Ocena częstości mutacji u bakterii za pomocą testu beta-glukozydazy

Weźmy kulturę genetycznie modyfikowanych bakterii.

Bakterie są indukowane do ekspresji zmutowanego wariantu polimerazy DNA z wadliwą aktywnością korektorską, co zwiększa szanse na błąd replikacji.

Błędy te mogą prowadzić do spontanicznych mutacji w regionie regulatorowym, które depreparują gen beta-glukozydazy i wyzwalają ekspresję enzymu beta-glukozydazy.

Pobieraj próbki w regularnych odstępach czasu i oceniaj liczbę pokoleń bakterii w każdej kulturze. Odwirować próbki i odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad w buforze.

Dodaj roztwór przepuszczalny i wymieszaj, aby przepuszczalność błony bakteryjnej.

Przenieść przepuszczalne próbki bakterii na płytkę wielodołkową.

Dodaj substrat, który wnika do bakterii i reaguje z enzymem beta-glukozydazy, tworząc kolorowy produkt.

Zmierz intensywność koloru, aby określić aktywność beta-glukozydazy.

Przeanalizuj aktywność beta-glukozydazy w kulturach bakteryjnych, aby określić częstotliwość mutacji w różnych pokoleniach.

Przenieś pojedynczą kolonię E. coli TOP10 zawierającą wektory pBAD-ε i pGOOD1-εD12A11 do jednego mililitra pożywki LB poddanej działaniu antybiotyków.

Inkubuj kulturę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego ranka rozc