Kwantyfikacja rozmieszczenia białka presynaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Weź chemicznie utrwalony wycinek mózgu myszy osadzony w podłożu zawierającym tkanki.

Umyj plasterek buforem, aby usunąć pożywkę.

Dodaj roztwór, który przenika przez błony i blokuje niespecyficzne miejsca wiązania.

Usuń roztwór.

Aby uwidocznić neuronalne białka synaptyczne, inkubuj wycinek z pierwszorzędowymi przeciwciałami.

Przeciwciała te są ukierunkowane na białko presynaptyczne ulegające ekspresji w synapsach określonych regionów mózgu i wszechobecnie wyrażane białko synaptyczne jako marker odniesienia.

Przemyć buforem w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.

Wprowadź przeciwciała drugorzędowe znakowane fluoroforem, które są ukierunkowane na przeciwciała pierwszorzędowe.

Przemyć buforem w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych.

Przeciwbarwić jądra barwnikiem wiążącym DNA.

Umyj z buforem i umieść plasterek za pomocą odpowiedniego medium montażowego.

Wizualizuj plasterek pod mikroskopem konfokalnym.

Oblicz średnie współczynniki intensywności fluorescencji białka docelowego i markera referencyjnego, aby przeanalizować rozkład białka docelowego w różnych regionach mózgu.

Aby przygotować plastry do barwienia immunologicznego, użyj plastikowej pipety, aby usunąć roztwór PB z jednej studzienki bez wciągania wycinków mózgu. Następnie użyj pipety o pojemności 1,000 mikrolitrów, aby dodać 250 mikrolitrów świeżego PB, aby zmyć je z nadmiaru OCT. Powtórz to mycie dla każdego dołka na raz, aby uniknąć wysuszenia plastrów.

Następnie użyj plastikowej pipety, aby usunąć roztwór PB z pierwszego dołka. Użyj pipety o pojemności 1,000 mikrolitrów, aby dodać 250 mikrolitrów buforu blokującego na studzienkę, ponownie działając dobrze do studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej na shakerze przez trzy godziny. Podczas inkubacji w 250 mikrolitrach buforu przeciwciał na studzienkę do probówki reakcyjnej.

Następnie za pomocą pipety o pojemności 2 mikrolitrów dodaj odpowiednią ilość przeciwciała, pipetując je bezpośrednio do roztworu i delikatnie pipetując kilka razy w górę iw dół, aby wymieszać. Następnie należy wymieszać to rozcieńczone przeciwciało, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.

Działa dobrze, usuń bufor blokujący za pomocą plastikowej pipety i dodaj 250 mikrolitrów roztworu przeciwciała pierwotnego na studzienkę. Inkubuj płytkę na shakerze w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia usuń roztwór przeciwciał plastikową pipetą. Umyj plastry 300 mikrolitrami buforu myjącego 1 na studzienkę, trzy razy po 10 minut każde mycie na shakerze w temperaturze pokojowej. Podczas mycia, pracując w ciemności, rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoroforem w probówce reakcyjnej w taki sam sposób, jak poprzednio robiono to z przeciwciałem pierwszorzędowym.

Po zakończeniu mycia usunąć bufor płuczący plastikową pipetą i dodać 250 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał do studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Po zakończeniu inkubacji usunąć roztwór przeciwciała plastikową pipetą. Przemyć sekcje trzykrotnie buforem myjącym 2 w taki sam sposób, jak buforem myjącym 1.

Podczas tego prania rozcieńczyć barwnik DAPI w 0,1 molowym PB, aby uzyskać stężenie od 1 do 2000. Po wyjęciu buforu myjącego z płytki dodać 250 mikrolitrów roztworu DAPI i inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przez 5 minut.

Po usunięciu roztworu DAPI za pomocą plastikowej pipety, użyj pipety o pojemności 1,000 mikrolitrów, aby dodać 500 mikrolitrów 0,1 mola PB na studzienkę. Umieść szkiełko mikroskopowe pod stereoskopem. Użyj cienkiego pędzla, aby dodać trzy oddzielne krople 0,1 mola PB na szkiełko. Za pomocą pędzla umieść jeden plasterek na kroplę na szkiełku, a następnie spłaszcz i ustaw plastry.

Po prawidłowym ułożeniu wszystkich plastrów użyj papierowej chusteczki, aby usunąć nadmiar PB i ostrożnie wysusz, nie susząc całkowicie plastrów. Następnie dodaj 80 mikrolitrów podłoża do osadzania na szkiełku i ostrożnie przykryj je szkiełkiem nakrywkowym, aby osadzić plastry mózgu.

Przykryj szkiełka, aby uniknąć ekspozycji na światło i pozostaw je do wyschnięcia w dygestorium na jedną do dwóch godzin, a następnie przechowuj je w pudełku ze szkiełkami mikroskopowymi w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż będą gotowe do mikroskopii konfokalnej.

Po pobraniu wirtualnych tkanek całego wycinka mózgu dla różnych kanałów, jak opisano w manuskrypcie, załaduj wszystkie pojedyncze kanały dla jednego obrazu na Fidżi, klikając Plik, a następnie Otwórz. Następnie użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby wyznaczyć jedną półkulę w kanale DAPI. Kliknij Edytuj, następnie Zaznaczenie, a następnie utwórz maskę, aby utworzyć maskę wybranego regionu.

Następnie kliknij Analizuj, a następnie Zmierz cząstki, aby określić średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów, upewniając się, że wybrałeś różne kanały, aby określić średnie wartości intensywności fluorescencji dla każdego kanału.

Następnie skopiuj średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów do arkusza kalkulacyjnego. Aby określić średnią intensywność fluorescencji dla pojedynczych kanałów w obszarze zainteresowania, wyznacz obszar za pomocą narzędzia do zaznaczania odręcznego.