Test oczyszczania i aktywności in vitro dla syntetazy (p)ppGpp z Clostridium difficile

Tutaj opisujemy metodę oczyszczania enzymów pirofosfokinazy znakowanych histydyną i wykorzystanie chromatografii cienkowarstwowej radioznakowanych substratów i produktów do badania aktywności enzymatycznej in vitro. Test aktywności enzymatycznej ma szerokie zastosowanie do dowolnej kinazy, cyklazy nukleotydowej lub reakcji przenoszenia fosforu, której mechanizm obejmuje hydrolizę trifosforanu nukleotydów.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące enzymów fosfotransferu, w tym specyficzności substratu enzymatycznego i kinetyki reakcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na szybkie gromadzenie wielu zestawów danych, które są bardzo spójne, co umożliwia statystycznie solidną kwantyfikację aktywności enzymów. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ dostrzeżenie reakcji na płytkach TLC i ilościowe określenie form promieniotwórczych w reakcjach jest znacznie łatwiejsze do zademonstrowania niż do wyjaśnienia.

Oprócz Asthy, procedurę zademonstruje Asia Poudel, inna doktorantka z mojego laboratorium. Rozpocznij ten protokół od indukowalnej nadekspresji białka znakowanego histydyną, jak opisano w protokole tekstowym. Przygotuj jeden mililitr żywicy kwasu niklowo-nitrylooctowego w kolumnie grawitacyjnej w celu oczyszczenia białka.

Dzień przed użyciem należy zrównoważyć kolumnę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z dwoma mililitrami buforu równoważącego. Następnego dnia rozprowadź kolumnę z czterech stopni Celsjusza do temperatury pokojowej przed załadowaniem oczyszczonego lizatu i odstaw na około dwie do trzech godzin. Następnie ponownie zawiesić osad w buforze do lizy.

Sonikuj komórki na lodzie przez 10 razy po 10 sekund, robiąc 30-sekundową przerwę między impulsami. Klarować lizat przez odwirowanie w temperaturze 3 080 razy g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą mikrowirówki. Przygotować oczyszczony lizat z równymi objętościami buforu do lizy, a następnie nanieść przygotowany, sklarowany lizat do kolumny i zebrać przepływ.

Ponownie nanieść sklarowany przepływ lizatu do kolumny i zebrać przepływ wtórny. Następnie przemyć kolumnę pięcioma mililitrami buforu do przemywania i zebrać przepływ. Ponownie przemyć kolumnę pięcioma mililitrami buforu do przemywania dwa i zebrać przepływ.

Teraz zastosuj dwa mililitry buforu elucyjnego. Zbierz przepływ w dwóch frakcjach po jednym mililitrze każda. Podczas oczyszczania białek włączenie chlorku magnezu do oczyszczających, modyfikacja protokołu producenta, jest niezbędne dla aktywności enzymatycznej.

Aby jakościowo ocenić oczyszczanie białka za pomocą SDS-PAGE, uruchom 20 mikrolitrowych porcji wszystkich frakcji kolumny na 4% układanym, 10% działającym żelu poliakrylamidowym przez 60 minut przy napięciu 170 woltów. Barwij żel 0,1% Coomassie blue w temperaturze pokojowej przez pięć godzin, delikatnie kołysząc się na bujaku stołowym. Następnie odbarwić żel w 40%metanolu-10% lodowatym kwasie octowym przez noc w temperaturze pokojowej, kołysząc się na bujaku stołowym.

Uwolnioną frakcję drugą należy dializować w stosunku do buforu dializacyjnego w stosunku 200:1 za pomocą jednomililitrowego urządzenia do dializy z 20-kilodaltonową granicą masy cząsteczkowej przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Określić stężenie dializowanej próbki białka, mierząc absorbancję przy 280 nanometrach i wykorzystując obliczony współczynnik ekstynkcji molowej. Przechowywać 100-mikrolitrowe porcje dializowanej próbki białka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia.

Przed przeprowadzeniem reakcji należy przygotować płytki do chromatografii cienkowarstwowej z celulozy PEI, myjąc je w wodzie dejonizowanej. Umieść płytki w szklanej komorze z podwójnie destylowaną wodą na głębokość około 0,5 centymetra. Po umożliwieniu wodzie migracji do górnej części talerza, wyjmij talerze ze szklanej komory i pozostaw na półce do wyschnięcia na noc.

Oznacz wysuszone płytki w odległości dwóch centymetrów od jednej krawędzi miękkim ołówkiem, aby wskazać, gdzie próbki zostaną zastosowane do TLC. W przypadku próbek o pojemności dwóch mikrolitrów należy nakładać próbki w odległości nie mniejszej niż jeden centymetr od siebie. Planując eksperymenty, zawsze pozostawiaj jedno miejsce na każdej płytce niewykorzystane, aby służyło jako puste miejsce do oznaczania ilościowego próbki.

Aby wykonać test aktywności enzymatycznej, należy przygotować indywidualne reakcje przy użyciu gamma P32 ATP, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać RSH po wymieszaniu pozostałych składników, ponieważ dodanie RSH do mieszaniny zawierającej nukleotydy inicjuje test aktywności enzymatycznej. Aby kontrolować hydrolizę ATP spowodowaną zanieczyszczającą aktywnością nukleazy, zbierz 10-mikrolitrową reakcję niezawierającą białka i inkubuj ją równolegle.

Plamić próbki o pojemności dwóch mikrolitrów w temperaturze T równej zero i na końcu eksperymentu, aby upewnić się, że ATP nie uległo hydrolizie przy braku białka. Natychmiast po dodaniu RSH usuń dwa mikrolitry i umieść je na oznakowanej płytce celulozowej PEI, ponieważ T równa się próbce o zerowej minucie. Inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza, usuwając dwumikrolitrowe podwielokrotności w żądanych punktach czasowych.

Po zebraniu wszystkich podwielokrotności należy przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową, wypełniając komorę chromatograficzną 1,5-molowym monozasadowym fosforanem potasu na głębokość 0,5 centymetra. Zanurzyć dolną krawędź płytki w rozpuszczalniku i pozwolić rozpuszczalnikowi migrować do górnej części płytki przez około 90 minut. Wyjmij płytkę ze zbiornika chromatograficznego i umieść ją na stojaku do suszenia na stole do wyschnięcia na powietrzu przez noc.

Po wyschnięciu płytki owiń ją folią z tworzywa sztucznego, aby uniknąć przeniesienia materiału radioaktywnego do kasety obrazowania i przeanalizuj za pomocą autoradiografii. Płytkę z celulozy PEI zawierającą oddzielone reakcje należy wystawić na działanie kasety z luminofilem przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Po naświetleniu zobrazuj kasetę na luminoobrazie.

Korzystając z oprogramowania do obrazowania z graficznym interfejsem użytkownika, narysuj obszary zainteresowania lub ROI, wybierając najpierw opcję Rysuj prostokąt, a następnie użyj myszy, aby narysować prostokątne obszary ROI wokół jednego całego pasa oraz miejsca ATP i tetrafosforanu guanozyny znajdujące się w tym pasie. Użyj poleceń Wybierz, Kopiuj i Wklej, aby narysować identyczne ROI na innych torach, aby upewnić się, że ROI mierzą sygnał w identycznych obszarach na każdym torze. Uwzględnij zwrot z inwestycji z nieużywanego pasa, który ma być używany jako puste miejsca.

Korzystając z poleceń Analizuj, Narzędzia, Menedżer zwrotu z inwestycji, Dodaj w oprogramowaniu do obrazowania, wybierz wszystkie ROI narysowane na płycie celulozowej PEI. Teraz użyj poleceń Analizuj, Ustaw pomiary, Zmierz, aby określić ilościowo intensywność sygnału w ramach każdego ROI i wyeksportować pomiary jako spreadsheeet. W arkuszu kalkulacyjnym odejmij puste wartości zwrotu z inwestycji od sygnałów eksperymentalnych.

Konwersja danych na procent zsyntetyzowanego tetrafosforanu guanozyny ma kluczowe znaczenie, ponieważ zapewnia, że zestawy danych zebrane w różnych dniach z różnymi partiami białka lub różnymi gamma P32 ATP są spójne i mogą być łączone w celu zapewnienia rygoru statystycznego. Ten rysunek pokazuje, w jaki sposób obszary zainteresowania są wykorzystywane do definiowania pasa, który zawiera całkowity sygnał radioaktywny w próbce oraz składniki radioaktywne ATP i tetrafosforan guanozyny będące przedmiotem zainteresowania. Sygnały ATP i tetrafosforanu guanozyny są normalizowane do sygnału całkowitego, a nie podając wartości bezwzględnych, ponieważ błąd pipetowania lub rozpad substratu radioaktywnego może wpływać na całkowity sygnał w próbce, ale nie wpływa na aktywność enzymu.

Pokazana tutaj jest rzeczywista płytka TLC reakcji przeprowadzonej przy użyciu oczyszczonego C.difficile RSH. Reakcja kontrolna niezawierająca białka umożliwia ilościowe określenie niekatalizowanej hydrolizy ATP, podczas gdy ślepa próba umożliwia dokładną kwantyfikację sygnału. W miejscach ATP i tetrafosforanu guanozyny enzym przenosi radioaktywny fosforan z substratu ATP do prekursora GDP, tworząc radioaktywny tetrafosforan guanozyny.

Potwierdza to, że przypuszczalna syntetaza tetrafosforanu guanozyny z C.difficile jest aktywnym enzymem. Pobierając próbki reakcji w odstępach czasu, można zaobserwować postęp. Tutaj surowy sygnał jest obserwowany w każdym punkcie czasowym.

ATP maleje, a tetrafosforan guanozyny wzrasta. Poniżej przedstawiono znormalizowane dane. Paski błędów są znacznie mniejsze, ponieważ normalizacja uwzględnia wszelkie błędy pipetowania.

Podczas wykonywania tej procedury należy uważać, aby nie zarysować żywicy na płytce TLC, ponieważ może to zakłócić migrację rozpuszczalnika. Jest to bardzo przystępna technika z prostą analizą danych, która może szybko zapewnić solidną kwantyfikację aktywności enzymu. Użyliśmy go, aby potwierdzić, że Clostridium difficile syntetyzuje tetrafosforan guanozyny, co nigdy wcześniej nie zostało zgłoszone.

Nie zapominaj, że praca z promieniotwórczością może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury musisz przestrzegać zasad swojej instytucji dotyczących przechowywania i stosowania materiałów radioaktywnych. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat syntezy tetrafosforanu guanozyny, ale może być również stosowana do innych reakcji fosfotransferu, w tym aktywności kinazy białkowej i cyklicznej syntezy diguanylanów.