Metody zapisów pojemności zacisków krosowych z kielicha

Cześć, nazywam się Ken Paradiso. Pracuję dla Ling Gang Wu w Narodowym Instytucie Zaburzeń Neurologicznych i Programu Udaru Śródściennego, który znajduje się w NIH w kampusie Bethesda. Zamierzam pokazać wam techniki dla caly, które przeprowadziły presynaptyczne nagrywanie Zaciskanie łat.

Tak więc, aby przygotować tkankę mózgową, usuwamy mózg szczura. Umieściliśmy mózg w tym roztworze, który byłby lodowatym roztworem o niskiej zawartości wapnia, i bulgotałby karbogenem, aby upewnić się, że mózg jest dostarczany do tlenu przez cały czas. A także musi być lodowato zimny, aby zminimalizować DA, aby zminimalizować ilość uszkodzeń.

Tak więc mózg byłby teraz w tym rozwiązaniu. Wyjmowaliśmy go, przycinaliśmy odpowiednio, aby można go było położyć na bloku, zamontować na bloku za pomocą korelatu Sano lub szalonego kleju, ale następnie wypełnilibyśmy komorę lodowatym roztworem o niskiej zawartości wapnia, bąbelkowali, umieszczali na wibratorze, a następnie kroili plastry o grubości od 180 do 190 mikronów przy częstotliwości ostrza o częstotliwości 70 Hz i prędkości posuwu do przodu od 0,01 do 0,02 milimetra na sekunda. Byłoby to więc od 10 do 20 mikronów na sekundę.

Po przygotowaniu każdego plastra przenosimy plastry z lodowatej soli fizjologicznej do tej komory, która zawiera normalny roztwór wapnia. To jest ten sam roztwór, w którym nagrywamy i jest w temperaturze fizjologicznej 37 stopni. Następnie wkładamy tutaj plastry w celu odzyskania.

Pozostaje w tym miejscu przez pół godziny do godziny, zanim zostaną przeprowadzone eksperymenty fizjologiczne. Więc tutaj mam mózg i zamierzam wyciągnąć go z rozwiązania. Jest to więc większy mózg do celów demonstracyjnych.

To jest od szczura P 20. My to odwrócimy. To pień mózgu jest tym, co nas interesuje.

Tak więc ten obszar tutaj na dole i kielich, który się trzymał, jest mniej więcej w tym obszarze, właśnie tam. Więc to co zamierzamy zrobić, to odciąć resztę mózgu, wyizolować pień mózgu, a następnie przygotować pień mózgu do komory krojenia. Okej, więc odetniemy resztę mózgu, po prostu izolując pień mózgu.

Zamierzam go odwrócić, aby pokazać, gdzie jesteśmy. Normalnie nie zrobilibyśmy tego w ten sposób i znowu, możemy po prostu pozbyć się całej tej porcji. Odwracając go z powrotem, wyizolowaliśmy pień mózgu i po prostu robimy kolejne cięcie w tym miejscu.

Dobra, to wszystko. To jest pień mózgu. Kielich Helda jest tu i ówdzie.

To jest pień mózgu. Znowu trochę to cofniemy. Odetniemy jedną stronę móżdżku i to pozwoli pniu mózgu usiąść na bok w ten sposób.

Nakładamy trochę kleju akrylowego Sano i trzymając go ułożonym bokiem, szybko napełniamy zimnym lodem, zimnym roztworem o niskiej zawartości wapnia. Podłącz tam przewód tlenowy tak szybko, jak to możliwe. Teraz podnosimy go i przenosimy do vibrato.

Wprowadzamy go szybko, aby dotrzeć do początku mózgu, a następnie, gdy dotrzemy do początku mózgu, zmniejszamy prędkość do 0,01 milimetra na sekundę. Jest to więc 10 mikros na sekundę. Porusza się więc w niewiarygodnie wolnym tempie.

Pierwszą częścią mózgu jest część, która ma mtb, czyli przyśrodkowe nile ciała trapezoidalnego. I to jest ta część, która zawiera, w porządku, więc kiedy już mam ją w pipecie transferowej, staram się zbliżyć ją jak najbliżej końcówki pipety. Jest też wycinek mózgu, który dość szybko przenoszę do tej komory, która zawiera standardowy roztwór rejestrujący, który ma normalny poziom wapnia i wyższą temperaturę.

A to pozwoli plasterkom zregenerować się po procedurach krojenia, które są gotowe z eksperymentów fizjologicznych. Okej, więc od teraz będzie to w kółko to samo. Następujący sprzęt jest tym, czego będę używał do mocowania łat

Posiadamy mikroskop pionowy ze stałym stopniem. Stolik jest nieruchomy, jak już mówiłem, więc mikroskop porusza się pod nim z manipulatora. Używamy peruki i mikromanipulatora Newmana do przytrzymania sceny, stopnia głównego wzmacniacza, używamy wzmacniacza EPC 10 patch clamp firmy heca.

Powinienem był również wspomnieć, że używamy DIC ze światłem podczerwonym. Mamy tu więc kamerę na podczerwień, więc wszystko, co widzimy, będzie widoczne na ekranie, gdy będziemy szukać CAE. Wzmacniacz z zaciskiem krosowym jest kontrolowany przez to oprogramowanie, które nazywa się Pulse, które jest również, które również pochodzi z Heca i będzie sterować wzmacniaczem i całym eksperymentem fizjologicznym.

Wyniki pojawią się na tym ekranie. Trzymane przez nas kasić jest dużym zakończeniem presynaptycznym, a ponieważ jest duże, pozwala nam fizycznie przyłączyć się do terminala. Możemy więc pobierać nagrania presynaptyczne i to jest coś wyjątkowego, szczególnie w OUN.

To pozwala nam zmierzyć kanały wapniowe aktywowane presynaptycznie. Możemy również zmierzyć aktywność potencjału czynnościowego, jeśli chcemy stymulować nerw prowadzący do kielicha. To, co robimy w tym laboratorium, to pomiar procesu zwanego egzocytozą, który jest fuzją pęcherzyków zawierających neuroprzekaźnik z błoną.

Teraz w tych pęcherzykach łączą się z błoną w procesie zwanym egzocytozą, dodają błonę do zakończenia synaptycznego i możemy to zmierzyć jako zmianę pojemności. Otrzymamy wzrost pojemności, gdy membrana zostanie dodana do końcówki, więc eksperymenty, które dzisiaj pokażę, to pomiary pojemności, presynaptycznie po usunięciu membrany. Nie możesz więc po prostu dodawać membrany, oczywiście musisz ją usunąć.

Proces ten nazywa się endocytozą lub wychwytem błonowym. Możemy to również zmierzyć, a to będzie mierzone jako spadek poziomu pojemności, a przykłady tego pokażemy później. To pozwala nam monitorować aktywność kanału wapniowego, a także monitorować niektóre białka biorące udział w egzocytozie i endocytozie oraz badać je.

Możemy wprowadzić takie rzeczy, jak peptydy, aby zablokować białka, które są zaangażowane w egzocytozę lub endocytozę. Możemy również użyć toksyn, które robią to samo. Możemy również dostosować ilość wapnia, która dociera do terminala, dzięki czemu możemy naprawdę badać proces egzocytozy, uwalnianie neuroprzekaźnika, a także wychwyt błony, który następuje po tym zdarzeniu.

To jest probówka zawierająca nasze rozwiązanie do zapisu wewnątrzkomórkowego. Przygotowujemy go z wyprzedzeniem, a następnie zamrażamy i zwykle możemy go używać przez kilka tygodni do miesiąca, zanim będziemy musieli przygotować nowe rozwiązanie. Ponownie, pomyśleliśmy o tym od razu przed nagraniami, że zawsze dostaniesz pewną ilość cząsteczek kurzu lub innego rodzaju zanieczyszczeń, które dostaną się do twojej tuby.

Możesz zrobić jedną z dwóch rzeczy. Możesz albo wyjąć roztwór i przefiltrować go, albo możesz go obracać przez minutę lub dwie, a następnie ściągnąć roztwór, pozostawiając dolną część, w której znajdują się zanieczyszczenia i inne materiały. Więc wolę to kręcić i zrobię to teraz.

To jest probówka zawierająca nasz roztwór wewnątrzkomórkowy. Jest rozmrożony. Zamierzamy odwirowywać go przez około dwie do trzech minut w małej wirówce, a to powinno wystarczyć, aby usunąć wszelkie duże cząsteczki kurzu z roztworu.

Więc teraz po prostu ściągam górę, roztwór, który właśnie odwirowaliśmy, uważając, aby go nie poruszyć, przenoszę go do czystej rurki i ściągam około 90% tego. Staram się nie łapać tego ostatniego. Na tym poprzestanę.

Natychmiast położyłem to na lodzie, aby podczas eksperymentu pozostało przyjemne i zimne. To bardzo ważne. To jest, to jest jedna z naszych pipet.

Używamy tego do nagrań wewnątrzkomórkowych. Jest to grubościenne szkło krzemionkowe o średnicy zewnętrznej dwóch milimetrów, średnicy wewnętrznej 1,16 milimetra. Najpierw zasypujemy pipetę.

Stosujemy więc odsysanie, wkładamy pipetę do roztworu rejestrującego i odsysamy, próbując napełnić bardzo, bardzo końcówkę pipety, która w przeciwnym razie nie wypełni się w żaden inny sposób. Gdy to zrobimy, bierzemy rurkę kapilarną i napełniamy resztę elektrody, biorąc tylko tylną część pipety. Jest to standardowa technika fizjologiczna i dosłownie pstrykanie nią.

Istnieje niebezpieczeństwo, że złamiesz końcówkę pipety, ale jeśli tego nie zrobisz, często będziesz mieć pęcherzyki powietrza. Okej, teraz umieściliśmy go na naszym uchwycie na pipety, który jest podłączony do naszego głównego stopnia wzmacniacza instalacji łatowej. Jest tam drut z chlorku srebra.

Drut chlorku srebra wchodzi w kontakt z roztworem wewnątrzkomórkowym, co pozwala nam zmierzyć aktywność elektryczną w końcówce presynaptycznej. Więc to, co robimy, to znajdujemy wycinek, który ma w sobie dużo CAE. Zależy nam na dużym zagęszczeniu CAE.

Szukamy przyśrodkowego jądra ciała trapezowego, którym jest MNTB, i to jest miejsce, w którym znajduje się końcówka, która tworzy podtrzymaną kielich, lub która jest aplikacją kielicha. Zaczynamy więc skanować wycinek. Na przykład, mamy kielich, który jest trochę głęboko nad powierzchnią i nie ma zbyt wiele do załatania, więc po prostu skanujemy nas dalej.

To jest kielich kielichowy, do którego zmierzamy. To, co zrobiłem, to dwa znaki na ekranie, czyli miejsce, w którym ma trafić pipeta. I widzicie, że jest kawałek kielicha, który zamierzam przeszukać po pipecie, która spadnie.

Zamierzam zastosować nadciśnienie tak, aby napierało na kielich, a następnie zamierzam zmniejszyć nadciśnienie. Kielich będzie następnie dociskał się do pipety, a w tym momencie stosuję bardzo delikatne ssanie i próbuję zassać i popchnąć membranę lub sprawić, aby membrana uszczelniła się na końcówce pipety. W porządku, złagodziłem nadciśnienie.

A teraz zamierzam zastosować ssanie. Więc tutaj jesteśmy profesjonalistami, stosujemy impuls pięciomiliwoltowy, a właściwie impuls czteromiliwoltowy. Dobra, to wszystko. Porządku.

Teraz obniżamy potencjał membrany minus 80, anulujemy szybki przejściowy boom. Teraz przejdziemy przez całą komórkę. Zamierzam zastosować delikatne ssanie i spróbować przejść na sprzedaż hurtową.

Te ładujące się stany nieustalone wskazują, że on jest, że pipeta i komórka są teraz ciągłe, że on ma, hurtowe nagranie. To kolejne piękne ujęcie. Więc jaśniejsza czerwień to był ślad pojemności, i możecie zobaczyć, że jest nagły skok, a potem spadł.

Okej, właśnie pokazałem wam podstawowe techniki uzyskiwania nagrań z podtrzymywanego terminala presynaptycznego kielicha. Pokazałem ci, jak wyprodukować plastry, które zawierają przyśrodkowe jądro ciała trapezu. To właśnie tam znajdziesz kielichy, które się utrzymały.

Pokazałem wam techniki przeglądania plastrów. Przejdziesz przez każdy z plasterków, szukając plasterka, który ma największą liczbę bańców, które znajdują się na powierzchni. Następnie będziesz szukać największej membrany bajowej, jaką możesz znaleźć, i załatać na nią zapis zaciskowy.

Pokazałem również techniki nagrywania z zaciskiem krosowym, a są to standardowe techniki nagrywania z zaciskiem krosowym.