Name: Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania kinaz pirofosforanowych z tagiem histydynowym i oceny ich aktywności enzymatycznej za pomocą chromatografii cienkowarstwowej z użyciem substratów radioznaczonych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez NIAID 1K22AI118929-01. EBP było wspierane przez Summer Research Fellowship Program Grant z Office of Research at Old Dominion University, Norfolk, Virginia, USA.

1. Indukowalna nadekspresja białka z tagiem histydynowym
<ol>
	<li>Amplifikacja rsh z genomicznego DNA C. difficile R20291.
	<ol>
		<li>Należy użyć polimerazy o wysokiej wierności i postępować zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Amplifikację C. difficile rsh należy przeprowadzić przy użyciu starterów 
		rsh_F(CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) oraz 
		rsh_R(CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), które wprowadzają znacznik heksahistydynowy na C-końcu. 
		UWAGA: Miejsca cięcia KpnI i PstI w sekwencjach starterów zostały pogrubione.</li>
		<li>Wektor pMMBneo oraz produkt PCR rsh-his6 należy poddać trawieniu enzymami restrykcyjnymi Pstl i KpnI w temperaturze 37 °C przez 45 min.</li>
		<li>Zlinearyzowany wektor i fragmenty PCR należy oczyścić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie za pomocą zestawu do izolacji DNA z żelu.</li>
		<li>Należy zmierzyć absorbancję przy 280 nm (A280) wektora i amplifikowanego produktu PCR. Do wyznaczenia stężenia DNA każdego fragmentu należy użyć równania <img alt="Wzór na stężenie DNA, [DNA]μg/mL = A260 × współczynnik rozcieńczenia × 50, stosowany w spektrofotometrii." src="/files/ftp_upload/58547/58547eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ligacja rsh do pMMBneo w celu ekspresji.
	<ol>
		<li>Należy połączyć 25 ng trawionego wektora PMMBneo, 125 ng produktu genu rsh-his6 , 2 μL 10-krotnego buforu do ligacji oraz 1 μL ligazy DNA. Do uzupełnienia całkowitej objętości do 20 μL należy użyć wody wolnej od nukleaz. Inkubować w 16 °C przez 16 h. 
		UWAGA: Efektywność ligacji zależy od wielkości fragmentu i musi być dostosowana do protokołów producenta.</li>
		<li>Produkt ligacji wektora należy wprowadzić do komórek E. coli DH5-α lub innego szczepu do utrzymywania plazmidów recA- . Transformowane komórki należy wyselekcjonować na płytkach LB z 100 μg/mL kanamycyny i inkubować przez 16–24 h w 37 °C.</li>
		<li>Z płytki (płytek) po transformacji należy pobrać cztery kolonie i każdą z nich wysiać na świeżą płytkę zawierającą 100 μg/mL kanamycyny w celu izolacji DNA. Nowe płytki inkubować w 37 °C przez 16–24 h i wybrać jeden izolat do późniejszej ekspresji białka.</li>
		<li>Aby potwierdzić prawidłową ligację nienaruszonej sekwencji kodującej białko rsh , należy pobrać kolonię wybranego izolatu do 20 μL wody, podgrzać w 95 °C przez 10 min i użyć jako matrycy do potwierdzającej reakcji PCR z użyciem tych samych starterów, których użyto do amplifikacji genu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zweryfikowany plazmid należy wprowadzić zgodnie ze standardowymi protokołami transformacji plazmidów bakteryjnych E. coli do systemu E. coli BL21 w celu wysokowydajnej produkcji białka.</li>
	<li>Ekspresja RSH-His6 w E. coli.
	<ol>
		<li>Należy wybrać pojedynczą kolonię E. coli BL21 transformowaną pMMBneo::rsh i zaszczepić 2 mL pożywki LB z 50 μg/mL kanamycyny. Inkubować w 37 °C przez 12–16 h przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm.</li>
		<li>W celu wzrostu komórek i ekspresji białka należy zaszczepić 500 mL pożywki LB zawierającej 50 μg/mL kanamycyny za pomocą 0,5 mL hodowli nocnej.</li>
		<li>Kulturę ekspresyjną inkubować w 37 °C i 250 rpm w inkubatorze z wytrząsaniem, aż gęstość komórek osiągnie OD600 0,167 w 37 °C.</li>
		<li>Należy obniżyć temperaturę w inkubatorze do 30 °C i odczekać 30 min, aż temperatura kultury spadnie.</li>
		<li>Ekspresję RSH należy indukować poprzez dodanie izopropyl-β-D-1-tiogalaktozydy (IPTG) do stężenia końcowego 0,5 mM. Indukcję przeprowadzać przez noc (przez 16–18 h) w 30 °C, wytrząsając z prędkością 250 rpm.</li>
		<li>Osad należy zebrać poprzez wirowanie przy 3 080 ×g przez 30 min w 4 °C. 
		UWAGA: Osad można przechowywać przez noc w -20 °C w celu oczyszczenia białka docelowego następnego dnia bez zauważalnej utraty wydajności białka lub aktywności enzymatycznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie białek metodą chromatografii powinowactwa do niklu
UWAGA: Po sklarowaniu lizatu komórkowego należy niezwłocznie przystąpić do poniższych etapów oczyszczania białka. Przechowywanie sklarowanego lizatu w temperaturze 4 °C przez noc przed późniejszym oczyszczaniem białka obniża wydajność białka.
<ol>
	<li>Oczyścić białko, wykorzystując 1 mL żywicy z kwasem nitrylooctowym i niklem (Ni-NTA) w kolumnie grawitacyjnej.
	<ol>
		<li>Dzień przed użyciem równoważyć kolumnę przez noc w temperaturze 4 °C przy użyciu 2 mL buforu równoważącego (10 mM Tris-HCl pH 7,79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 0,5 mg/mL lizozymu, 5 mM MgCl2, 10 mM imidazolu, 0,25 mM DTT, 5 mM fluorurek fenylometanosulfonylowy (PMSF), 10% glicerolu).</li>
		<li>Następnego dnia doprowadzić kolumnę z temperatury 4 °C do temperatury pokojowej (RT) przed nałożeniem oczyszczonego lizatu i pozostawić ją na ok. 2–3 h. 
		UWAGA: Doprowadzenie kolumny do równowagi termicznej jest kluczowe, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza wewnątrz kolumny.</li>
		<li>Resuspendować osad otrzymany w kroku 1.3.6 w buforze do lizy (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 10% glicerolu, 0,5 mg/mL lizozymu, 10 mM imidazolu, 0,25 mM DTT i 5 mM PMSF).</li>
		<li>Sonicować komórki na lodzie w 8 interwałach po 10 s, z 30-sekundowymi przerwami między impulsami.</li>
		<li>Oczyścić lizat poprzez wirowanie w mikrocentryfudze przy 3 080 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować lizat, dodając równą objętość buforu do lizy, a następnie nałożyć przygotowany oczyszczony lizat na kolumnę i zebrać frakcję nieprzwiązaną.</li>
		<li>Ponownie nałożyć frakcję nieprzwiązaną z oczyszczonego lizatu na kolumnę i zebrać wtórną frakcję nieprzwiązaną.</li>
		<li>Przemyć kolumnę buforem do przemywania 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 30 mM imidazolu, 10% glicerolu). Zebrać frakcję przemywową. 
		UWAGA: Dodatek 5 mM MgCl2 do buforów do przemywania i elucji jest ważny dla aktywności enzymatycznej oczyszczonego białka.</li>
		<li>Przemyć kolumnę buforem do przemywania 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4 i 50 mM imidazolu). Zebrać frakcję przemywową.</li>
		<li>Nałożyć 2 mL buforu do elucji (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 10% glicerolu i 75 mM imidazolu). Zebrać eluat w dwóch frakcjach po 1 mL każda. 
		UWAGA: Po tym kroku kolumnę można przechowywać w buforze równoważącym w temperaturze 4 °C, jeśli to samo białko ma być oczyszczane w kolejnym badaniu. Kolumnę można wykorzystać do 3 razy, jeśli jest przechowywana prawidłowo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocenić czystość frakcji z kolumny za pomocą SDS-PAGE.
	<ol>
		<li>Aby jakościowo ocenić oczyszczanie białka, nałożyć alikwoty 20 μL wszystkich frakcji z kolumny na żel poliakryloamidowy 4%/10% i prowadzić elektroforezę przez 60 min przy 170 V.</li>
		<li>Barwić żel 0,1% błękitem Coomassie w temperaturze pokojowej przez 5 h, delikatnie kołysząc na wytrząsarce laboratoryjnej.</li>
		<li>Odbarwić żel w 40% metanolu i 10% lodowatym kwasie octowym przez noc w temperaturze pokojowej, kołysząc na wytrząsarce laboratoryjnej. 
		UWAGA: Reprezentatywny żel przedstawiono na Rysunku 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dializować drugą frakcję eluatu przez noc w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Dializować przeciwko buforowi do dializy (15,7 mM Tris-HCl (pH 7,6), 471,9 mM NaCl, 15,69 mM MgCl2, 1,57 mM DTT, 1,5 mM PMSF i 15,7% glicerolu) w stosunku 200:1, używając urządzenia do dializy o pojemności 1 mL z progiem odcięcia masy cząsteczkowej (MWCO) 20 kDa.</li>
		<li>Określić stężenie zdializowanej próbki białka poprzez pomiar absorbancji przy 280 nm, korzystając z obliczonego molowego współczynnika ekstynkcji 82085 M-1cm-1 20.</li>
		<li>Przechowywać alikwoty 5 μL zdializowanej próbki białka w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza aktywności białka metodą chromatografii cienkowarstwowej
<ol>
	<li>Przygotowanie płytki do chromatografii cienkowarstwowej.
	<ol>
		<li>Przed przeprowadzeniem reakcji należy przygotować płytki z celulozy z polietylenoiminą (PEI), płucząc je wodą dejonizowaną. Płytki należy umieścić w szklanej komorze z wodą podwójnie destylowaną do głębokości ok. 0.5 cm.</li>
		<li>Należy odczekać, aż woda przemieści się do górnej krawędzi płytki. 
		UWAGA: Płukanie płytek nie jest ściśle wymagane, gdyż można ich używać bez tego etapu, jednak płukanie zwiększa klarowność uzyskanych obrazów. Płukanie płytek w dwóch prostopadłych kierunkach dodatkowo zapewnia, że wszelkie zanieczyszczenia obecne w żywicy zostaną odizolowane w jednym rogu płytki (Rysunek 2).</li>
		<li>Płytki należy wyjąć ze szklanej komory i pozostawić na stojaku laboratoryjnym do wyschnięcia przez noc (12–18 h).</li>
		<li>Na wysuszonych płytkach należy zaznaczyć miękkim ołówkiem linię 2.0 cm od jednej z krawędzi, aby wskazać miejsca naniesienia próbek do TLC. W przypadku próbek o objętości 2 μL należy nanosić je w odstępach nie mniejszych niż 1.0 cm (Rysunek 2). 
		UWAGA: Pozwala to na wyraźne oddzielenie sąsiednich plamek, co jest krytyczne dla kwantyfikacji sygnału. O ile żywica celulozowa nie zostanie zarysowana, niewielkie oznaczenia ołówkiem na powierzchni nie będą zakłócać migracji rozpuszczalnika.</li>
		<li>Planując eksperymenty, należy zawsze pozostawić jedną plamkę na każdej płytce nieużywaną. 
		UWAGA: Zapewni to ślepą ścieżkę do kwantyfikacji próbek (Rysunek 2). Płytka TLC o długości 20 cm pomieści 19 plamek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza aktywności enzymatycznej
	<ol>
		<li>Należy przygotować 5-krotny bufor zawierający 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM octanu amonu, 10 mM KCl, 1 mM DTT oraz 0.6 mM ATP. 
		UWAGA: Mieszaninę tę można przygotować w dużych ilościach i zamrozić w alikwotach po 10 μL do późniejszego użycia. Nie należy poddawać mieszaniny wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania.</li>
		<li>Należy przygotować poszczególne reakcje zawierające 3 μM RSH, 1x bufor, 0.6 mM GDP, 1.2 mM MgCl2. Do każdych 10 μL reakcji należy dodać 1.0 μCi γ-32P-ATP i dopełnić objętość reakcji do pożądanej wartości wodą wolną od nukleaz. RSH należy dodać po wymieszaniu pozostałych składników, ponieważ dodanie RSH do mieszaniny zawierającej nukleotydy inicjuje analizę aktywności enzymatycznej. 
		UWAGA: Końcowa objętość reakcji będzie zależeć od liczby pobieranych punktów czasowych. Aby pobierać 2 μL na punkt czasowy, należy przygotować 10 μL mieszaniny reakcyjnej na każde 4 punkty czasowe.</li>
		<li>W celu kontroli hydrolizy ATP wywołanej zanieczyszczeniem nukleazami, należy przygotować reakcję o objętości 10 μL niezawierającą białka i inkubować ją równolegle. Próbki o objętości 2 μL należy nanieść w czasie t = 0 oraz na koniec eksperymentu, aby upewnić się, że ATP nie uległo hydrolizie wobec braku białka.</li>
		<li>Natychmiast po dodaniu RSH należy pobrać 2 μL i nanieść je na oznakowaną płytkę PEI-celulozową jako próbkę dla t = 0 min.</li>
		<li>Reakcję należy inkubować w temperaturze 37 °C, pobierając alikwoty 2 μL w wybranych punktach czasowych. 
		UWAGA: Aktywność enzymatyczna ustanie w momencie adsorpcji próbki na płytce celulozowej. Przed rozwojem należy odczekać 10–30 min po naniesieniu ostatniej plamki na płytkę, aby zapewnić całkowitą adsorpcję i wyschnięcie próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia cienkowarstwowa
	<ol>
		<li>Komorę chromatograficzną należy napełnić 1.5 M KH2PO4 (pH 3.64) do głębokości 0.5 cm. 
		UWAGA: Wymagana objętość zależy od wymiarów zbiornika chromatograficznego. Każdy szklany pojemnik z płaskim dnem, wystarczająco szeroki, aby umożliwić włożenie płytki TLC bez jej zginania, może służyć jako komora do rozwoju po dodaniu pokrywy. Płytkę TLC można pociąć na węższe paski czystą żyletką, co umożliwia rozwój w szklanym zlewce przykrytej folią plastikową.</li>
		<li>Dolną krawędź płytki należy zanurzyć w rozpuszczalniku. Należy pozwolić rozpuszczalnikowi przemieścić się do górnej krawędzi płytki (~90 min). 
		UWAGA: Chociaż migracja rozpuszczalnika zatrzyma się na górze płytki, a próbki nie zostaną utracone ani nie zleją się podczas dłuższego zanurzenia, płytek nie powinno się pozostawiać w rozpuszczalniku przez noc. Zanurzenie dłuższe niż 4 h może spowodować oddzielenie się żywicy od podłoża płytki i doprowadzić do utraty sygnału.</li>
		<li>Płytkę należy wyjąć ze zbiornika chromatograficznego i umieścić na laboratoryjnym stojaku do suszenia.</li>
		<li>Płytkę należy pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez noc. 
		UWAGA: Suszenie można przyspieszyć za pomocą suszarki do włosów. Stopień wysuszenia można ocenić po kolorze żywicy, która ciemnieje, gdy jest mokra, i wraca do koloru nieużywanej płytki po całkowitym wyschnięciu.</li>
		<li>Po wyschnięciu płytkę należy owinąć folią plastikową, aby uniknąć przeniesienia materiału radioaktywnego na kasetę obrazującą, a następnie przeanalizować za pomocą autoradiografii (Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych
	<ol>
		<li>Płytkę PEI-celulozową z rozdzielonymi reakcjami należy naświetlać kasetą do fosforimagera przez 4 h w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Jest to czas ekspozycji wystarczający do uzyskania bardzo wyraźnego obrazu przy zastosowaniu wskazanych stężeń świeżego γ-32P-ATP. W przypadku użycia mniejszych ilości substratu znakowanego radioaktywnie czas ekspozycji można zwiększyć do 12–16 h.</li>
		<li>Kasetę należy obrazować za pomocą fosforimagera.</li>
		<li>Korzystając z oprogramowania do obrazowania z graficznym interfejsem użytkownika, należy wyznaczyć obszary zainteresowania (ROI), wybierając opcję Draw Rectangle i używając myszy do narysowania prostokątnych ROI wokół całej jednej ścieżki oraz plamek ATP i ppGpp znajdujących się w tej ścieżce (Rysunek 3).</li>
		<li>Należy użyć poleceń Select, Copy, and Paste (lub odpowiednich poleceń w zależności od używanego oprogramowania), aby narysować identyczne ROI w pozostałych ścieżkach, co zapewni pomiar sygnału w identycznych obszarach każdej ścieżki. Należy uwzględnić ROI z nieużywanej ścieżki, aby służyły jako tło.</li>
		<li>Używając poleceń Analyze | Tools | ROI Manager | Add w oprogramowaniu obrazującym, należy zaznaczyć wszystkie ROI narysowane na płytce PEI-celulozowej.</li>
		<li>Używając poleceń Analyze | Set Measurements | Measure, należy określić intensywność sygnału w każdym ROI i wyeksportować pomiary do arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 3). Od sygnałów eksperymentalnych należy odjąć wartości ROI tła.</li>
		<li>Należy obliczyć, jaki procent sygnału po odjęciu tła w każdej ścieżce przypada na ATP i ppGpp, korzystając z wzorów <img alt="Wzór na obliczenie ATP ppGpp; analiza biochemiczna; równanie; metoda wyznaczania procentowego." src="/files/ftp_upload/58547/58547eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"> 
		UWAGA: ROI można wyznaczać i kwantyfikować przy użyciu komercyjnego oprogramowania kompatybilnego z fosforimagerem lub bezpłatnego oprogramowania ImageJ (National Institutes of Health).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+update+of+the+sequence+and+structure+classification+of+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases.</a> BMC Structural Biology. 5 (1), 6(2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/104659289290001d">Immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).</li>
<li>Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+strategy%2C+production+and+purification+of+proteins+with+exopeptidase-cleavable+His-tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).</li>
<li>Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li>
<li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Booth, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+an+N-terminal+Polyhistidine+Tag+on+Protein+Thermal+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability.</a> ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).</li>
<li>Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+histidine+tag+attachment+on+picosecond+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics.</a> Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).</li>
<li>Chaga, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).</li>
<li>Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+selecting+protein+kinase+assays+for+lead+discovery+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization.</a> Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).</li>
<li>Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EAL+domain+protein+VieA+is+a+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).</li>
<li>Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+Diguanylate+Inversely+Regulates+Motility+and+Aggregation+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile.</a> Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).</li>
<li>Purcell, E. B., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases.</a> Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).</li>
<li>Ross, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0008621500903720">Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase.</a> Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).</li>
<li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28p%29ppGpp%3A+still+magical%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">(p)ppGpp: still magical?</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li>
<li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lifestyle+shapes+stringent+response+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial lifestyle shapes stringent response activation.</a> Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).</li>
<li>Nanamiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+analysis+of+novel+%28p%29ppGpp+synthetase+genes+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).</li>
<li>Gaca, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+Levels+of+%28p%29ppGpp+in+Enterococcus+faecalis%3A+the+Magic+beyond+the+Stringent+Response%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response.</a> mBio. 4 (5), (2013).</li>
<li>Sebaihia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multidrug-resistant+human+pathogen+Clostridium+difficile+has+a+highly+mobile%2C+mosaic+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome.</a> Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Purcell, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nutrient-regulated+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase+controls+Clostridium+difficile+biofilm+and+toxin+production+during+stationary+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase.</a> Infection and Immunity. , (2017).</li>
<li>Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Regulation+of+the+Opposing+%28p%29ppGpp+Catalytic+Activities+of+RelSeq%2C+the+Rel%2FSpo+Enzyme+from+Streptococcus+equisimilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).</li>
<li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://mmbr.asm.org/content/74/2/171.short">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).</li>
<li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile: progress and challenges.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.hhs.gov/">US Department of Health and Human Services</a>. , Centers for Disease Control and Prevention, US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

W tym miejscu opisujemy oczyszczanie znakowanego Hisem RSH z C. difficile i przedstawiamy metodę kwantyfikacji aktywności za pomocą znakowanej radioaktywnie chromatografii cienkowarstwowej. Metoda ta była wcześniej stosowana do oceny aktywności enzymów cyklazy diguanylanowej C. difficile, a także syntetazy (p)ppGpp, cyklazy nukleotydowej, kinazy i enzymów fosfodiesterazy z innych organizmów 11,12,13,21.</s...

Enzymy kinazy i pirofosfokinazy (lub difosfokinazy) przenoszą fosforany z prekursorów trifosforanu nukleotydów (NTP) do cząsteczek substratu. Substraty mogą obejmować inne nukleotydy, aminokwasy lub białka, węglowodany i lipidy1. Analizy bioinformatyczne mogą czasami przewidywać pokrewny substrat lub substraty enzymu na podstawie podobieństwa do scharakteryzowanych enzymów, ale walidacja eksperymentalna jest nadal konieczna. Podobnie, powinowactwo enzymu do jego substratu (substratów) i szybkość, z jaką katalizuje reakcję przenoszenia fosforu, a także wpływ kofaktorów, inhibitorów lub innych efektorów enzymatycznych muszą być określone doświadczalnie. Aby uniknąć zubożenia prekursora ATP przez inne enzymy zużywające ATP obecne w cytoplazmie bakteryjnej, ilościowe testy aktywności wymagają oczyszczonego białka.
Oczyszczanie białek metodą chromatografii powinowactwa do metali zostało dokładnie omówione w literaturze2,3. Znaczniki histydyny składające się z sześciu kolejnych reszt histydyny dołączonych do N- lub C-końca rekombinowanego białka umożliwiają szybkie oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa do metali4,5,6. Sekwencje te są małe w porównaniu z białkami, które modyfikują i zazwyczaj mają minimalny wpływ na funkcję białka, chociaż czasami mogą zmieniać stabilność białka i/lub kinetykę enzymów7,8. Znaczniki histydyny na końcach N i C tego samego białka mogą mieć różne skutki, które są trudne do przewidzenia bez znajomości struktury danego białka. Znaczniki histydyny są zwykle włączane podczas klonowania rekombinowanego białka poprzez projektowanie starterów, które kodują sześć reszt histydyny, albo natychmiast 3' do kodonu start ATG, albo natychmiast 5' do kodonu stop otwartej ramki odczytu. Po amplifikacji gen zawierający heksahistydynę jest ligowany do wektora pod kontrolą indukowalnego promotora i ulega ekspresji, zwykle w laboratoryjnym szczepie E. coli. Białko rekombinacyjne można następnie wyizolować na żywicy powinowactwa zawierającej unieruchomione kationy dwuwartościowe (zwykle nikiel lub kobalt)9. Zanieczyszczenie natywnych białek wiążących metale może być usunięte przez miareczkowanie imidazolem, który konkurencyjnie wypiera związane białko2. Na koniec białko docelowe jest eluowane z kolumny o wyższych stężeniach imidazolu. Istnieje kilka komercyjnych źródeł immobilizowanych żywic kationowych metali, a producenci podają zalecenia dotyczące warunków buforowych i stężeń imidazolu. Po elucji białko może być analizowane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), dializowane lub natychmiast stosowane w testach funkcjonalnych.
Istnieje kilka metod pośredniego monitorowania aktywności kinazy poprzez sprzężenie hydrolizy wiązania fosforanowego ATP z drugą reakcją, która uwalnia lub wzbudza fluorofor lub generuje chemiluminescencję, ale te reakcje mają wiele ruchomych części i mogą być logistycznie trudne10. Najprostszym sposobem szczegółowego pomiaru aktywności transferu fosforu jest bezpośrednie monitorowanie transferu znakowanej radioaktywnie grupy fosforanowej z komercyjnie dostępnego prekursora γ-32-P NTP do nieznakowanego radioaktywnie substratu11,12,13. Mieszaniny substratów i produktów znakowanych radioaktywnie można rozdzielać i oznaczać ilościowo metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC). TLC wykorzystuje zróżnicowaną ruchliwość substancji rozpuszczonych w danym rozpuszczalniku, umożliwiając rozpuszczalnikowi (fazie ciekłej) migrację poprzez działanie kapilarne po powierzchni (fazie stałej), na której mieszanina substancji rozpuszczonych została zaadsorbowana14. Substancje rozpuszczone, które są małe i/lub nie mają korzystnych oddziaływań z fazą stałą, będą migrować na większe odległości od swojej początkowej lokalizacji niż substancje rozpuszczone o większej masie cząsteczkowej lub dużym powinowactwie do ciała stałego. W celu zbadania transferu fosforu, ugrupowania fosforanowe zwiększają masę cząsteczkową cząsteczek, do których są dodawane, i dodają ujemny ładunek jonowy przy obojętnym lub kwaśnym pH11,12,14. Zmniejsza to ich ruchomość na podstawowej powierzchni, takiej jak celuloza PEI. Po rozwinięciu w kwaśnym buforze fosforanu potasu, mieszaniny mono-, di-, tri-, tetra- i pentafosforanu można łatwo rozdzielić na celulozie PEI, co pozwala na ilościowe określenie każdego gatunku (Rysunek 2, Rysunek 3). Takie testy można przeprowadzić przy użyciu lizatów komórkowych zawierających enzym będący przedmiotem zainteresowania, ale obejmuje to możliwość zubożenia substratu i/lub produktu przez aktywność innych kinaz, fosfataz i ogólnych ATPaz. W celu ilościowej oceny aktywności enzymu in vitro konieczne jest oczyszczenie enzymu będącego przedmiotem zainteresowania.
Tetrafosforan guanozyny (ppGpp) i pentafosforan guanozyny (ppGpp) są cząsteczkami sygnałowymi rybonukleotydu powstałymi w wyniku przeniesienia grupy pirofosforanowej z prekursora trifosforanu adenozyny (ATP) do, odpowiednio, substratu difosforanu guanozyny (GDP) lub tetrafosforanu guanozyny (GTP)15. Te pojedyncze sygnały rybonukleotydowe, znane zbiorczo jako (p)ppGpp, pośredniczą w ogólnokomórkowej odpowiedzi na stres środowiskowy, znanej jako odpowiedź rygorystyczna u różnych gatunków bakterii15,16. Dwie konserwatywne klasy enzymów katalizują powstawanie (p)ppGpp15,17 Enzymy homologu Rel/Spo (RSH) są "długimi" dwufunkcyjnymi syntetazą/hydrolazami (p)ppGpp, których nazwa pochodzi od ich podobieństwa do enzymów metabolicznych RelA i SpoT (p)ppGpp z Escherichia coli, które zawierają syntetazę, hydrolazę i domeny regulatorowe, podczas gdy małe enzymy syntetazy alarmonowej (SAS) są krótkimi monofunkcyjnymi syntetazami występującymi wyłącznie w Gram Pozytywne bakterie15,17,18. Bakteria Gram-dodatnia Clostridium difficile, tworząca przetrwalniki, koduje przypuszczalne geny RSH i SAS19. W tym miejscu przedstawiamy wstępne testy aktywności, które potwierdzają, że enzym RSH C. difficile jest katalitycznie aktywną syntetazą (p)ppGpp.

<table><tbody><tr><td><silna>indukowalna nadekspresja białka znakowanego histydyną</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion polimeraza</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Zestaw do ekstrakcji żelu DNA</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny KpnI</td><td>NEB</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny PstI</td><td>NEB</td><td>R0140S</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>NEB&reg; 5-alfa kompetentny&nbsp;E. coli&nbsp;( Wysoka wydajność)</td><td>NEB</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Kompetentny E. coli</td><td>NEB</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10724815001</td><td></td></tr><tr><td>JXN-26 z wirnikiem JLA 10.500</td><td>Beckman Coulter Avanti-Microwirówka</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>z wirnikiem D3024/D3024R</td><td>Scilogex-MaxQ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SHKE6000 Inkubator</td><td>Thermo</td> <td>Scientific-Procesor</td><td></td></tr> <tr><td>ultradźwiękowy</td><td>Sonics</td><td>VC-750</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczanie białek metodą chromatografii powinowactwa do niklu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>żywica G Biosciences</td><td>786-940/941</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Jednorazowe kolumny grawitacyjne, 10 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>1 ml urządzenia do dializy Spectra/ Por float-A-lyzer G2 (MWCO: 20 kD)</td> <td>Spectrum</td><td>G235033</td><td></td></tr><tr><td>Mini-proteuszowa komórka elektroforetyczna</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Badanie aktywności białek metodą chromatografii cienkowarstwowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromatograf cienkowarstwowy (TLC) Zbiornik rozwojowy</td><td>General Glass Blowing Company</td><td>80-3</td><td></td></tr><tr><td>Płyty polietyleninowe (PEI)-celulozowe (20 cm x 20 cm, 100 &mu; m grubości) z poliestrowym nośnikiem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z122882-25EA</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml ołów, 100 &mu; Ci</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002A</td><td></td></tr><tr><td>5'-trifosforan adenozyny (ATP) 100 mM</td><td>Bio Basic Canada</td><td>AB0311</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa guanozyno-5'-difosforanu (GDP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61646MC/E</td><td></td></tr><tr><td>Przechowywanie ekranu fosforowego</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen</td><td></td></tr><tr><td>Storm 860 luminoimager</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppgpp z clostridium difficile

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

Enzymy kinazy i pirofosfokinazy przenoszą ugrupowanie gamma fosforanu lub beta-gamma pirofosforanu z nukleotydowych prekursorów trifosforanu na substraty, aby wytworzyć produkty fosforylowane. Zastosowanie prekursorów NTP znakowanych γ-32-P pozwala na jednoczesne monitorowanie wykorzystania substratu i tworzenia produktu za pomocą radiografii. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) na płytkach celulozowych umożliwia szybkie rozdzielanie i czułe oznaczanie ilościowe substratu i produktu. Przedstawiono metodę wykorzystania chromatografii cienkowarstwowej do oznaczania aktywności pirofosfokinazy oczyszczonej syntetazy (p)ppGpp. Metoda ta była wcześniej stosowana do charakteryzowania aktywności cyklicznych syntetaz nukleotydowych i dinukleotydowych i jest szeroko odpowiednia do charakteryzowania aktywności dowolnego enzymu, który hydrolizuje wiązanie trifosforanu nukleotydu lub przenosi końcowy fosforan z donora fosforanu do innej cząsteczki.

Przedstawiamy metodę oczyszczania powinowactwem syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile oraz ocenę jej aktywności enzymatycznej. Rysunek 1 demonstruje oczyszczanie białka uzyskane za pomocą chromatografii powinowactwa do metali. Druga frakcja elucji (E2) z tego procesu oczyszczania została poddana dializie i wykorzystana do testu aktywności enzymatycznej. Rysunek 2 szczegółowo opisuje kroki niezbędne do przygotowania...

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące enzymów fosfotransferu, w tym specyficzności substratu enzymatycznego i kinetyki reakcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na szybkie gromadzenie wielu zestawów danych, które są bardzo spójne, co umożliwia statystycznie solidną kwantyfikację aktywności enzymów. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ dostrzeżenie reakcji na płytkach TLC i ilościowe określenie form promieniotwórczych w reakcjach jest znacznie łatwiejsze do zademonstrowania niż do wyjaśnienia.Oprócz Asthy, procedurę zademonstruje Asia Poudel, inna doktorantka z mojego laboratorium. Rozpocznij ten protokół od indukowalnej nadekspresji białka znakowanego histydyną, jak opisano w protokole tekstowym. Przygotuj jeden mililitr żywicy kwasu niklowo-nitrylooctowego w kolumnie grawitacyjnej w celu oczyszczenia białka.Dzień przed użyciem należy zrównoważyć kolumnę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z dwoma mililitrami buforu równoważącego. Następnego dnia rozprowadź kolumnę z czterech stopni Celsjusza do temperatury pokojowej przed załadowaniem oczyszczonego lizatu i odstaw na około dwie do trzech godzin. Następnie ponownie zawiesić osad w buforze do lizy.Sonikuj komórki na lodzie przez 10 razy po 10 sekund, robiąc 30-sekundową przerwę między impulsami. Klarować lizat przez odwirowanie w temperaturze 3 080 razy g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą mikrowirówki. Przygotować oczyszczony lizat z równymi objętościami buforu do lizy, a następnie nanieść przygotowany, sklarowany lizat do kolumny i zebrać przepływ.Ponownie nanieść sklarowany przepływ lizatu do kolumny i zebrać przepływ wtórny. Następnie przemyć kolumnę pięcioma mililitrami buforu do przemywania i zebrać przepływ. Ponownie przemyć kolumnę pięcioma mililitrami buforu do przemywania dwa i zebrać przepływ.Teraz zastosuj dwa mililitry buforu elucyjnego. Zbierz przepływ w dwóch frakcjach po jednym mililitrze każda. Podczas oczyszczania białek włączenie chlorku magnezu do oczyszczających, modyfikacja protokołu producenta, jest niezbędne dla aktywności enzymatycznej.Aby jakościowo ocenić oczyszczanie białka za pomocą SDS-PAGE, uruchom 20 mikrolitrowych porcji wszystkich frakcji kolumny na 4% układanym, 10% działającym żelu poliakrylamidowym przez 60 minut przy napięciu 170 woltów. Barwij żel 0,1% Coomassie blue w temperaturze pokojowej przez pięć godzin, delikatnie kołysząc się na bujaku stołowym. Następnie odbarwić żel w 40%metanolu-10% lodowatym kwasie octowym przez noc w temperaturze pokojowej, kołysząc się na bujaku stołowym.Uwolnioną frakcję drugą należy dializować w stosunku do buforu dializacyjnego w stosunku 200:1 za pomocą jednomililitrowego urządzenia do dializy z 20-kilodaltonową granicą masy cząsteczkowej przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Określić stężenie dializowanej próbki białka, mierząc absorbancję przy 280 nanometrach i wykorzystując obliczony współczynnik ekstynkcji molowej. Przechowywać 100-mikrolitrowe porcje dializowanej próbki białka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia.Przed przeprowadzeniem reakcji należy przygotować płytki do chromatografii cienkowarstwowej z celulozy PEI, myjąc je w wodzie dejonizowanej. Umieść płytki w szklanej komorze z podwójnie destylowaną wodą na głębokość około 0,5 centymetra. Po umożliwieniu wodzie migracji do górnej części talerza, wyjmij talerze ze szklanej komory i pozostaw na półce do wyschnięcia na noc.Oznacz wysuszone płytki w odległości dwóch centymetrów od jednej krawędzi miękkim ołówkiem, aby wskazać, gdzie próbki zostaną zastosowane do TLC. W przypadku próbek o pojemności dwóch mikrolitrów należy nakładać próbki w odległości nie mniejszej niż jeden centymetr od siebie. Planując eksperymenty, zawsze pozostawiaj jedno miejsce na każdej płytce niewykorzystane, aby służyło jako puste miejsce do oznaczania ilościowego próbki.Aby wykonać test aktywności enzymatycznej, należy przygotować indywidualne reakcje przy użyciu gamma P32 ATP, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać RSH po wymieszaniu pozostałych składników, ponieważ dodanie RSH do mieszaniny zawierającej nukleotydy inicjuje test aktywności enzymatycznej. Aby kontrolować hydrolizę ATP spowodowaną zanieczyszczającą aktywnością nukleazy, zbierz 10-mikrolitrową reakcję niezawierającą białka i inkubuj ją równolegle.Plamić próbki o pojemności dwóch mikrolitrów w temperaturze T równej zero i na końcu eksperymentu, aby upewnić się, że ATP nie uległo hydrolizie przy braku białka. Natychmiast po dodaniu RSH usuń dwa mikrolitry i umieść je na oznakowanej płytce celulozowej PEI, ponieważ T równa się próbce o zerowej minucie. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza, usuwając dwumikrolitrowe podwielokrotności w żądanych punktach czasowych.Po zebraniu wszystkich podwielokrotności należy przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową, wypełniając komorę chromatograficzną 1,5-molowym monozasadowym fosforanem potasu na głębokość 0,5 centymetra. Zanurzyć dolną krawędź płytki w rozpuszczalniku i pozwolić rozpuszczalnikowi migrować do górnej części płytki przez około 90 minut. Wyjmij płytkę ze zbiornika chromatograficznego i umieść ją na stojaku do suszenia na stole do wyschnięcia na powietrzu przez noc.Po wyschnięciu płytki owiń ją folią z tworzywa sztucznego, aby uniknąć przeniesienia materiału radioaktywnego do kasety obrazowania i przeanalizuj za pomocą autoradiografii. Płytkę z celulozy PEI zawierającą oddzielone reakcje należy wystawić na działanie kasety z luminofilem przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Po naświetleniu zobrazuj kasetę na luminoobrazie.Korzystając z oprogramowania do obrazowania z graficznym interfejsem użytkownika, narysuj obszary zainteresowania lub ROI, wybierając najpierw opcję Rysuj prostokąt, a następnie użyj myszy, aby narysować prostokątne obszary ROI wokół jednego całego pasa oraz miejsca ATP i tetrafosforanu guanozyny znajdujące się w tym pasie. Użyj poleceń Wybierz, Kopiuj i Wklej, aby narysować identyczne ROI na innych torach, aby upewnić się, że ROI mierzą sygnał w identycznych obszarach na każdym torze. Uwzględnij zwrot z inwestycji z nieużywanego pasa, który ma być używany jako puste miejsca.Korzystając z poleceń Analizuj, Narzędzia, Menedżer zwrotu z inwestycji, Dodaj w oprogramowaniu do obrazowania, wybierz wszystkie ROI narysowane na płycie celulozowej PEI. Teraz użyj poleceń Analizuj, Ustaw pomiary, Zmierz, aby określić ilościowo intensywność sygnału w ramach każdego ROI i wyeksportować pomiary jako spreadsheeet. W arkuszu kalkulacyjnym odejmij puste wartości zwrotu z inwestycji od sygnałów eksperymentalnych.Konwersja danych na procent zsyntetyzowanego tetrafosforanu guanozyny ma kluczowe znaczenie, ponieważ zapewnia, że zestawy danych zebrane w różnych dniach z różnymi partiami białka lub różnymi gamma P32 ATP są spójne i mogą być łączone w celu zapewnienia rygoru statystycznego. Ten rysunek pokazuje, w jaki sposób obszary zainteresowania są wykorzystywane do definiowania pasa, który zawiera całkowity sygnał radioaktywny w próbce oraz składniki radioaktywne ATP i tetrafosforan guanozyny będące przedmiotem zainteresowania. Sygnały ATP i tetrafosforanu guanozyny są normalizowane do sygnału całkowitego, a nie podając wartości bezwzględnych, ponieważ błąd pipetowania lub rozpad substratu radioaktywnego może wpływać na całkowity sygnał w próbce, ale nie wpływa na aktywność enzymu.Pokazana tutaj jest rzeczywista płytka TLC reakcji przeprowadzonej przy użyciu oczyszczonego C.difficile RSH. Reakcja kontrolna niezawierająca białka umożliwia ilościowe określenie niekatalizowanej hydrolizy ATP, podczas gdy ślepa próba umożliwia dokładną kwantyfikację sygnału. W miejscach ATP i tetrafosforanu guanozyny enzym przenosi radioaktywny fosforan z substratu ATP do prekursora GDP, tworząc radioaktywny tetrafosforan guanozyny.Potwierdza to, że przypuszczalna syntetaza tetrafosforanu guanozyny z C.difficile jest aktywnym enzymem. Pobierając próbki reakcji w odstępach czasu, można zaobserwować postęp. Tutaj surowy sygnał jest obserwowany w każdym punkcie czasowym.ATP maleje, a tetrafosforan guanozyny wzrasta. Poniżej przedstawiono znormalizowane dane. Paski błędów są znacznie mniejsze, ponieważ normalizacja uwzględnia wszelkie błędy pipetowania.Podczas wykonywania tej procedury należy uważać, aby nie zarysować żywicy na płytce TLC, ponieważ może to zakłócić migrację rozpuszczalnika. Jest to bardzo przystępna technika z prostą analizą danych, która może szybko zapewnić solidną kwantyfikację aktywności enzymu. Użyliśmy go, aby potwierdzić, że Clostridium difficile syntetyzuje tetrafosforan guanozyny, co nigdy wcześniej nie zostało zgłoszone.Nie zapominaj, że praca z promieniotwórczością może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury musisz przestrzegać zasad swojej instytucji dotyczących przechowywania i stosowania materiałów radioaktywnych. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat syntezy tetrafosforanu guanozyny, ale może być również stosowana do innych reakcji fosfotransferu, w tym aktywności kinazy białkowej i cyklicznej syntezy diguanylanów.

a-purification-vitro-activity-assay-for-p-ppgpp-synthetase-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje test enzymatyczny oparty na chromatografii cienkowarstwowej do określenia aktywności pirofosfokinazy przy użyciu znakowanych radioaktywnie nukleotydów. Metoda dostarcza informacji na temat syntezy nukleotydów i reakcji fosfotransferu.

Test aktywności enzymatycznej oparty na chromatografii cienkowarstwowej: technika określania aktywności pirofosfokinazy in vitro za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Ten film demonstruje różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego - techniki systematycznego, wysokoprzepustowego badania przesiewowego białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydów wewnątrzkomórkowych. Technika ta pozwala na bezpośrednie wiązanie przekaźników z nadekspresyjnym białkiem docelowym w lizacie komórkowym - z pominięciem konieczności oczyszczania białka.

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego: wysokoprzepustowa technika identyfikacji wewnątrzkomórkowych białek wiążących drugi przekaźnik nukleotydu bakteryjnego

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Niniejszy raport opisuje test enzymatyczny in vitro do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy przy użyciu ekstraktów z komórek Leishmania. Test ten opiera się na przeniesieniu radioaktywnej grupy metylowej z S-[metylo-3] H]adenozylo-L-metioniny do endogennej fosfatydyloetanoloaminy.

In vitro Test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Ten artykuł opisuje test o wysokiej przepustowości, który został z powodzeniem opracowany do badania dużych bibliotek małych cząsteczek pod kątem ich potencjalnej zdolności do manipulowania poziomami komórkowymi cyklicznego di-GMP u Pseudomonas aeruginosa, dostarczając nowego potężnego narzędzia do odkrywania leków przeciwbakteryjnych i testowania związków.

Opracowanie wysokowydajnego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa

Endopeptydaza prolinowo-prolinowa-1 (PPEP-1) jest wydzielaną metaloproazą i obiecującym celem leku od ludzkiego patogenu Clostridium difficile. Poniżej opisujemy wszystkie metody niezbędne do produkcji i określenia struktury tego białka.

Produkcja, krystalizacja i oznaczanie struktury C. difficile PPEP-1 metodą mikrosiewu i-SAD

Opisano prosty protokół nadekspresji i oczyszczania zoptymalizowanej pod kątem kodonów, ludzkiej cis-prenylotransferazy, w warunkach niedenaturujących, z Escherichia coli, wraz z testem aktywności enzymatycznej. Protokół ten można uogólnić na produkcję innych białek cis-prenylotransferazy w ilości i jakości odpowiednich do badań mechanistycznych.

Nadekspresja i oczyszczanie ludzkiej cis-prenylotransferazy w Escherichia coli

Wzrost kultur bakterii znakowanych radioaktywnie w mikromiareczkowych szalkach ułatwia pobieranie próbek o wysokiej przepustowości, co pozwala na wiele technicznych i biologicznych testów replikacji obfitości puli nukleotydów, w tym (p)ppGpp. Można monitorować skutki przemian wzrostowych wywołanych przez źródła stresu fizjologicznego, a także powrót do zdrowia po stresie.

Stosowanie znakowania radioaktywnego mikromiareczkowego do wielokrotnych pomiarów in vivo Escherichia coli (p)ppGpp, a następnie chromatografii cienkowarstwowej

Ludzki patogen grzybiczy Cryptococcus neoformans wytwarza różne czynniki wirulencji (np. peptydazy), aby ułatwić sobie przetrwanie w organizmie gospodarza. Nisze środowiskowe stanowią obiecujące źródło nowych naturalnych inhibitorów peptydazy. Protokół ten określa przygotowanie ekstraktów z i ocenę ich wpływu na produkcję czynników wirulencji grzybów.

Ocena przypuszczalnych właściwości antykryptokokowych surowych i klarowanych ekstraktów z

Poznaj metodę oczyszczania kinaz pirofosforanowych z tagiem histydynowym i oceny ich aktywności enzymatycznej za pomocą chromatografii cienkowarstwowej z użyciem substratów radioznaczonych.

Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

Przeglądaj więcej filmów