Name: Stabilne profilowanie izotopowe pośredniego strumienia metabolicznego w stadium rozwijającym się i dorosłym Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Poznaj metodę profilowania izotopowego w Caenorhabditis elegans do analizy strumienia metabolicznego. Technika ta pozwala nieinwazyjnie monitorować zmiany metaboliczne w glikolizie i cyklu kwasu cytrynowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo finansowana przez National Institutes of Health (K08-DK073545 oraz przyznane przez NICHD stypendium dla nowych badaczy w ramach Intellectual and Developmental Disabilities Research Center), The Philadelphia Foundation oraz University of Pennsylvania McCabe award (M.J.F.), a także przez Tristan Mullen Fund (M.J.F. i M.Y.). Treść opracowania jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne stanowisko National Institutes of Health.

<ol><li>Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHope%2C+IA+%22C.+elegans%3A+A+practical+approach%22">C. elegans: A practical approach</a>. , University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Dingley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+variably+increases+oxidant+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans.</a> Mitochondrion. 10, 125-136 (2010).</li>
<li>Jones, B. N., Gilligan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((o-Phthaldialdehyde+precolumn+derivatization+and+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+of+polypeptide+hydrolysates+and+physiological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chromatography%22%5BJournal%5D)">o-Phthaldialdehyde precolumn derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography of polypeptide hydrolysates and physiological fluids.</a> Journal of chromatography. 266, 471-482 (1983).</li>
<li>Falk, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+pathway+profiling+of+mitochondrial+respiratory+chain+mutants+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic pathway profiling of mitochondrial respiratory chain mutants in C. elegans.</a> Molecular genetics and metabolism. 93, 388-397 (2008).</li>
<li>Yudkoff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vivo+ureagenesis+with+stable+isotopes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+genetics+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">Measuring in vivo ureagenesis with stable isotopes.</a> Molecular genetics and metabolism. 100, Suppl 1. 37-41 (2010).</li>
<li>Tsang, W. Y., Sayles, L. C., Grad, L. I., Pilgrim, D. B., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans+results+in+developmental+arrest+and+increased+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain deficiency in Caenorhabditis elegans results in developmental arrest and increased life span.</a> J Biol Chem. 276, 32240-32246 (2001).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Zastosowanie spektrometrii mas do pomiaru zawartości izotopowej w metabolitach pośrednich pozwala na uzyskanie niezwykle szczegółowego obrazu krytycznych zmian biochemicznych5. W niniejszym opracowaniu przedstawiliśmy szczegółowe protokoły wykorzystania tej wysokoczułej i specyficznej metodologii do oceny przepływu metabolitów pośrednich u genetycznie wszechstronnego zwierzęcia modelowego, C. elegans. Karmienie żywych zwierząt prekursorami metabolicznymi znakowanymi stabilnymi izotopami (takimi jak 13C-glukoza) umożliwia uzyskanie nowej wiedzy na temat przepływu w pośrednich szlakach metabolicznych poprzez pomiar wzbogacenia izotopowego w metabolitach pochodnych. Opracowaliśmy niezawodną metodologię pozwalającą na rzetelną analizę przepływu w glikolizie, metabolizmie pirogronianu oraz cyklu kwasu trójkarboksylowego. Można to osiągnąć zarówno u zwierząt karmionych stabilnymi izotopami od wczesnych stadiów larwalnego rozwoju, jak i począwszy od pomitotycznego okresu dorosłości. Wzbogacenie izotopowe różnych gatunków metabolitów można badać w połączeniu z profilowaniem wolnych aminokwasów z całych nicieni za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej, jak opisano wcześniej4, aby określić bezwzględne wzbogacenie izotopowe różnych gatunków wolnej alaniny, asparaginianu, glutaminianu i glutaminy w organizmie nicienia. Spójne wzorce wzbogacenia izotopowego uzyskuje się podczas pomiaru analitów aminokwasów i kwasów organicznych w alikwotach od 1 000 do 2 000 młodych, synchronicznych dorosłych nicieni. Taka metodologia pozwala na czułe rozróżnienie nieprawidłowego przepływu pośredniego w szczepach mutantów mitochondrialnych z mutacjami w genach jądrowych w stosunku do nicieni typu dzikiego.
Technika ta jest cenna w badaniu zmian strumienia w konkretnych szlakach biochemicznych istotnych dla powszechnych wrodzonych błędów metabolizmu. W szczególności wykorzystanie glukozy znakowanej stabilnym izotopem dostarcza informacji o strumieniu węgla przez centralne szlaki metaboliczne istotne dla chorób mitochondrialnych. Rzeczywiście, nasze dane sugerują, że zastosowanie tej metodologii pozwala na czułe odróżnienie nieprawidłowego strumienia produktów pośrednich w szczepie mutanta podjednostki kompleksu III mitochondriów opartego na genie jądrowym (isp-1(qm150)) w stosunku do nicieni typu dzikiego.
Należy pamiętać, że ponieważ ekspozycja na izotopy trwa od jednego do kilku dni, ilościowo określone wzbogacenie izotopowe reprezentuje wartość wzbogacenia w „stanie stacjonarnym”, a nie mierzalny strumień w określonym przedziale czasu, jaki można by wyznaczyć w modelach komórkowych eksponowanych na izotop przez okres od kilku minut do kilku godzin. Inne potencjalne ograniczenie badania strumienia szlaków metabolicznych w trakcie rozwoju nicieni wiąże się z różną długością rozwoju larwalnego w konkretnych szczepach mutantów. Na przykład wiadomo, że wiele poważnych mutacji mitochondrialnych powoduje zatrzymanie rozwoju na trzecim stadium (L3) larwy6. Zatem analiza wbudowania izotopu wyłącznie u zwierząt, które dożyły wieku dorosłego, może nie być reprezentatywna dla całej populacji mutantów. Metodologia ta mogłaby jednak zostać dostosowana do oceny wbudowania izotopowego w metabolitach pośrednich na konkretnym etapie larwalnym (np. L2), zamiast oczekiwania, aż zwierzęta osiągną stadium dorosłe. Podobnie, zwierzęta, które wchodzą w alternatywne stadium larwalne znane jako dauer, prawdopodobnie wykazują znacznie zmieniony (prawdopodobnie niższy) strumień metaboliczny w porównaniu ze zwierzętami, które przechodzą bezpośrednio przez cztery stadia larwalne. W przyszłości można przeprowadzić badania w celu bezpośredniej oceny wbudowania izotopowego u zwierząt w stadium dauer o różnych podłożach genetycznych. Ekspozycja zwierząt na trwały izotop przez określony czas (tutaj od 24 do 48 godzin), rozpoczynająca się w momencie osiągnięcia przez zwierzęta stadium młodego dorosłego (zgodnie ze szczegółami w Protokole B), eliminuje wpływ zmiennych okresów rozwojowych. Podczas gdy 13C-glukoza pozwala badać jedynie glikolizę, metabolizm pirogronianu i strumień cyklu kwasów trójkarboksylowych, potencjalnie można zastosować inne znaczniki izotopowe do badania strumienia szlaków biochemicznych w innych interesujących obszarach u nicieni. Na przykład 15N-glicyna mogłaby zostać wykorzystana do oceny obrotu aminokwasów u nicieni.
Kolejnym potencjalnym ograniczeniem tego podejścia jest poziom czułości detekcji metabolitów. Nasze doświadczenia sugerują, że do skutecznego ilościowego oznaczenia wbudowania izotopowego za pomocą zastosowanych tutaj metod HPLC oraz GC/MS wymagane jest minimum 500 młodych dorosłych nicieni. Zastosowanie instrumentów o większej czułości, takich jak ultrawydajna chromatografia cieczowa (UPLC), może pozwolić na dalszą redukcję liczby badanych zwierząt, choć przewidujemy, że jest mało prawdopodobne, aby umożliwiło to wiarygodne oznaczanie ilościowe metabolitów i wbudowania izotopowego w poszczególne gatunki metabolitów w przypadku pojedynczych osobników. Badaliśmy populacje nicieni obejmujące 1 000 zwierząt na eksperyment, co w naszym odczuciu pozwalało na wiarygodną detekcję metabolitów o niskiej zawartości w każdym szczepie. Jednak niektóre metabolity, takie jak GABA, mogą być wiarygodnie oznaczone ilościowo jedynie w znacznie większych populacjach nicieni, rzędu 1x106 zwierząt4.
Podsumowując, profilowanie izotopów stabilnych stanowi nieinwazyjne i bezpieczne (niereaktywne radiologicznie) podejście, które od dawna jest wykorzystywane do badania wrodzonych błędów metabolizmu. Zastosowanie tej metodologii w odniesieniu do C. elegans umożliwia nowatorskie badanie in vivo i w czasie rzeczywistym zmian metabolicznych zachodzących w całym organizmie zwierzęcia, które mogą wynikać z poszczególnych zaburzeń genetycznych i/lub ekspozycji na środki farmakologiczne.

<table><tbody><tr><td>S. basal</td><td></td><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; - strona 59</td><td>Protokoły A i B</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8503</td><td>Protokół B</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Protokoły A i C</td></tr><tr><td>K12 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>Protokół B</td></tr><tr><td>Agar NGM</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000.0</td><td>Protokoły A, B i C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C glukoza (uniwersalnie znakowana)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-1396</td><td>Protokoły A i C</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C glukoza (znakowana w pozycjach 1,6)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-2717</td><td>Protokół B</td></tr><tr><td>60% kwas perchlorowy (PCA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MK2766500</td><td>Protokoły A i B</td></tr><tr><td>&amp;#949;-kwas aminokapronowy (standard wewnętrzny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2504</td><td>Protokoły A i B</td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Regis</td><td>270243</td><td>Protokół E</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Regis</td><td>270010</td><td>Protokół E</td></tr><tr><td>Żywica AG 1-X8, 100-200, w formie chlorkowej</td><td>Bio-Rad</td><td>140-1441</td><td>Protokoły A i B (ekstrakcja kwasów organicznych)</td></tr><tr><td>Żywica AG 50W-X8, 100-200, w formie wodorowej</td><td>Bio-Rad</td><td>142-1441</td><td>Protokoły A i B (ekstrakcja aminokwasów)</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8875</td><td>Protokół C</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>Protokół C</td></tr><tr><td>3N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protokół D</td></tr><tr><td>1N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protokół A</td></tr><tr><td>0,1 N HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Protokół D</td></tr><tr><td>4N NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501</td><td>Protokół D</td></tr><tr><td>4N KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Protokoły A i B</td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>Milli Q Biocel</td><td>ZMQA60F01</td><td>Protokół D</td></tr><tr><td>Hel</td><td>Airgas</td><td>24001364</td><td>Protokół C2</td></tr><tr><td>Stereomikroskop SMZ-800 Zoom</td><td>Nikon Instruments</td><td>NI MNA41000</td><td>Protokoły A, B i C</td></tr><tr><td>Miernik pH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S68167</td><td>Protokoły A i B</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa - 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>05-400-93</td><td>Protokoły A i B</td></tr><tr><td>Inkubowany wstrząsacz platformowy</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1324-0004</td><td>Protokół B</td></tr><tr><td>Rotator Mini LabRoller</td><td>Labnet International</td><td>H-5500</td><td>Protokoły A i B</td></tr><tr><td>Tłuczki</td><td>Kontes Corp</td><td>K749520-0090</td><td>Protokoły A i B</td></tr><tr><td>Wiertarka</td><td>Kontes Corp</td><td>K749540-0000</td><td>Protokoły A i B</td></tr><tr><td>Zlewka szklana 1 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-539P</td><td></td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera 1 L</td><td>VWR international</td><td>89000-368</td><td></td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera 25 mL</td><td>VWR international</td><td>89000-356</td><td>Protokół B</td></tr><tr><td>Szklane probówki okrągłodenne 7 ml + gumowy korek</td><td>VWR international</td><td>VT6431</td><td>Protokoły A, B oraz C1, C2</td></tr><tr><td>Szklane probówki okrągłodenne 10 ml + gumowy korek</td><td>VWR international</td><td>VT6430</td><td>Protokół C2</td></tr><tr><td>Probówki z niebieską zakrętką</td><td>Labco</td><td>438B</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe plastikowe probówki 50 ml</td><td>Falcon BD</td><td>14-959-49A</td><td>Wszystkie protokoły</td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td>Protokoły A i B</td></tr><tr><td>Strzykawki (1 mL, 10 mL, 20 mL)</td><td>BD Biosciences</td><td>301025, 301029, 301031</td><td>Protokoły C1 i C2</td></tr><tr><td>Igły 25 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-253-131</td><td>Protokoły C1 i C2</td></tr><tr><td>Kolumny chromatograficzne Poly-Prep</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td>Protokół D</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>VWR international</td><td>14673-043</td><td>Protokół D</td></tr><tr><td>Szalki Petriego 60 mm</td><td>VWR international</td><td>25373-085</td><td>Protokół C</td></tr><tr><td>Komora szklana (odcięte dno kolby 1 L) wyposażona w uszczelniony smarem kurek trójdrożny</td><td>Wykonanie na zamówienie</td><td></td><td>Protokół C</td></tr><tr><td>Optycznie przezroczysta płyta szklana</td><td>Wykonanie na zamówienie</td><td></td><td>Protokół C</td></tr><tr><td>Odparowacz Reacti-Vap III</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>18826</td><td>Protokół D</td></tr><tr><td>Wata</td><td>VWR international</td><td>14224-516</td><td>Protokół D</td></tr><tr><td>Smar do wysokiej próżni</td><td>Dow Corning</td><td>1597418</td><td>Protokół C1</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-18</td><td>Protokół B</td></tr><tr><td>Timer</td><td>ISC Bioexpress</td><td>T-2504-5</td><td>Protokół C</td></tr><tr><td>Spektrometr mas z pomiarem stosunku gazów</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td>Protokół D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Hewlett-Packard</td><td>5980/5971</td><td>Protokół D</td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>6980N/5973N</td><td>Protokół D</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>9010</td><td>Protokół D</td></tr></tbody></table>

stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Stable Isotopic Profiling of Intermediary Metabolic Flux in Developing and Adult Stage Caenorhabditis elegans

Profilowanie stabilnymi izotopami od dawna pozwala na czułe badania skutków metabolicznych mutacji genetycznych i/lub terapii farmakologicznych w modelach komórkowych i ssaczych. W niniejszym opracowaniu opisujemy szczegółowe metody przeprowadzania profilowania stabilnymi izotopami metabolizmu pośredniego oraz strumienia metabolicznego u nicienia Caenorhabditis elegans. Opisano metody profilowania wolnych aminokwasów w całym organizmie nicienia, znakowanego dwutlenku węgla, znakowanych kwasów organicznych oraz znakowanych aminokwasów w zwierzętach poddanych działaniu stabilnych izotopów – albo od wczesnego etapu rozwoju na płytkach agarowych z pożywką wzrostową dla nicieni, albo począwszy od wczesnej dorosłości podczas ekspozycji na różne terapie farmakologiczne w hodowli płynnej. Wolne aminokwasy są ilościowo oznaczane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w alikwotach całych nicieni ekstrahowanych w 4% kwasie nadchlorowym. Jako prekursor stabilnego izotopu wykorzystuje się uniwersalnie znakowaną glukozę 13C lub 1,6-13C2-glukozę, której znakowany węgiel jest śledzony za pomocą spektrometrii mas w dwutlenku węgla (zarówno atmosferycznym, jak i rozpuszczonym), a także w metabolitach wskazujących na strumień poprzez glikolizę, metabolizm pirogronianu i cykl kwasu trójkarboksylowego. Przedstawiono reprezentatywne wyniki, aby zademonstrować wpływ czasu ekspozycji na izotop, różnych protokołów usuwania bakterii oraz alternatywnych metod rozdrabniania nicieni u osobników typu dzikiego, a także względny stopień wbudowania izotopu u nicieni z mutacją kompleksu III mitochondriów (isp-1(qm150)) w stosunku do nicieni typu dzikiego. Zastosowanie profilowania stabilnymi izotopami u żywych nicieni zapewnia nową możliwość badania na poziomie całego organizmu zmian metabolicznych zachodzących w czasie rzeczywistym, wywołanych przez poszczególne zaburzenia genetyczne i/lub terapie farmakologiczne.

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Profilowanie izotopowe metodą trwałych izotopów od dawna umożliwia czułe badania skutków metabolicznych mutacji genetycznych i/lub terapii farmakologicznych w ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest nieinwazyjne monitorowanie w czasie rzeczywistym zmian metabolicznych na poziomie całego organizmu w obrębie glikolizy, metabolizmu pirogronianu oraz cyklu kwasu trójkarboksylowego, wywołanych przez poszczególne szlaki metaboliczne, zmiany genetyczne i/lub leczenie farmakologiczne. Osiąga się to poprzez podawanie izotopów trwałych żywym nicieniom, aby zapewnić wystarczające wzbogacenie izotopowe większej liczby metabolitów, co umożliwia ilościowe określenie zmian genetycznych i/lub farmakologicznych w pośrednich szlakach metabolicznych. W drugim kroku, za pomocą spektrometrii mas stosunków gazowych, mierzy się wbudowanie izotopów w atmosferyczny i rozpuszczony dwutlenek węgla, co pozwala na bardziej bezpośrednią ocenę pośredniego strumienia metabolicznego w krótkich odstępach czasu.Kolejne próbki są poddawane analizie wolnych aminokwasów w całym organizmie nicienia przy użyciu metody HPLC, a także analizie wzbogacenia izotopowego aminokwasów i kwasów organicznych za pomocą GCMS, w celu ilościowego oznaczenia zmian w strumieniu metabolicznym u nicieni. Po ekspozycji na stabilne izotopy uzyskano wyniki wykazujące wpływ różnych czasów ekspozycji na izotopy, usuwania bakterii oraz alternatywnych metod rozbijania nicieni u osobników typu dzikiego, aby zbadać zawartość izotopową w metabolitach pośrednich. Metoda ta może dostarczyć wglądu w metabolizm pośredni.Metodę tę można zastosować również w naszych systemach, takich jak linie komórkowe i tkanki ssaków. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zaobserwowaliśmy powtarzające się nieprawidłowości w analizie wolnych aminokwasów u nicieni przy użyciu HPLC, które sugerowały zaburzenie metabolicznego strumienia produktów pośrednich w pierwotnych zmianach funkcji oddechowych. Aby rozpocząć tę procedurę.Robaki, które były eksponowane na metaboliczny prekursor znakowany izotopem stabilnym, albo podczas rozwoju, albo w wieku dorosłym, zbiera się do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Zazwyczaj rozcieńczamy robaki do stężenia 1000 robaków na jeden mililitr. Do robaków dodaje się 60% kwas perchlorowy zawierający kwas epsilon-aminokapronowy jako standard wewnętrzny, tak aby końcowe stężenie kwasu perchlorowego wynosiło 4%, a standardu wewnętrznego 20 nanomolar.Pozostaw nicienie do osadzenia się pod wpływem grawitacji przez pięć minut, następnie usuń i zachowaj nadsącz w oddzielnej probówce. Następny krok jest jednym z najbardziej krytycznych etapów tej procedury. Przed analizą wolnych metabolitów nicienie muszą zostać całkowicie rozdrobnione poprzez homogenizację. Używając plastikowego homogenizatora i wiertarki elektrycznej, rozcieraj próbki nicieni przez 15 sekund.Potwierdź wizualnie rozbicie nicieni za pomocą mikroskopii świetlnej i w razie potrzeby powtórz ucieranie. Na tym obrazie panele A i B przedstawiają nicienie przed ucieraniem. W przeciwieństwie do paneli C i D, które pokazują nicienie po ucieraniu, przenieś wcześniej zachowany supernatant do 1,5 mililitrowych plastikowych probówek do wirowania z homogenatem nicieni.Wirować próbki przy 2250 RPM i 1300 Gs przez pięć minut. Po wirowaniu przenieść nadsącz do nowej szklanej probówki o pojemności siedmiu mililitrów. Osad zachować do późniejszego wykorzystania w teście stężenia białka.Teraz dodaj cztery normalny wodorotlenek potasu do nadsączu, aż zakres pH próbek wyniesie od siedmiu do ośmiu, a następnie odwiruj. Zneutralizowane próbki w siedmiomililitrowych probówkach szklanych wiruj z prędkością 2 250 RPM (1300 Gs) przez pięć minut. Aby usunąć sole, przenieś nadsącz z każdej próbki do nowej siedmiomililitrowej probówki szklanej. Zneutralizowane próbki można teraz przygotować do oznaczania ilościowego metabolitów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas (GCMS). W przypadku HPLC.Oddziel 50 µL z każdej zneutralizowanej próbki do bezpośredniego wtrysku do HPLC. Ilościowe oznaczenie wolnych aminokwasów przeprowadza się przy użyciu prekolumnowej pochodniowienia aldehydem i detekcji fluorescencyjnej. Zgodnie z wcześniejszym opisem, pozostałe zneutralizowane próbki zostaną poddane ekstrakcji przy użyciu żywicy jonowymiennej do analizy GCMS w celu oznaczenia wzbogacenia izotopowego w aminokwasach i kwasach organicznych, jak pokazano w następnej sekcji.Aby przygotować kuleczki, dodaj 1 N kwas solny oddzielnie do kuleczek G 1 oraz G 50. W zlewkach o pojemności 1 l mieszaj zawartość każdego naczynia przez 30 minut za pomocą mieszadła magnetycznego. Następnie przemyj kuleczki wodą dejonizowaną 10 razy, aż pH wody z przemywania zrówna się z pH wody.Następnie zaprezentujemy naszą metodę przygotowywania niskokosztowych kolumn wykonanych na zamówienie z pipet szklanych. Gotowe kolumny są również dostępne w sprzedaży. Aby przygotować kolumnę, należy za pomocą pęsety włożyć czop bawełniany tuż nad najwęższą część końcówki pipety Pasteura, a następnie zastosować żel G 1 do ekstrakcji kwasów organicznych oraz żel G 50.W celu ekstrakcji aminokwasów napełnić każdą kolumnę do około jednej trzeciej jej wysokości. Jeśli próbka ma już neutralne pH, przed nałożeniem jej na kolumnę AG one nie dodaje się do niej żadnych substancji. Aby przeprowadzić ekstrakcję kwasów organicznych w celu wyodrębnienia aminokwasów, do próbki przed nałożeniem jej na kolumnę AG 50 należy dodać 1 ml 0,1 N kwasu solnego.Następnie nanieś wcześniej przygotowane zneutralizowane próbki na każdą kolumnę. Przemywaj każdą kolumnę 10 razy wodą, aż do uzyskania neutralnego pH popłuczyn. Po zakończeniu przemywania eluuj każdą kolumnę do świeżych, oznakowanych, czteromililitrowych szklanych fiolek na próbki. W celu ekstrakcji kwasów organicznych dodaj trzy mililitry trzech normalnego kwasu solnego do kolumny AG 1.Umożliwia to analizę wzbogacenia izotopowego całkowitej liczby znakowanych węgli spośród gatunków trójwęglowych, czterowęglowych, pięciowęglowych i sześciowęglowych. W celu ekstrakcji aminokwasów należy dodać 3 mL 4 N wodorotlenku amonu do kolumny G 50. Pozwala to na analizę wzbogacenia izotopowego całkowitej liczby znakowanych węgli spośród gatunków trójwęglowych i pięciowęglowych.Po zakończeniu ekstrakcji kwasów organicznych i aminokwasów, umieść fiolki z próbkami w ewaporatorze typu SpeedVac na całą noc, aż całkowicie wyschną. Następnie próbki należy zderywatyzować i przeanalizować za pomocą GCMS, zgodnie ze szczegółami opisanymi w tekście protokołu. Rozpocznij procedurę, przenosząc tysiąc młodych dorosłych nicieni na eksperymentalną płytkę NGM o średnicy 35 mm, zawierającą glukozę z uniwersalnie znakowanym węglem 13 oraz E. coli.Następnie umieść eksperymentalną płytkę NGM bez przykrywki w specjalnej komorze szklanej wyposażonej w szczelny kurek trójdrożny, aby umożliwić precyzyjne pobieranie i wymianę atmosfery. Uszczelnienie w miejscu, w którym optycznie przezroczysta szklana tarcza opiera się o płytkę, pokryj smarem wysokopróżniowym.Uszczelnij komorę za pomocą szklanego krążka. Zapisz czas. Przyjmując ten moment jako czas zero, po 30 minutach pobierz za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml próbkę 10 ml atmosfery z szklanej komory, korzystając z kurka trójdrożnego.Zamknij kurek do komory. Po pobraniu próbki przenieś ją do czerwonej próżniowej rurki szklanej zawierającej 1 ml wodorowęglanu sodu w 0,1 M wodorotlenku sodu. Następnie wstrzyknij 10 ml powietrza do szklanej komory poprzez kurek trójdrożny. Używając strzykawki 20 ml, zamknij kurek do komory. Po ponownym wprowadzeniu atmosfery i przed wznowieniem inkubacji powtórz pobieranie próbek atmosfery z szklanej komory w 60, 90 i 120 minutach.Przeanalizuj te próbki dwutlenku węgla atmosferycznego pod kątem wzbogacenia w znakowany węgiel, używając spektrometru mas stosunków gazów zgodnie z opisem w tekście protokołu; stabilne izotopy zostały dobrze włączone po dwóch godzinach do młodych dorosłych nicieni, co potwierdza pomiar znakowanego węgla w atmosferycznym dwutlenku węgla oraz w rozpuszczonym dwutlenku węgla w organizmach nicieni karmionych żywymi lub naświetlonymi promieniami UV zabitymi bakteriami E. coli szczepu OP 50. Stosunek dwutlenku węgla $^{13}\text{C}$ do dwutlenku węgla $^{12}\text{C}$ był większy w frakcji rozpuszczonego w nicieniach dwutlenku węgla w stosunku do uwolnionego dwutlenku węgla atmosferycznego. Zaobserwowano, że przedłużona ekspozycja na stabilny izotop od okresu larwalnego, a następnie utrzymywanie nicieni na podłożu NGM bez bakterii, zwiększyło wzbogacenie izotopowe wolnego glutaminianu u młodych dorosłych nicieni.Na tym wykresie L1 reprezentuje nicienie karmione glukozą z uniwersalnie znakowanym węglem 13 oraz bakteriami OP50 od stadium larwalnego L1 do stadium młodego dorosłego 959 cell, natomiast YA reprezentuje nicienie karmione glukozą z węglem 13 i bakteriami OP50 przez 48 godzin, poczynając od momentu osiągnięcia pierwszego dnia składania jaj w stadium młodego dorosłego. Oś X wskazuje całkowitą liczbę znakowanych atomów węgla w każdym gatunku glutaminianu, a oś Y wskazuje procent wzbogacenia. Wszystkie zwierzęta zostały oczyszczone z nadmiaru znacznika izotopowego przed dalszym przygotowaniem próbek.W analizach GCMS zielone słupki oznaczają nicienie oczyszczone po ekspozycji izotopowej poprzez karmienie szczepem OP 50 E. coli na płytkach NGM przez dwie godziny przed ekstrakcją PCA. Niebieskie i szare słupki oznaczają nicienie oczyszczone po ekspozycji izotopowej na płytkach NGM bez bakterii odpowiednio przez dwie lub sześć godzin przed ekstrakcją PCA, niezależnie od przebiegu czasu ekspozycji izotopowej. Nie zaobserwowano istotnych różnic w wzbogaceniu izotopowym metabolitów pośrednich w przypadku oczyszczania zwierząt na płytkach przez dwie lub sześć godzin.W obu przebiegach ekspozycji izotopowej zaobserwowano mniejsze wzbogacenie izotopowe w metabolitach pośrednich, gdy zwierzęta były oczyszczane poprzez karmienie nieoznakowanymi bakteriami przez dwie godziny. W związku z tym ustalono, że optymalny protokół oczyszczania dla nicieni hodowanych na płytach NGM z wysiewem bakterii z izotopem polega na oczyszczaniu przez dwie godziny na płytach NGM bez wysiewu, aby zoptymalizować procent wzbogacenia w metabolitach pośrednich. Następnie przeprowadzono inkubację przez 24 godziny w kulturze płynnej z glukozą znakowaną węglem 13 w pozycji sześć, bez dodatku bakterii.Na tej rycinie przedstawiono porównanie próbek nicieni poddanych samej sonikacji oraz sonikacji połączonej z rozcieraniem. Nicienie poddane sonikacji i rozcieraniu wykazały większe wzbogacenie izotopowe niż próbki poddane wyłącznie sonikacji. Ostatecznie żywe nicienie karmiono stabilnym prekursorem izotopowym albo podczas rozwoju od stadium L1 na płytkach, albo począwszy od pierwszego dnia składania jaj jako młode dorosłe osobniki przez 24 godziny w kulturze płynnej. Pozwoliło to na czułą analizę wzbogacenia izotopowego metabolitów wskazujących na przepływ przez glikolizę oraz metabolizm pirogronianu w cyklu kwasów trójkarboksylowych po jego rozwoju.Technika ta utorowała drogę badaniom nad chorobami mitochondrialnymi w celu analizy pośredniego strumienia metabolicznego u C. elegans. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat przeprowadzania stabilnego profilowania izotopowego metabolizmu pośredniego oraz strumienia metabolicznego u nicieni C. elegans.

stable-isotopic-profiling-intermediary-metabolic-flux-developing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Stabilne Profilowanie Izotopowe Przepływu Metabolizmu Pośredniego na Rozwijającym się i Dorosłym Etapcie Caenorhabditis elegans

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Opisujemy zmodyfikowaną ekstrakcję na małą skalę i testy kolorymetryczne mleczanu i pirogronianu u nicieni C. elegans. W przypadku korzystania z komercyjnych zestawów testowych ważny jest techniczny rozwój ich czułości i dokładności. Wytrącanie białek podczas ekstrakcji jest najbardziej krytycznym etapem ilościowego oznaczania metabolitów wewnątrzkomórkowych.

Małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje metodę uprawy Caenorhabditis elegans na dużą skalę na stałych podłożach. Jako alternatywa dla hodowli płynnej, protokół ten pozwala na uzyskanie parametrów o różnych skalach pod uprawą płytkową. Zwiększa to porównywalność wyników poprzez pominięcie różnic morfologicznych i metabolicznych między hodowlą pożywek płynnych i stałych.

Hodowla Caenorhabditis elegans na dużych obszarach na płytkach: przygotowanie próbki do badania zmian metabolicznych w cukrzycy

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

W protokole tym opisano test do ilościowego określenia szybkości karmienia Caenorhabditis elegans w oparciu o pomiar klirensu bakterii w płynnej kulturze.

Kwantyfikacja spożycia pokarmu w Caenorhabditis elegans poprzez pomiar klirensu bakteryjnego

Poznaj metodę profilowania izotopowego w Caenorhabditis elegans do analizy strumienia metabolicznego. Technika ta pozwala nieinwazyjnie monitorować zmiany metaboliczne w glikolizie i cyklu kwasu cytrynowego.

Stabilne profilowanie izotopowe pośredniego strumienia metabolicznego w stadium rozwijającym się i dorosłym Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal

Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Przeglądaj więcej filmów