Analiza pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu kriosekcji ciał embrionalnych

Część pierwsza, Wprowadzenie. Cześć, mam na imię Rafael. Odbywam staż podoktorski w Professor Stevens Hans Lab na Uniwersytecie Federalnym w Rio de Janeiro w Brazylii.

Cześć, nazywam się Ismail. Jestem adiunktem, profesorem zwyczajnym. W tym filmie pokażemy, jak przygotować przezroczyste sekcje ciał Androida.

Więc zacznijmy. Część druga, materiały i wyposażenie. Do tej procedury będziemy potrzebować podłoża do zatapiania zamrożonych próbek.

4% roztwór aldehydu Paraform do utrwalania komórek, roztwory sacharozy do krioochrony. Igła z lekko wygiętą końcówką, mikroskop stereoskopowy dla lepszej wizualizacji EBS oraz shaker. Część trzecia.

Tutaj ludzkie ciała embrionów są hodowane na nieprzylegających płytkach hodowlanych. Za pomocą pipety grupujemy wszystkie ciała zarodków jak najbliżej siebie, aby przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. EBS są starannie zbierane i przenoszone do probówki.

Ważne jest, aby zebrać wszystkie ebs, ponieważ nie ma dużej ilości materiału Po zdekantacji EBS pożywki hodowlane są ostrożnie odrzucane. Powinieneś być w stanie zobaczyć granulkę na dnie tuby. Teraz możemy przejść do procedury utrwalania.

EBS zostanie utrwalony w 4% roztworze aldehydu Paraform w PBS lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Ważne jest, aby ponownie zawiesić osad roztworem PFA. EBS są następnie utrwalane w roztworze utrwalającym przez 30 minut.

Po utrwaleniu roztwór PFA jest ostrożnie usuwany. Uważając, aby nie zawiesić EBS przez Resus i nie zastąpić go 10% roztworem sacharozy w PBS w celu zainicjowania krioochrony ebs, materiał jest przechowywany w tym roztworze przez 30 minut. Następnie ostrożnie usuwamy 10% roztwór sacharozy i ponownie zawieszamy EBS w 20% roztworze sacharozy.

Po raz kolejny EBS są przechowywane przez 30 minut w tym roztworze. Na koniec 20% roztwór sacharozy jest usuwany i zastępowany 30% roztworem sacharozy w PBS, gdzie jest przechowywany przez kolejne 30 minut. Teraz możemy przejść do orientacji i blokowania ebs.

W naszym laboratorium używamy pustych otoczek kapsułek jako form. W celu zablokowania ebs ważne jest, aby pokryć wewnętrzne ścianki końcówki roztworem sacharozy przed zebraniem ebs. Teraz możemy ostrożnie zebrać EBS i poczekać, aż zdekantują się na dno końcówki.

Następnie EBS są umieszczane w środku bloku. To powinna być ostateczna pozycja EBS wewnątrz bloku. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego i cienkiej końcówki zbieramy i usuwamy jak najwięcej roztworu sacharozy.

Zawsze uważaj, aby nie zebrać ebs. Za pomocą igły z lekko wygiętą końcówką wszystkie EBS są umieszczane w środku bloku. Na koniec pozostały roztwór sacharozy zbiera się za pomocą kawałków bibuły filtracyjnej.

Specyficzne umiejscowienie EBS w bloku jest bardzo ważne dla uzyskania dobrej jakości plastrów. Oto przykład złego umiejscowienia EB wewnątrz skorupy. Po ustawieniu EBS i usunięciu roztworu sacharozy, powłokę wypełnia się OCT, zaczynając od krawędzi, zawsze uważając, aby nie zawiesić ebs przez Resus.

Pozostałe pęcherzyki usuwa się za pomocą pipety, a muszle miesza się przez 15 minut. Po agitacji. Blok OCT jest zamrażany w suchym lodzie.

W tym momencie możesz albo przechowywać blok zawinięty w folię aluminiową w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy, albo przejść do kriostatu Część czwarta, Cięcie. Do wykonania sekcji kriogenicznych potrzebne będzie jednorazowe lub stałe ostrze, szkiełka szklane OCT i poli L poddane obróbce lizyny. Blok OCT wyjmuje się z zamrażarki i trzyma w kriostacie, aż osiągnie minus 20 stopni Celsjusza.

Blok jest następnie umieszczany na stojaku i wyrównywany równolegle do krawędzi ostrza. Próbki EB są znacznie mniejsze niż większość innych próbek tkanek, dlatego bardzo ważne jest, aby mieć pewność, że cała powierzchnia bloku styka się z ostrzem w tym samym czasie, minimalizując w ten sposób straty materiału. Po ustawieniu blok jest cięty na 10-mikrometrowe plastry, które są zbierane bezpośrednio na szkiełka podstawowe.

Szkiełka mogą być przechowywane, najlepiej w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza, lub mogą być używane tego samego dnia. Materiał może być barwiony do celów immunohistochemicznych lub immunofluorescencyjnych. Konkluzja. Opisana tutaj metoda zapewnia rozsądnie tani i łatwy do naśladowania protokół uzyskiwania cienkich skriostatów ciał zarodków rozwiniętych zarówno z ludzkich linii komórek macierzystych H 9, jak i mysich US P one.

Powstałe krioskrawki mogą być wykorzystywane w wielu różnych procedurach w celu analizy ekspresji białek lub morfologii EB.