Name: Kwantyfikacja synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego określania liczby synaps (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-16T17:30:00.000+00:00
Duration: 18 min 11 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji synaps w kulturach neuronowych i tkankach mózgowych za pomocą immunocytochemii. Technika opiera się na kolokalizacji markerów presynaptycznych i postsynaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wtyczka Puncta Analyzer do programu Image J została napisana przez Barry’ego Warka (obecny adres: Physion Consulting) w laboratorium Bena A. Barresa (Stanford University).
Finansowanie;
<ul>
<li>Fundacja Alfreda P. Sloana</li>
<li>The Esther A. and Joseph Klingenstein Fund, Inc.</li>
<li>Broad Biomedical Research Foundation</li>
<li>Inicjatywa Cure for Huntington s Disease</li>
</ul>

<ol><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1, 791-803 (1988).</li>
<li>Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+signaling+interactions+that+promote+the+survival+and+growth+of+developing+retinal+ganglion+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture.</a> Neuron. 15, 805-819 (1995).</li>
<li>Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabapentin+receptor+alpha2delta-1+is+a+neuronal+thrombospondin+receptor+responsible+for+excitatory+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis.</a> Cell. 139, 380-392 (2009).</li>
<li>Pfrieger, F. W., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+efficacy+enhanced+by+glial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro.</a> Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.</li>
<li>Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+synapse+number+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of synapse number by glia.</a> Science. 291, 657-661 (2001).</li>
<li>Christopherson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondins+are+astrocyte-secreted+proteins+that+promote+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis.</a> Cell. 120, 421-433 (2005).</li>
<li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+and+postnatal+development+of+retinocollicular+projections+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse.</a> J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).</li>
<li>Schmidt, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+retinotopic+connections%3A+selective+stabilization+by+an+activity-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).</li>
<li>Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+changes+in+arborization+patterns+of+murine+retinocollicular+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons.</a> J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).</li>
<li>Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+regulate+inhibitory+synapse+formation+via+Trk-mediated+modulation+of+postsynaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).</li>
<li>Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+secreted+proteins+selectively+increase+hippocampal+GABAergic+length%2C+branching+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Moll.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis.</a> Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Opisany powyżej test synaptyczny został opracowany w kontekście naszych celów eksperymentalnych, w których koncentrujemy się głównie na projekcjach pobudzających RGC, zarówno w oczyszczonej hodowli, jak i w przekrojach mózgu. Przedstawiliśmy tabelę referencyjną zawierającą przeciwciała, które sprawdzają się w znakowaniu synaps pobudzających (Tabela 1).
Niniejszy test synaptyczny można dostosować w celu ilościowego oznaczenia liczby synaps w dowolnej populacji neuronów lub w przypadku innego p...

<table><tbody><tr><td>Presynaptyczne</td><td>Synapsin</td><td>Królik</td><td>Poliklonalne</td></tr><tr><td>Synapsin</td><td>Mysz</td><td>Monoklonalne</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>Bassoon</td><td>Mysz</td><td>Monoklonalne</td><td>Assay Designs</td></tr><tr><td>Bassoon</td><td>Świnka morska</td><td>Poliklonalne</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>Synaptotagmin 1</td><td>Królik</td><td>Poliklonalne</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>Synaptobrevin 2 (C1.69.1)</td><td>Mysz</td><td>Monoklonalne</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>Synaptophysin (C1.7.2)</td><td>Mysz</td><td>Monoklonalne</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>VGlut1</td><td>Mysz</td><td>Monoklonalne</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>VGlut1</td><td>Świnka morska</td><td>Poliklonalne</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>VGlut2</td><td>Świnka morska</td><td>Poliklonalne</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>Postsynaptyczne</td><td>PSD-95 (klon 6G6-1C9)</td><td>Mysz</td><td>Monoklonalne</td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Królik</td><td>Poliklonalne</td><td>Zymed</td></tr><tr><td>Homer</td><td>Mysz</td><td>Monoklonalne</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>Homer</td><td>Szczur</td><td>Poliklonalne</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>Gephyrin</td><td>Królik</td><td>Poliklonalne</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td>Gephyrin</td><td>Mysz</td><td>Monoklonalne</td><td>Synaptic Systems</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1:&lt;/strong&gt; Przedstawia przykłady sprawdzonych markerów pre- i postsynaptycznych, które z powodzeniem wykorzystaliśmy w naszym teście synaptycznym. Należy pamiętać, że nie jest to wyczerpująca lista wszystkich dostępnych markerów. Y = Tak, N = Nie, N.D. = Nie określono.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>poly-d-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Cultrex</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roche Diagnostics Gmbh</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Normalne surowica kozia</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16210</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base (50 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Seryjna albumina wołowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>l-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-1137</td><td></td></tr><tr><td>16% roztwór PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15711</td><td></td></tr><tr><td>Granulowany PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Falcon BD</td><td>35-3047</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciała anty-mysie sprzężone z Alexa</td><td>Invitrogen</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>Szklane laminki 12 mm, nr 0</td><td>Karl Hecht Gmbh</td><td>1105209</td><td></td></tr><tr><td>Szklana laminka nr 1,5 (do skrawków)</td><td>VWR international</td><td>48393241</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>VWR international</td><td>48311-703</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number

Jednym z najważniejszych celów w neuronauce jest zrozumienie sygnałów molekularnych, które sterują wczesnymi etapami formowania się synaps. W związku z tym konieczne stało się opracowanie obiektywnych metod ilościowego określania zmian w łączności synaptycznej. Niniejszy protokół, rozpoczynając od utrwalania próbek, szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronów, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery. Liczbę tych kolokalizacji określa się ilościowo za pomocą wtyczki Puncta Analyzer (autorstwa Bary'ego Warka, dostępna na zapytanie, c.eroglu@cellbio.duke.edu) w ramach oprogramowania analitycznego ImageJ. Opisany w tym protokole test synaptyczny może być zastosowany do dowolnej tkanki nerwowej lub preparatu hodowlanego, dla których dysponuje się selektywnymi markerami presynaptycznymi i postsynaptycznymi. Ten test synaptyczny stanowi wartościowe narzędzie, które może być szeroko wykorzystywane w badaniach nad rozwojem synaps.

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Jednym z najważniejszych celów w neuronauce jest zrozumienie sygnałów molekularnych, które kierują wczesnymi etapami formowania się synaps. W związku z tym stało się ...

Jednym z najważniejszych celów w neuronauce jest zrozumienie sygnałów molekularnych, które sterują wczesnymi etapami tworzenia synaps. W związku z tym niezbędne stało się opracowanie obiektywnych metod ilościowego określania zmian w łączności synaptycznej. Aby określić liczbę synaps w różnych preparatach eksperymentalnych, hodowlane neurony lub preparaty mrożonych przekrojów tkanki mózgowej barwi się selektywnymi markerami presynaptycznymi i postsynaptycznymi w celu znakowania punktów kontaktu synaptycznego między neuronami.Następnie komórki lub tkankę obrazuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, uzyskując obrazy 8-bitowe dla każdego z kanałów odpowiadających dwóm markerom immunohistochemicznym. Obrazy są analizowane przy użyciu programu Image J 1.29 z wtyczką puncta analyzer. Aby określić stopień kolokalizacji markerów presynaptycznych i postsynaptycznych, punkty kolokalizacji mogą zostać wykorzystane do wyznaczenia liczby synaps obecnych w preparacie.Główną zaletą opisanej tutaj techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia elektronowa, jest to, że test synaptyczny umożliwia analizę o znacznie wyższej przepustowości oraz ilościowe określenie liczby

quantifying-synapses-an-immunocytochemistry-based-assay-to-quantify

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Liczenie synaps: metoda oparta na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

Ten film demonstruje obrazowanie na żywych komórkach topologii synaps immunologicznych, badając interakcje między limfocytami T a komórkami nabłonkowymi przenoszącymi antygeny fluorescencyjne. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przemieszczenie czerwonej cytoplazmy i żółte pierścienie błonowe w komórkach śródbłonka, co wskazuje na tworzenie się synaps immunologicznych.

Ocena topologii synaps immunologicznych za pomocą obrazowania żywych komórek

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne wycinka mózgu myszy w celu ilościowego określenia rozkładu określonego białka presynaptycznego. Proces ten polega na blokowaniu miejsc niespecyficznych, zastosowaniu pierwszorzędowych przeciwciał dla białka docelowego i markera referencyjnego, a następnie wtórnym znakowaniu przeciwciał i przeciwbarwieniu jądrowym. Marker referencyjny zapewnia dokładną kwantyfikację, zapewniając spójną linię wyjściową, a dystrybucja białka presynaptycznego...

Kwantyfikacja rozmieszczenia białka presynaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Źródło: McLeod, F., et al. Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia metodę wizualizacji markerów synaptycznych w wycinkach mózgu hipokampa za pomocą konfokalnej analizy immunofluorescencyjnej. Plastry są barwione immunologicznie przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko markerom presynaptycznym i postsynaptycznym, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Oznaczone markery są następnie...

Analiza mikroskopowa synaps w mysich wycinkach hipokampa przy użyciu immunofluorescencji

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Opisujemy optyczny test do recyklingu pęcherzyków synaptycznych (SV) w hodowanych neuronach. Połączenie tego protokołu z podwójną transfekcją w celu ekspresji markera presynaptycznego i białka będącego przedmiotem zainteresowania pozwala nam zlokalizować miejsca presynaptyczne, ich zdolność do recyklingu pęcherzyków synaptycznych i określić rolę białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Test optyczny do recyklingu pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach z nadekspresją białek presynaptycznych

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

DetectSyn to bezstronny, szybki test fluorescencyjny, który mierzy zmiany we względnej liczbie synaps (zaangażowanie pre- i postsynaptyczne) w różnych terapiach lub stanach chorobowych. Technika ta wykorzystuje technikę ligacji zbliżeniowej, która może być stosowana zarówno w hodowanych neuronach, jak i w tkance stałej.

DetectSyn: szybka, bezstronna metoda fluorescencyjna do wykrywania zmian w gęstości synaps

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę kwantyfikacji synaps w kulturach neuronowych i tkankach mózgowych za pomocą immunocytochemii. Technika opiera się na kolokalizacji markerów presynaptycznych i postsynaptycznych.

Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Przeglądaj więcej filmów