokrytych poli polilicyną. W 24-dołkowej płytce komórki mogą rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do pięciu dni przed transfekcją.

Po transfekcji inkubuj komórki przez dodatkowe siedem do ośmiu dni, aby umożliwić rozwój synaps, gdy platerowane komórki wystarczająco dojrzeją. Usuń pożywkę hodowlaną z dołków i dodaj 500 mikrolitrów wstępnie ciepłego, 4% para formaldehydu do każdej studzienki utrwalonej przez siedem minut. W temperaturze pokojowej po utrwaleniu przepłukać komórki trzykrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanem.

Ważne jest, aby upewnić się, że komórki nigdy nie mogą wyschnąć w studzienkach. Po usunięciu buforu ze studni należy go niezwłocznie zastąpić następnym buforem. Przygotować bufor blokujący zawierający 50% normalnej surowicy koziej i 0,2% Triton X 100.

Po usunięciu PBS z każdego z nich, dobrze dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki i blokuj przez 30 minut. W temperaturze pokojowej usuń bufor blokujący i spłucz trzy razy. Za pomocą PBS przygotuj pierwszorzędowe rozcieńczenie przeciwciała w 90% buforze przeciwciał, 10% roztworze NGS zawierającym wybraną parę przeciwciał przed i po synaptyce.

Tutaj królicza antysynapsyna i mysi anty homer. Stosuje się marker postsynaptyczny Wirówka, rozcieńczanie przeciwciał pierwotnych przez pięć minut z maksymalną prędkością w wirówce stołowej w celu usunięcia wytrąconego przeciwciała, a następnie dodanie do każdego z nich 200 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Dobrze umieść płytkę w nawilżonym pojemniku, aby zapobiec wysuszeniu pierwotnego roztworu.

Inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza po inkubacji z przeciwciałem pierwotnym. Wypłucz każdą studzienkę trzy razy. Za pomocą PBS dodać 200 mikrolitrów odpowiednich przeciwciał drugorzędowych, rozcieńczonych jeden do 1000 w przygotowanym buforze przeciwciał zawierającym 10% NGS.

Tak jak poprzednio, umieść naczynie w wilgotnej komorze i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w ciemności po inkubacji z wtórnikami. Wypłucz każdą studzienkę trzy do czterech razy PBS. Umieść kroplę nośnika montażowego osłony wektorowej o DPI na szklanym szkiełku.

Następnie odwróć szkło nakrywkowe z komórkami na kroplę, aby zamontować. Na koniec nałóż bezbarwny lakier do paznokci wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego. Należy uważać, aby nie popychać ani nie przesuwać szkiełek nakrywkowych podczas aplikacji.

Ponieważ spowoduje to podzielenie komórek, pozwól szkiełkom wyschnąć przez co najmniej 30 minut w suchym, ciemnym miejscu. W tym przypadku obrazowanie odbywa się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zes axio imager wyposażonego w odpowiednie zestawy filtrów i obiektyw z 63-krotnym zanurzeniem w olejku. Umieścić szkiełko zawierające nietransfekowane komórki na stoliku mikroskopu.

Korzystając z zestawu filtrów DPI do wizualizacji jąder komórkowych, wybierz komórki, które są oddalone od swoich najbliższych sąsiadów o co najmniej dwie średnice komórek. Użycie DPI na tym etapie pomoże uniknąć stronniczości i zapewni losowość wyboru komórek. Dla każdej wybranej komórki uzyskaj ośmiobitowe obrazy przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów, w tym przypadku GFP i Texas Red.

Nałożony pseudokolorowy obraz powinien pokazywać markery przed i po synaptyce odpowiednio na czerwono i zielono. Następnie umieść szkiełko zawierające transfekowane komórki na stoliku mikroskopowym. W tym przypadku komórki zostały transfekowane wektorem ekspresji pomidora TD.

Użyj tego znacznika, aby zaznaczyć komórki tak jak poprzednio. Dla każdej wybranej komórki uzyskaj osiem obrazów wgłębień przy użyciu odpowiednich zestawów filtrów, w tym przypadku GFP, Texas Red i Sci five. Nałożony pseudokolorowy obraz powinien mieć markery postsynaptyczne w kolorze czerwonym, zielonym i niebieskim.

W tym przypadku program analizatora nakłucia służy do ilościowego oznaczania kolokalizowanego nakłucia synaptycznego. Wtyczka analizatora Puncta została napisana przez Barry'ego Walka i jest dostępna na żądanie na obrazie J 1.26. Otwórz jeden z zebranych obrazów.

Użyj narzędzia do zaznaczania kołowego, aby zaznaczyć obszar o średnicy promieniowej około jednej komórki wokół interesującego go SOR. Po wybraniu interesującego Cię regionu przejdź do menu wtyczek i wybierz analizator przebicia w wyświetlonym oknie opcji analizy Wybierz czerwony kanał Zielony kanał. Najpierw odejmij tło i ustaw plik wyników.

Kliknij w porządku. Następnie zdefiniuj lokalizację, w której mają zostać zapisane wyniki. Wyniki te można wyeksportować do programu Excel w celu dalszej analizy w wyświetlonym oknie.

Następnie upewnij się, że wybrany jest promień toczącej się kuli wynoszący 50 i odznacz opcję białego tła. Ta modyfikacja nie jest wymagana, ale często jest preferowana przez użytkowników aplikacji. Aby ułatwić wizualizację, kliknij przycisk OK.

Pojawi się nowe okno wraz z maską odpowiadającą czerwonemu obrazowi kanału. Dostosuj próg, aż czerwona maska będzie jak najlepiej odpowiadać jak największej liczbie dyskretnych indywidualnych nakłuć. Nie wprowadzając zbyt dużego hałasu, kliknij Gotowe.

Ustaw minimalny rozmiar punktu szybkiego na cztery piksele. Nie modyfikuj niczego innego. Kliknij w porządku.

Powtórz poprzedni krok, tym razem dla kanału zielonego. Po powtórzeniu tego z zielonym kanałem, wtyczka zapewni kwantyfikację odpowiadającą puncta w każdym kanale osobno i współzlokalizowaną puncta między dwoma kanałami. Pokazany tutaj test synaps można zastosować do kriowycinków mózgu i dowolnej innej tkanki układu nerwowego, takiej jak rdzeń kręgowy lub siatkówka.

Pod warunkiem, że istnieje odpowiednia para markerów przed i po synaptyce. Zacznij od pobrania tkanki mózgowej od myszy, która została poddana eutanazji przez wykrwawienie i obfitość za pomocą PBS. Umieść cały mózg w 4% paraldehydzie w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc następnego dnia.

Przepłucz mózg trzy razy za pomocą PBS. Kriogeniczne chroni mózg, umieszczając go w 30% sacharozy. W PBS.

Tkanka początkowo będzie unosić się na wodzie, utrzymywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż opadnie na dno. Na tym etapie ochrona kriogeniczna jest kompletna. Następnie w roztworze dwa do jednego 20% sacharozy do OCT i PBS osadzaj mózg w pożądanej orientacji do cięcia.

Na przykład strzałkowy lub czołowy. Następnie umieść płaską metalową powierzchnię na wiadrze z suchym lodem. Umieść na nim osadzony mózg, aby zamroził się po zamrożeniu, przenieś mózg do torby do zamrażania i umieść go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na okres do roku przed sekcją.

Za pomocą kriozatoru należy podzielić tkankę na sekcje o wielkości od 12 do 16 mikronów i zamontować na szkiełkach podstawowych. Następnie wysusz szkiełka, umieszczając je w piekarniku o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie spłucz je trzykrotnie PBS, aby usunąć resztki OCT.

Pisak parafinowy służy do tworzenia bariery hydrofobowej wokół szkiełka, a do szkiełka dodawany jest bufor blokujący, który zapobiega spływaniu ze zjeżdżalni przez granicę parafiny. Umieść szkiełka w 20% normalnej surowicy koziej w PBS na godzinę w temperaturze pokojowej, aby zablokować następne miejsce. Skrawki przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczono w PBS 0,3% trytonem i 10% normalną surowicą kozią.

W tym przypadku antit królika, PSD 95 służy do oznaczania przedziałów glutaminergicznym, postsynaptycznych, a świnka morska anty v glu dwa służy do oznaczania glutaminergicznego zakończenia presynaptycznego. Umieścić szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza i inkubować przez 36 do 60 godzin po inkubacji. Zmyj przeciwciało pierwszorzędowe, zanurzając szkiełka trzy razy w PBS na 15 minut każde.

Po tym kroku upewnij się, że prowadnice są chronione przed bezpośrednim światłem. Zastosuj przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1 do 200 w PBS z 0,3% trytonem i 10% normalną surowicą kozią. Tutaj koza anty świnka morska.

Alexa 4 8 8 i koza anty królik. Używane są Alexa 5, 9, 4. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.

Umyj szkiełka, zanurzając je cztery razy w PBS na 15 minut każda, aby je zamontować. Dodaj małe krople podłoża montażowego vector shield za pomocą dappy i przykryj slajdy szkiełkami nakrywkowymi. Nałóż lakier do paznokci, aby zahamować ruchy szkiełek nakrywkowych.

Obrazowanie przekroju tkanki powinno być wykonane przy użyciu mikroskopu konfokalnego z odpowiednimi laserami przy użyciu 63-krotnego obiektywu zanurzonego w oleju dla każdego obrazu przekroju, seryjne przekroje optyczne w odstępach 0,33 mikrona na łącznej głębokości pięciu mikronów, co daje w sumie 15 przekrojów optycznych. Muszą być zobrazowane co najmniej trzy skrawki z każdego zwierzęcia i co najmniej trzy zwierzęta z danego warunku doświadczalnego. Wygeneruj projekcje maksymalnej intensywności z grup trzech kolejnych sekcji, uzyskując pięć projekcji reprezentujących jeden mikron głębokości każda.

Są one oznaczane ilościowo za pomocą obrazu J, jak opisano dla RG Cs ze zmodyfikowanym ROI w celu określenia liczby synaps utworzonych przy braku astrocytów. Immunochemię przeprowadzono na zdysocjowanym rgc potraktowanym podstawowymi pożywkami wzrostowymi przy użyciu przeciwciał przeciwko fagotowi pokazanemu na czerwono i Homerowi pokazanemu na zielono, zgodnie z oczekiwaniami. Obserwuje się bardzo niewiele punktów kolokalizacji synaptycznej w celu określenia wpływu cząsteczek wydzielanych przez astrocyty na liczbę synaps utworzonych in vitro zdysocjowane RG C, które traktowano mysimi pożywkami kondycjonowanymi astrocytami co trzy dni przez łącznie 12 dni po barwieniu.

W tym neuronie widoczne były liczne synapsy, ale wkrótce pokazano je na czerwono. Homer jest pokazany na zielono, zdysocjowane RDC transfekowane cytoplazmatycznym pomidorem TD z ekspresją Lee, traktowano tylko wzrostem podstawowym. Średnie synapsy nie są widoczne.

Pomidor TD jest widoczny na niebiesko, a synapsa na czerwono. Widać bardzo mało sygnału dla markera postsynaptycznego Homera pokazanego na zielono. Kiedy te same komórki są przewlekle leczone pożywką kondycjonowaną astrocytami szczurów, widać wiele synaps.

Pomidor TD jest tutaj na niebiesko, synapsyna na czerwono, a homer na zielono. Pokazano oczyszczony RGC, który został potraktowany pożywką kondycjonowaną przez astrocyty i został wybarwiony pod kątem presynapsy w czerwonych i postsynaptycznych maskach progowych zielonych markerów Homera wygenerowanych za pomocą analizatora nakłucia odpowiadających dwóm obecnym kanałom. Po zidentyfikowaniu punktów kolokalizacji analizator Puncta generuje graficzną reprezentację tych punktów.

Dane liczbowe są dostarczane przez analizator punktowy, który wskazuje liczbę dyskretnych punktów punktowych zidentyfikowanych w obu kanałach i dla punktów kolokalizacji. Dane uzyskane w wyniku analizy tego neuronu ilustrują zdolność cząsteczek wydzielanych przez astrocyty do promowania tworzenia synaps pokazanych tutaj jako test synaps, w którym określono ilościowo kolokalizację pre i postsynaptycznego znakowania immunohistochemicznego, aby wykazać nasilenie tworzenia synaps indukowanych przez astrocyty przez nadekspresję receptora neuronalnego dla ważnej cząsteczki genowej synap wydzielanej przez astrocyty, thrombo spon. Na tym rysunku pokazano średnią liczbę synaps na neuron przewlekle leczony podstawowymi pożywkami wzrostowymi, GM lub pożywkami kondycjonowanymi przez astrocyty.

A-C-M-A-C-M silniej promuje tworzenie synaps w komórkach zwojowych siatkówki z nadekspresją receptora skrzeplinowego spon w porównaniu z komórkami z nadekspresją pustego wektora. Aby określić ilościowo gęstość synaptyczną w górnych górnych przedziałach wzgórka myszy przed i po synaptycznym znakowaniu oddzielnie za pomocą specyficznych dla przedziałów markerów immunohistochemicznych. Jak pokazano tutaj, nastąpił wzrost liczby synaps od siódmego dnia po urodzeniu do P 14.

Ilustruje to wzrost liczby synaps w górnym ulusie w tym oknie rozwojowym. Po opanowaniu, protokół ten można ukończyć w ciągu około dwóch dni w przypadku zdysocjowanych kultur neuronalnych i po około pięciu dniach w przypadku wycinków mózgu od pobrania od zwierzęcia po tej procedurze. Inne metody, takie jak elektrofizjologia i mikroskopia elektronowa, są wykorzystywane do sprawdzenia, czy zmiany liczby synaptycznej odzwierciedlają zmiany zarówno w funkcjonalnych synapsach, jak i ultra strukturalnie normalnych synapsach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować immunohistochemię do swojego eksperymentalnego preparatu w celu ilościowego określenia liczby synaps. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób używać przeciwciał specyficznych dla przedziałów do selektywnego znakowania przedziałów pre i postsynaptycznych. W tym kontekście definiujemy synapsy jako punkty kolokalizacji między sygnałami uzyskanymi z każdego z tych markerów.