Separacja nukleotydów (p)ppGpp izolowanych od bakterii wywołanych stresem za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Zacznij od znakowanych radioaktywnie ekstraktów nukleotydowych uzyskanych z kultury bakteryjnej przed i po indukcji stresu.

Pod wpływem stresu enzymy bakteryjne przekształcają trifosforan guanozyny i difosforan guanozyny w indukowane stresem nukleotydy pentafosforan guanozyny i tetrafosforan guanozyny.

Ekstrakty należy umieścić na cienkowarstwowej płytce chromatograficznej wstępnie pokrytej polimerem kationowym jako fazą stacjonarną.

Umieść płytkę w komorze zawierającej bufor jako fazę ruchomą, upewniając się, że ciecz pozostaje poniżej miejsca, aby zapobiec wczesnej dyfuzji.

Pozwól buforowi wznosić się przez działanie kapilarne, rozdzielając ujemnie naładowane nukleotydy na odrębne pasma w zależności od ich ładunku i rozmiaru.

Po wywołaniu zdejmij płytkę, wysusz na powietrzu i przytnij górę, aby wyeliminować wolne izotopy i zmniejszyć sygnał tła.

Wystaw płytkę na ekran wrażliwy na promieniowanie, aby wykryć sygnał radioaktywny.

Zwiększone poziomy tetrafosforanu guanozyny i pentafosforanu guanozyny po indukcji stresu ujawniają dynamiczne zmiany w puli nukleotydów guanozyny.

Najpierw ułóż płytkę TLC z celulozy PEI o wymiarach 20 na 20 centymetrów.

Użyj nożyczek, aby usunąć górne pięć centyme