Analiza pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu kriosekcji ciał embrionalnych
8 grudnia 2010
Pluripotencjalne komórki macierzyste rosnące w zawiesinie różnicują się w ciała embrionalne (EBs). Tutaj pokazujemy, jak uzyskać wysokiej jakości kriosekcje EB przydatne do badania komórkowych i molekularnych aspektów embriogenezy, przy jednoczesnym zachowaniu ich organizacji jako agregatów.
Część pierwsza, Wprowadzenie. Cześć, mam na imię Rafael. Odbywam staż podoktorski w Professor Stevens Hans Lab na Uniwersytecie Federalnym w Rio de Janeiro w Brazylii.
Cześć, nazywam się Ismail. Jestem adiunktem, profesorem zwyczajnym. W tym filmie pokażemy, jak przygotować przezroczyste sekcje ciał Androida.
Więc zacznijmy. Część druga, materiały i wyposażenie. Do tej procedury będziemy potrzebować podłoża do zatapiania zamrożonych próbek.
4% roztwór aldehydu Paraform do utrwalania komórek, roztwory sacharozy do krioochrony. Igła z lekko wygiętą końcówką, mikroskop stereoskopowy dla lepszej wizualizacji EBS oraz shaker. Część trzecia.
Tutaj ludzkie ciała embrionów są hodowane na nieprzylegających płytkach hodowlanych. Za pomocą pipety grupujemy wszystkie ciała zarodków jak najbliżej siebie, aby przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. EBS są starannie zbierane i przenoszone do probówki.
Ważne jest, aby zebrać wszystkie ebs, ponieważ nie ma dużej ilości materiału Po zdekantacji EBS pożywki hodowlane są ostrożnie odrzucane. Powinieneś być w stanie zobaczyć granulkę na dnie tuby. Teraz możemy przejść do procedury utrwalania.
EBS zostanie utrwalony w 4% roztworze aldehydu Paraform w PBS lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Ważne jest, aby ponownie zawiesić osad roztworem PFA. EBS są następnie utrwalane w roztworze utrwalającym przez 30 minut.
Po utrwaleniu roztwór PFA jest ostrożnie usuwany. Uważając, aby nie zawiesić EBS przez Resus i nie zastąpić go 10% roztworem sacharozy w PBS w celu zainicjowania krioochrony ebs, materiał jest przechowywany w tym roztworze przez 30 minut. Następnie ostrożnie usuwamy 10% roztwór sacharozy i ponownie zawieszamy EBS w 20% roztworze sacharozy.
Po raz kolejny EBS są przechowywane przez 30 minut w tym roztworze. Na koniec 20% roztwór sacharozy jest usuwany i zastępowany 30% roztworem sacharozy w PBS, gdzie jest przechowywany przez kolejne 30 minut. Teraz możemy przejść do orientacji i blokowania ebs.
W naszym laboratorium używamy pustych otoczek kapsułek jako form. W celu zablokowania ebs ważne jest, aby pokryć wewnętrzne ścianki końcówki roztworem sacharozy przed zebraniem ebs. Teraz możemy ostrożnie zebrać EBS i poczekać, aż zdekantują się na dno końcówki.
Następnie EBS są umieszczane w środku bloku. To powinna być ostateczna pozycja EBS wewnątrz bloku. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego i cienkiej końcówki zbieramy i usuwamy jak najwięcej roztworu sacharozy.
Zawsze uważaj, aby nie zebrać ebs. Za pomocą igły z lekko wygiętą końcówką wszystkie EBS są umieszczane w środku bloku. Na koniec pozostały roztwór sacharozy zbiera się za pomocą kawałków bibuły filtracyjnej.
Specyficzne umiejscowienie EBS w bloku jest bardzo ważne dla uzyskania dobrej jakości plastrów. Oto przykład złego umiejscowienia EB wewnątrz skorupy. Po ustawieniu EBS i usunięciu roztworu sacharozy, powłokę wypełnia się OCT, zaczynając od krawędzi, zawsze uważając, aby nie zawiesić ebs przez Resus.
Pozostałe pęcherzyki usuwa się za pomocą pipety, a muszle miesza się przez 15 minut. Po agitacji. Blok OCT jest zamrażany w suchym lodzie.
W tym momencie możesz albo przechowywać blok zawinięty w folię aluminiową w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy, albo przejść do kriostatu Część czwarta, Cięcie. Do wykonania sekcji kriogenicznych potrzebne będzie jednorazowe lub stałe ostrze, szkiełka szklane OCT i poli L poddane obróbce lizyny. Blok OCT wyjmuje się z zamrażarki i trzyma w kriostacie, aż osiągnie minus 20 stopni Celsjusza.
Blok jest następnie umieszczany na stojaku i wyrównywany równolegle do krawędzi ostrza. Próbki EB są znacznie mniejsze niż większość innych próbek tkanek, dlatego bardzo ważne jest, aby mieć pewność, że cała powierzchnia bloku styka się z ostrzem w tym samym czasie, minimalizując w ten sposób straty materiału. Po ustawieniu blok jest cięty na 10-mikrometrowe plastry, które są zbierane bezpośrednio na szkiełka podstawowe.
Szkiełka mogą być przechowywane, najlepiej w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza, lub mogą być używane tego samego dnia. Materiał może być barwiony do celów immunohistochemicznych lub immunofluorescencyjnych. Konkluzja. Opisana tutaj metoda zapewnia rozsądnie tani i łatwy do naśladowania protokół uzyskiwania cienkich skriostatów ciał zarodków rozwiniętych zarówno z ludzkich linii komórek macierzystych H 9, jak i mysich US P one.
Powstałe krioskrawki mogą być wykorzystywane w wielu różnych procedurach w celu analizy ekspresji białek lub morfologii EB.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia proces uzyskania wysokiej jakości kryosekcji ciał zarodkowych (EBs) pochodzących z pluripotentnych komórek macierzystych hodowlanych w zawiesinie. Te kryosekcje są niezbędne do badania aspektów komórkowych i molekularnych embriogenezy przy zachowaniu organizacji EBs.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Embriogeneza
- Różnicowanie komórek
Tło
- Pluripotentne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Ciała zarodkowe to agregaty naśladujące wczesny rozwój zarodkowy.
- Badanie EBs pomaga zrozumieć mechanizmy embriogenezy.
- Wysokiej jakości kryosekcje są kluczowe dla szczegółowej analizy.
Cel badania
- Zapewnienie metody przygotowania kryosekcji EBs.
- Ułatwienie badania procesów komórkowych i molekularnych podczas różnicowania.
- Zachowanie organizacji strukturalnej EBs w analizie.
Stosowane metody
- Przygotowanie pluripotentnych komórek macierzystych w hodowli zawiesinowej.
- Indukcja różnicowania w ciała zarodkowe.
- Techniki kryosekcjonowania w celu uzyskania wysokiej jakości próbek.
- Analiza cech komórkowych i molekularnych EBs.
Główne wyniki
- Udana przygotowanie kryosekcji z EBs.
- Zachowanie organizacji EBs w kryosekcjach.
- Ulepszona zdolność do badania embriogenezy na poziomie komórkowym.
- Zdemonstrowana metoda może być zastosowana w różnych kontekstach badawczych.
Wnioski
- Metoda pozwala na szczegółową analizę EBs.
- Wysokiej jakości kryosekcje są cenne dla badań embrionalnych.
- To podejście może poszerzyć rozumienie różnicowania komórek macierzystych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-quality cryosectioning of embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells enables precise spatial analysis of differentiation markers and tissue organization, supporting early discovery and target validation in regenerative medicine and developmental biology. This capability enhances predictive confidence in stem cell-based models and informs risk-adjusted decisions at key inflection points in the discovery pipeline. Reliable EB cryosections facilitate cross-functional data integration for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pluripotency and lineage-specific marker expression within three-dimensional EB structures.
- Supports biological de-risking by clarifying differentiation pathways and cellular heterogeneity.
- Provides spatial context for functional target validation in stem cell-derived systems.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized EB cryosections for reproducible immunofluorescence and in situ hybridization assays.
- Enables quantitative assessment of protein and RNA distribution across EB sections.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening in stem cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation with in vivo developmental processes for disease-relevant modeling.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by preserving EB architecture and marker localization.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This cryosectioning method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation studies through assay development and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pluripotency and lineage commitment within EBs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for marker expression and tissue organization.
- Analytics: Enables spatially resolved measurements for comparative analysis of differentiation conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo developmental relevance when supported by marker expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for EB analysis applicable across multiple stem cell lines and differentiation protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell differentiation and target validation.
- Operational Value: Standardizes EB sectioning for reproducible downstream analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust spatial and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and handling of delicate three-dimensional cell aggregates.
- Needs access to cryostats, embedding media, and imaging infrastructure for downstream analysis.
- Demands cross-team standardization of EB preparation and sectioning protocols.
- Adaptable to various pluripotent stem cell lines and differentiation models with attention to EB size and morphology.
- Dependent on careful orientation and embedding to ensure high-quality, interpretable sections.
