Stabilne profilowanie izotopowe pośredniego strumienia metabolicznego w stadium rozwijającym się i dorosłym Caenorhabditis elegans

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest nieinwazyjne monitorowanie zmian metabolicznych w czasie rzeczywistym na poziomie całego zwierzęcia w ramach glikolizy, metabolizmu pirogronianu i cyklu kwasów trikarboksylowych, które są spowodowane indywidualnym szlakiem metabolicznym, zmianami genetycznymi i/lub leczeniem farmakologicznym. Osiąga się to poprzez podawanie stabilnych izotopów żywym nicieniom, aby zapewnić wystarczające wzbogacenie izotopowe w więcej metabolitów, aby umożliwić ilościowe określenie zmian genetycznych i/lub farmakologicznych w pośrednich szlakach metabolicznych. Drugim etapem jest inkorporacja izotopowa w atmosferycznym i rozpuszczonym dwutlenku węgla za pomocą spektrometrii mas ze stosunkiem gazów, która zapewnia bardziej bezpośrednią ocenę pośredniego przepływu metabolicznego w krótkich okresach czasu.

Następnie próbki są przetwarzane do analizy całych aminokwasów wolnych od robaków za pomocą HPLC, a także przez wzbogacanie izotopowe w aminokwasy i kwasy organiczne przez GCMS w celu ilościowego określenia zmiany strumienia metabolicznego u nicieni. Po ekspozycji na stabilny izotop uzyskuje się wyniki, które pokazują wpływ zmiennego czasu trwania ekspozycji na izotop, oczyszczania bakteryjnego i alternatywnego rozrywania robaków u robaków typu dzikiego w celu zbadania obfitości izotopów w metabolitach pośrednich. Wojna z metodą może dostarczyć wglądu w żagiel przeciwko pośredniemu metabolizmowi.

Może być również stosowany do naszych systemów, takich jak linie komórkowe i tkanki ssaków. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaobserwowaliśmy spójne nieprawidłowości w analizie wolnych aminokwasów robaków za pomocą HPLC, które sugerowały upośledzony pośredni przepływ metaboliczny w funkcji pierwotnych zmian oddechowych. Aby rozpocząć tę procedurę.

Robaki, które zostały wystawione na działanie stabilnego prekursora metabolicznego znakowanego izotopem podczas rozwoju lub w wieku dorosłym, zbiera się w 1,5 mililitrowej plastikowej probówce wirówkowej. Zwykle rozcieńczamy robaki do stężenia 1000 robaków na jeden mililitr. Dodać 60% na kwas chlorowy zawierający kwas epsilon aminocapronowy jako wzorzec wewnętrzny do robaków do końcowego stężenia 4% na kwas chlorowy i 20 nanomolowych wzorca wewnętrznego.

Pozwól robakowi osiąść grawitacyjnie przez pięć minut, a następnie usuń i zachowaj supernatant w innej probówce. Następny krok jest jednym z najbardziej krytycznych aspektów tej procedury. Robaki muszą zostać całkowicie rozbite przez badanie przesiewowe przed analizą wolnych metabolitów Za pomocą plastikowego homogenizatora i wiertarki z napędem elektrycznym miel próbki robaków przez 15 sekund.

Wizualnie potwierdź rozerwanie robaków za pomocą mikroskopii świetlnej i powtórz mielenie, jeśli to konieczne. Na tym zdjęciu panele A i B pokazują robaki przed zmieleniem. W przeciwieństwie do paneli C i D, które pokazują robaki, po zmieleniu przenieś wcześniej zapisany supernatant do 1,5 mililitrowych plastikowych probówek wirówkowych za pomocą wirówki ślimakowej Homogenate.

Próbki przy 2 250 obr./min 1300 G przez pięć minut. Po odwirowaniu przenieść supernatant do świeżej siedmiomililitrowej szklanej probówki. Zachowaj osad do późniejszego wykorzystania w teście stężenia białka.

Teraz dodaj cztery normalne wodorotlenki potasu do SUPERNAT, aż zakres pH próbek wyniesie od siedmiu do ośmiu wirówek. Zneutralizowane próbki w siedmiomililitrowych szklanych probówkach przy 2 250 obr./min 1300 G przez pięć minut Aby usunąć sole, przenieś supernatant z każdej próbki do świeżej siedmiomililitrowej szklanej probówki. Zneutralizowane próbki można teraz przygotować do ilościowego oznaczania metabolitów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub HPLC i chromatografii gazowej, spektrometrii mas lub GCMS dla HPLC.

Oddzielić 50 mikrolitrów każdej zobojętnionej próbki do bezpośredniego wstrzyknięcia do HPLC. Ilościowe oznaczanie wolnych aminokwasów przeprowadza się za pomocą dekwityzacji precal z aldehydem al i detekcją fluorescencyjną. Jak opisano wcześniej, pozostałe zneutralizowane próbki zostaną poddane ekstrakcji przy użyciu żywicy jonowymiennej dla GCMS w celu określenia wzbogacenia izotopowego w aminokwasy i kwasy organiczne, jak pokazano w następnej sekcji.

Aby przygotować kulki, dodaj jeden zwykły kwas solny do kulek G i G 50 osobno. W jednolitrowych zlewkach mieszać każdą kolbę przez 30 minut z mieszadłem magnetycznym. Następnie umyj koraliki wodą dejonizowaną 10 razy, aż pH popłuczyn zrówna się z pH wody.

Następnie pokażemy naszą metodę przygotowania niestandardowych tanich kolumn przy użyciu szklanych pipet. Gotowe kolumny są również dostępne na rynku. Aby przygotować kolumnę, za pomocą kleszczyków włóż bawełnianą zatyczkę tuż nad najwęższą częścią końcówki pipety pastwiskowej, użyj koralików G one do ekstrakcji kwasów organicznych i koralików G 50.

W celu ekstrakcji aminokwasów wypełnij każdą kolumnę do około jednej trzeciej wysokości kolumny. Jeśli próbka ma już neutralne pH, nic nie dodaje się do próbki przed nałożeniem jej do jednej kolumny AG. Aby wyekstrahować kwasy organiczne w celu ekstrakcji aminokwasów, dodaj jeden mililitr 0,1 zwykłego kwasu solnego do próbki przed nałożeniem jej do kolumny AG 50.

Teraz nanieść wcześniej przygotowane zneutralizowane próbki do każdej kolumny. Umyj każdą kolumnę 10 razy wodą, aż płukanie będzie neutralne. Po zakończeniu mycia eluować każdą kolumnę do świeżo oznakowanych czteromililitrowych szklanych fiolek na próbki Do ekstrakcji kwasów organicznych dodaj trzy mililitry trzech normalnych kwasów solnych do jednej kolumny AG.

Pozwala to na analizę wzbogacenia izotopów w całkowitą liczbę znakowanych atomów węgla wśród trzech gatunków węgla, czterech gatunków węgla, pięciu gatunków węgla i sześciu rodzajów węgla. W celu ekstrakcji aminokwasów dodaj trzy mililitry czterech normalnych wodorotlenków amonu do kolumny G 50. Pozwala to na analizę wzbogacenia izotopów w całkowitą liczbę znakowanych atomów węgla wśród trzech gatunków węgla i pięciu rodzajów węgla.

Po zakończeniu ekstrakcji zarówno kwasami organicznymi, jak i aminokwasami, umieść fiolki z próbkami w reaktywnym parowniku na noc, aż wyschną. Próbki są następnie sortowane i analizowane przez GCMS zgodnie z opisem w tekście protokołu. Rozpocznij tę procedurę od przeniesienia tysiąca młodych dorosłych robaków na eksperymentalną 35-milimetrową płytkę agri NGM zawierającą uniwersalnie znakowany węgiel, 13 glukozę i e. coli.

Następnie umieść eksperymentalną płytkę NGM bez jej osłony. W niestandardowej szklanej komorze wyposażonej w dobrze uszczelniony trójdrożny kurek odcinający, który umożliwia precyzyjne pobieranie próbek atmosfery i wymianę. Przykryj uszczelkę w miejscu, w którym optycznie przezroczysta szklana tarcza znajduje się na płycie, smarem o wysokiej próżni.

Uszczelnij komorę szklanym dyskiem. Nagraj czas. Jako czas zerowy, 30 minut później, użyj 20-mililitrowej strzykawki, aby pobrać 10 mililitrów atmosfery ze szklanej komory za pomocą trójdrożnego kurka odcinającego.

Zamknąć kurek odcinający do komory Po pobraniu próbek przenieść próbkę do czerwonej szklanej rurki próżniowej zawierającej jeden mililitr wodorowęglanu sodu w 0,1 molowym wodorotlenku sodu. Następnie wstrzyknij 10 mililitrów powietrza do szklanej komory przez trójdrożny kurek odcinający. Za pomocą strzykawki o pojemności 20 mililitrów zamknąć kurek odcinający do komory Po ponownym wstrzyknięciu atmosfery i przed wznowieniem inkubacji powtórzyć pobieranie próbek atmosfery ze szklanej komory po 60, 90 i 120 minutach.

Analizuj te atmosferyczne próbki dwutlenku węgla pod kątem znakowanego wzbogacenia w węgiel za pomocą spektrometru masowego proporcji gazów, jak opisano w tekście Protokołu, stabilne izotopy są dobrze włączane po dwóch godzinach do młodych dorosłych robaków, o czym świadczy znakowany węgiel mierzony w atmosferycznym dwutlenku węgla i rozpuszczony ditlenek węgla robaków u robaków karmionych żywymi lub napromieniowanymi promieniowaniem UV zabitych OP 50 e coli. Stosunek dwutlenku węgla 13 do dwutlenku węgla węgla 12 był większy we frakcji dwutlenku węgla rozpuszczonego robaka w stosunku do uwolnionego dwutlenku węgla w atmosferze. Zaobserwowano, że długotrwała ekspozycja na stabilny izotop z okresu larwalnego, a następnie usunięcie robaków na NGM Aate bez bakterii, zwiększyło wzbogacenie izotopowe w wolny glutaminian u młodych dorosłych robaków.

Na tym wykresie L one reprezentuje robaki karmione powszechnie znakowaną glukozą węgla 13 i bakteriami OP 50 od stadium larwalnego L one do stadium młodego dorosłego 959 komórek YA reprezentuje robaki karmione glukozą węgla 13 i bakteriami OP 50 przez 48 godzin, począwszy od osiągnięcia pierwszego dnia składania jaj przez młode dorosłe stadium. Oś x wskazuje całkowitą liczbę znakowanych atomów węgla w każdym gatunku glutaminianu, a oś Y wskazuje procentowe wzbogacenie. Wszystkie zwierzęta zostały oczyszczone z nadmiaru etykiety izotopowej przed przygotowaniem próbki.

W przypadku analiz GCMS zielone paski wskazują robaki usunięte po ekspozycji na izotopy poprzez karmienie OP 50 E coli na płytkach NGM przez dwie godziny przed ekstrakcją PCA. Niebieskie i szare paski wskazują robaki usunięte po ekspozycji na izotopy na płytkach NGM bez bakterii odpowiednio przez dwie lub sześć godzin przed ekstrakcją PCA, niezależnie od przebiegu czasu ekspozycji izotopowej. Nie zaobserwowano istotnej różnicy we wzbogaceniu izotopowym w metabolity pośrednie, gdy zwierzęta były oczyszczane na płytkach przez dwie lub sześć godzin.

W obu cyklach ekspozycji izotopowej zaobserwowano mniejsze wzbogacenie izotopowe w metabolitach pośrednich, gdy zwierzęta były usuwane przez karmienie nieoznakowanymi bakteriami przez dwie godziny. W związku z tym optymalny protokół usuwania dla robaków hodowanych na płytkach N GM rozprzestrzeniających się bakteryjnie z izotopem został określony jako oczyszczanie przez dwie godziny na nierozsianych płytkach NGM, aby zoptymalizować procentowe wzbogacenie w metabolity pośrednie. Po leczeniu przez 24 godziny w płynnej kulturze z jedną sześciowęglową 13-glukozą bez bakterii.

Porównano próbki robaków zakłócone przez samą sonikację lub sonikację z mieleniem, jak pokazano na tym rysunku. Robaki zakłócone przez Sonikację i mielenie miały większe wzbogacenie izotopowe niż próbki zakłócone tylko przez Sonikację, ostatecznie karmiąc żywe robaki stabilnym prekursorem izotopowym albo podczas rozwoju od L jednego etapu na płytkach, albo rozpoczynając się pierwszego dnia jaja, składając jako młode dorosłe przez 24 godziny w płynnej kulturze. Umożliwiają czułą analizę wzbogacenia izotopowego metabolitów wskazujących na przepływ w wyniku glikolizy, metabolizm pirogronianu w cyklu kwasów trikarboksylowych po jego rozwoju.

Technika ta utorowała drogę chorobom mitochondrialnym, naukowcy badają pośredni przepływ metaboliczny w morskiej elegancji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać stabilny izotop, profilowanie pośredniego metabolizmu i strumienia metabolicznego u nicieni, elegancja.