Name: Analiza pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu kriosekcji ciał embrionalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Poznaj metodę kriosekcji ciał embrionalnych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Technika ta umożliwia zachowanie struktury tkanek i szczegółową analizę procesów embriogenezy na poziomie komórkowym oraz molekularnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) oraz Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Jesteśmy wdzięczni Brunie S. Paulsen i Aline M. Fernandes za obrazy EB.

1. Fixacja i kriokonserwacja
Pluripotencjalne komórki macierzyste hodowano na zarodkowych fibroblastach mysich (MEF) inaktywowanych mitomycyną C i utrzymywano w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej o 20% zamiennika surowicy knockout (KSR) oraz 8ng/ mL czynnika wzrostu fibroblastów (FGF-2). W celu indukcji tworzenia ciałek zarodkowych (EB) komórki H9 przeniesiono do naczyń nieprzylegających i hodowano przez 7 dni w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej o 15% KSR 8. 
Uwaga (!): Technikę tę można zastosować w przypadku ciałek EB pochodzących z dowolnych embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.
<ol>
	<li>Zbierz ciała embroidalne (EB) z naczynia hodowlanego za pomocą pipety.</li>
	<li>Przenieś EB do stożkowej probówki o pojemności 15 mL i poczekaj, aż materiał opadnie na dno probówki.</li>
	<li>Usuń medium i utrwal EB w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) w buforze PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Uwaga (!): W przypadku hybrydyzacji in situ należy przeprowadzić odzyskiwanie antygenów, aby uniknąć reakcji sieciowania z przeciwciałami wynikającej z zastosowania PFA6,7.</li>
	<li>Usuń roztwór PFA i przemyj materiał buforem PBS przez 5 min.</li>
	<li>EB należy umieścić w szeregu rozcieńczeń roztworów sacharozy w buforze PBS (kolejno 10, 20 i 30%) w temperaturze 25-28°C, przy czym każdy roztwór musi być wymieniany co 30 min. Materiał można następnie przechowywać w 30% roztworze sacharozy w temperaturze 4°C aż do etapu zatapiania w OCT.</li>
</ol>
2. Osadzanie, orientacja i zamrażanie tkanek
<ol start="6">
	<li>Ostrożnie pobierz ciała embrioidalne (EB) z probówki. Odlej jak największą ilość roztworu sacharozy. Uwaga (!): Przed pobieraniem EB ważne jest zwilżenie wewnętrznej ścianki końcówki pipety roztworem sacharozy. Ta procedura pozwala zapobiec przywieraniu EB do końcówki.</li>
	<li>Umieść EB w formie i usuń pozostały roztwór sacharozy za pomocą papieru filtracyjnego. Uwaga (!): Ważne jest, aby nie wypełniać formy zbyt dużą ilością EB, aby uniknąć ich nakładania się na siebie.</li>
	<li>Powoli wypełnij formę OCT, dbając o to, aby nie resuspender EB. Następnie umieść wszystkie EB w centrum formy i usuń pęcherzyki powietrza za pomocą pipety.</li>
	<li>Delikatnie mieszaj przez 15 minut.</li>
	<li>Otocz formę kruszonym suchym lodem, aby zamrozić próbkę. OCT powinno zostać całkowicie zamrożone. Na tym etapie bloki można przechowywać w temperaturze -70°C przez co najmniej rok.</li>
</ol>
3. Technika kriosekcjonowania
<ol start="11">
	<li>Wyjąć zamrożony blok z temperatury -70°C i umieścić go w kriostacie uprzednio schłodzonym do temperatury od -18 do -21 °C. Uwaga (!): Temperatury spoza tego zakresu mogą powodować problemy takie jak zwijanie się, topnienie lub pękanie skrawków.</li>
	<li>Odczepić blok OCT od formy i umieścić go w uchwycie kriostatu, dodając więcej OCT.</li>
	<li>Ważne jest prawidłowe zorientowanie bloku i ustawienie go równolegle do krawędzi noża. Uwaga(!): Ponieważ EB są mniejsze niż inne próbki tkanek, ten krok jest niezwykle istotny w celu zminimalizowania utraty materiału.</li>
	<li>Bloki OCT należy skrawać powierzchownie, aż do uzyskania płaszczyzny powierzchni. Należy wykonać cienkie przekroje (10μm) próbki tkanki i nanieść je na szkiełka przedmiotowe uprzednio pokryte 200 mg/mL poli-L-lizyną (10 μL na szkiełko) 9,10. Uwaga(!): Aby uniknąć rozdarć skrawków, należy zwrócić uwagę na ewentualne uszkodzenia noża.</li>
	<li>Wszystkie skrawki powinny być suszone na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie wykorzystane lub przechowywane w -70°C do czasu użycia.</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-117 (1998).</li>
<li>Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., Eden, A., Yanuka, O., Amit, M., Soreq, H., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6, 88-95 (2000).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+embryoid+body+formation%3A+in+vitro+differentiation+system+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells.</a> J Biosci Bioeng. 103, 389-398 (2007).</li>
<li>Conley, B. J., Young, J. C., Trounson, A. O., Mollard, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+propagation+and+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation propagation and differentiation of human embryonic stem cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36, 555-567 (2004).</li>
<li>Moon, I. S., Cho, S. J., Jin, I., Walikonis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+combined+fluorescence+in+situ+hybridization+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">A simple method for combined fluorescence in situ hybridization and immunocytochemistry.</a> Mol Cells. 24, 76-82 (2007).</li>
<li>Daneshtalab, N., Doré, J. J., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+Procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 127-135 (2009).</li>
<li>Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+for+immunohistochemical+reactions+in+routinely+processed+paraffin+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections.</a> Methods Mol Biol. , 588-5103 (2010).</li>
<li>Nones, J., Spohr, T. C., Furtado, D. R., Sartore, R. C., Paulsen, B. S., Guimarães, M. Z., Rehen, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+modulate+cell+survival+in+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids modulate cell survival in embryoid bodies.</a> Cell Biol Int. 12, 399-408 (2010).</li>
<li>Huang, W. M., Gibson, S. J., Facer, P., Gu, J., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+section+adhesion+for+immunocytochemistry+using+high+molecular+weight+polymers+of+L-lysine+as+a+slide+coating%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved section adhesion for immunocytochemistry using high molecular weight polymers of L-lysine as a slide coating.</a> Histochemistry. 77, 275-279 (1983).</li>
<li>Kuenzi, M. J., Sherwood, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+specific+relaxin-binding+cells+in+thecervix%2C+mammary+glands%2C+and+nipples+of+pregnant+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of specific relaxin-binding cells in thecervix, mammary glands, and nipples of pregnant rats.</a> Endocrinology. 136, 1367-1373 (1995).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisana tutaj metoda przedstawia prosty do zastosowania protokół uzyskiwania cienkich skrawków kriostatowych ciał embrionalnych utrwalonych w PFA, które są przydatne do analiz immunofluorescencyjnych oraz hybrydyzacji in situ. Uzyskane skrawki kriostatowe umożliwiają badanie aspektów komórkowych i molekularnych różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, przy jednoczesnym zachowaniu ich struktury i organizacji jako agregatów.

<table><tbody><tr><td>D(+) sacharoza</td><td>Odczynnik</td><td>Vetec</td><td>228</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Odczynnik</td><td>Rieden-de Ha&amp;#235;n</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>roztwór PBS</td><td>Odczynnik</td><td>LGC Biotechnology</td><td>13-30259.05</td><td></td></tr><tr><td>Hydrobromian poli-L-lizyny</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td>200 mg/ml w wodzie</td></tr><tr><td>Compound Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Odczynnik</td><td>Sakura Finetek</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór sacharozy</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td>10% (w/v) roztwór sacharozy w PBS</td></tr><tr><td>Roztwór sacharozy</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td>20% (w/v) roztwór sacharozy w PBS</td></tr><tr><td>Roztwór sacharozy</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td>30% (w/v) roztwór sacharozy w PBS</td></tr><tr><td>Probówka stożkowa</td><td>Narzędzie</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td>probówka stożkowa 15 ml</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem</td><td>Narzędzie</td><td>Biomikser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Narzędzie</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>Forma do platformy OCT</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td>Platforma z formy plastikowej</td></tr></tbody></table>

analiza pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem krioprzesieków ciałek zarodkowych

Analysis of Pluripotent Stem Cells by using Cryosections of Embryoid Bodies

Embrionalne komórki macierzyste (ES) to komórki pluripotencjalne pochodzące z wewnętrznej masy komórkowej wczesnych zarodków ssaków w stadium blastocysty 1. Kluczowym etapem różnicowania komórek ES jest tworzenie agregatów w postaci ciałek zarodkowych (EB) 2, 3. Formowanie EB opiera się na spontanicznej agregacji, gdy komórki ES są hodowane na płytkach nieprzylepnych. Trójwymiarowe EB odwzorowują wiele aspektów wczesnej embriogenezy ssaków i różnicują się w trzy warstwy zarodkowe: ektodermę, mezodermę i endodermę 4.
Immunofluorescencja i hybrydyzacja in situ są powszechnie stosowanymi technikami wykrywania białek docelowych oraz mRNA obecnych w komórkach przekroju tkankowego 5, 6, 7. Przedstawiamy tutaj prostą technikę przygotowania wysokiej jakości krio-przekrojów ciał embrionalnych. Podejście to opiera się na orientacji przestrzennej ciał embrionalnych (EB) podczas zatapiania w OCT, a następnie na technice krio-sekcjowania. Otrzymane przekroje mogą być poddawane szerokiej gamie procedur analitycznych w celu charakterystyki populacji komórek zawierających określone białka, RNA lub DNA. W związku z tym, przygotowanie krio-przekrojów EB (10μm) stanowi niezbędne narzędzie dla analiz barwień histologicznych (np. hematoksyliną i eozyną, DAPI), immunofluorescencji (np. Oct4, nestina) lub hybrydyzacji in situ. Technika ta może również pomóc w zrozumieniu aspektów embriogenezy w odniesieniu do zachowania trójwymiarowej sferycznej struktury EB.

Pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane w zawiesinie różnicują się w ciała embrionalne (EB). W niniejszym materiale demonstrujemy, jak uzyskać wysokiej jakości krioprzekroje EB, które są przydatne do badania komórkowych i molekularnych aspektów embriogenezy, przy jednoczesnym zachowaniu ich organizacji w formie agregatów.

Analiza pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem krioprzesieków ciałek zarodkowych

Komórki macierzyste zarodkowe (ES) to komórki pluripotencjalne pochodzące z wewnętrznej masy komórkowej wczesnych embrionów ssaków na etapie blastocysty 1. Kluczowym etapem w...

Część pierwsza, Wprowadzenie. Cześć, nazywam się Rafael. Jestem pracownikiem postdoktorem w laboratorium profesora Stevensa Hansa na Federalnym Uniwersytecie w Rio de Janeiro w Brazylii.Cześć, nazywam się Ismail. Jestem asystentem naukowym oraz profesorem. W tym filmie pokażemy, jak przygotować przejrzyste przekroje ciał Android.Zacznijmy zatem. Część druga: materiały i sprzęt. Do przeprowadzenia tej procedury będziemy potrzebować medium do zatapiania próbek mrożonych.4% roztwór paraformaldehydu do fiksacji komórek, roztwory sacharozy do krioprotekcji. Igła z lekko zagiętym końcem, stereomikroskop do lepszej wizualizacji EBS oraz wytrząsarka. Część trzecia.Tutaj ciała zaplastrykowane ludzkiego zarodka są hodowane na płytkach do hodowli nieadherentnych. Za pomocą pipety grupujemy wszystkie ciała zaplastrykowane jak najbliżej siebie, aby przenieść je do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml. EBS są ostrożnie zbierane i przenoszone do probówki.Ważne jest zebranie wszystkich ciał inkluzyjnych (ebs), ponieważ ilość materiału jest niewielka. Po zdekantowaniu EBS ostrożnie usuwa się pożywkę hodowlaną. Na dnie probówki powinien być widoczny osad. Teraz można przejść do procedury fiksacji

analysis-pluripotent-stem-cells-using-cryosections-embryoid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza komórek macierzystych wielopotencjalnych poprzez stosowanie kriosekcji ciał zarodkowych

Zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy podczas rozwoju. Stwierdziliśmy, że macierzyste komórki krwiotwórcze (HSCs) są zarówno generowane, jak i powielane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. W niniejszej pracy opisujemy techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji i wizualizacji HSCs w łożysku myszy.

Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

Immunocytochemiczne barwienie w zawiesinie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) pod kątem markerów powierzchniowych komórek (SSEA-3/SSEA-4) zostało przeprowadzone z wykorzystaniem własnego urządzenia do cytocentryfugacji w celu stworzenia monowarstwy komórek do obserwacji i kwantyfikacji.

Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem własnoręcznie wykonanego urządzenia do cytocentryfugacji

Ten film demonstruje test do generowania organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ludzkie komórki iPS są indukowane do tworzenia ciał embrionalnych (EB). EB są hodowane na rusztowaniu polimerowym przy użyciu pożywki indukcyjnej, co sprzyja różnicowaniu się w nerwowe komórki macierzyste, komórki progenitorowe i niedojrzałe neurony. Na koniec EB są osadzane w matrycy i przenoszone do pożywki podtrzymującej w celu tworzenia organoidów mózgowych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Ten film demonstruje metodę generowania in vitro nerwowych komórek progenitorowych (NPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). MESC są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia ciał embrionalnych (EB), które są następnie kierowane do różnicowania się w NPC poprzez traktowanie kwasem retinowym w kulturze adherentnej.

Technika generowania nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Ten protokół przedstawia metodę przeprowadzania ilościowej, jednokomórkowej analizy in situ ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii u mysich zarodków przedimplantacyjnych. Opisano procedury niezbędne do pobierania blastocyst, wykrywania białek metodą immunofluorescencyjną w całości montowanej, obrazowania próbek pod mikroskopem konfokalnym oraz segmentacji jądrowej i analizy obrazu.

Analiza ilościowa ekspresji białek w celu zbadania specyfikacji linii w zarodkach myszy przed implantacją

Opisujemy technikę wykorzystania mysich embrionalnych komórek macierzystych do generowania dwu- lub trójwymiarowych ciał embrionalnych. Następnie wyjaśniamy, jak indukować różnicowanie neuronalne komórek ciała zarodka za pomocą kwasu retinowego i jak analizować ich stan różnicowania za pomocą immunofluorescencji markerów komórek progenitorowych i immunoblottingu.

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Tutaj przedstawiamy protokół rozwoju trójwymiarowego (3-D) systemu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) o nazwie surowica wolnego od embrionów (SFEB). Ten model 3D może być używany jak organotypowa kultura plasterków do modelowania rozwoju ludzkiej kory mózgowej i do fizjologicznego badania rozwijających się obwodów neuronalnych.

Opracowanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z HiPSC do badania kultur 3-D komórek macierzystych przy użyciu fizjologicznie odpowiednich testów

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Tutaj wprowadzamy kompleksowy protokół do generowania i dalszej analizy organoidów ludzkiego mózgu za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i pojedynczego jądra.

Generowanie i dalsza analiza transkryptomów pojedynczych komórek i jąder w organoidach mózgowych

Poznaj metodę kriosekcji ciał embrionalnych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Technika ta umożliwia zachowanie struktury tkanek i szczegółową analizę procesów embriogenezy na poziomie komórkowym oraz molekularnym.

Analiza pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem krioprzesieków ciałek zarodkowych

Przeglądaj więcej filmów