Name: Metody zapisów pojemności zacisków krosowych z kielicha (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Poznaj techniki zapisów patch clamp z kielicha u szczura, kluczowe dla badania przekaźnictwa synaptycznego w układzie słuchowym. Metoda umożliwia pomiar kanałów wapniowych i egzocytozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Konfiguracja Patch Clamp:
Optyka: Układ optyczny jest bardzo ważny dla znalezienia odpowiedniej komórki oraz ustalenia jej położenia.
Należy uzyskać wyraźny obraz komórek: z ostrymi krawędziami i miękkim wyglądem komórki.
Przeskanuj całe pole widzenia w poszukiwaniu odpowiednich komórek głównych MNTB z przytwierdzonym kielichem. Obracaj szalkę, aby oglądać kielichy pod różnymi kątami. Na początku można ćwiczyć na zakończeniu o kształcie balonika.
Wybierz komórkę na powierzchni skrawka lub w 2nd warstwie komórkowej. Za pomocą pipety nakieruj się na pierwszą 1/3rd komórki
Identyfikacja kielichów: Należy szukać podwójnej błony (patrz Rysunek 1) i obracać naczynie z przekrojem, aby obejrzeć ją pod różnymi kątami, co pomoże potwierdzić, że jest to kielich.
<img src="/files/ftp_upload/old/244_2008_8_22_2/244_Figure-01.png" alt="Schemat obserwacji komety, przedstawiający odbicie światła i formowanie się warkocza pyłowego w badaniu kosmicznym." width="298" height="159" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1
 
Głębokość kielicha: Kielich powinien znajdować się na powierzchni lub jak najbliżej powierzchni.
Powierzchnia dostępna do patchowania: Użyj pokrętła mikrometrycznego mikroskopu, aby określić „szerokość/głębokość” kielicha. Na przykład ~10% pełnego obrotu pokrętła mikrometrycznego zapewni wystarczająco dużą powierzchnię do przeprowadzenia patchowania.
Uszczelnienie na komórce presynaptycznej: Aby uzyskać konfigurację cell attached, należy szukać „małej” deformacji na powierzchni komórki spowodowanej dodatnim ciśnieniem (~0.15psi) w pipecie; należy użyć manipulatora, aby przesuwać pipetę w górę, w dół i w poprzek, a nawet w głąb powierzchni terminala presynaptycznego, aby uzyskać wyraźną deformację, a następnie zwolnić ciśnienie i w razie potrzeby zastosować ssanie.
PULSE, program do akwizycji danych:
Przed pierwszym użyciem oraz za każdym razem, gdy wymaga tego pojemność próbkowania, należy zwiększyć objętość buforu.
Konieczność ładowania zmodyfikowanych makr przy każdym uruchomieniu.
Potencjał złącza cieczowego: roztwór do rejestracji Presyn wynosi -11mV (minus 11mV).
Presyn: Cslow=~15 pF
Kompensacja Rs dla presyn: 10 μsec, 65 % (możliwa jest większa kompensacja bez oscylacji)
Przed pomiarem pojemności: Przebadaj relaksację prądu (skok 10 mV, 10 msec), aby sprawdzić, czy relaksacja jest monoeksponencjalna, tzn. czy człon presynaptyczny można modelować za pomocą pojedynczej komory.
Filtry: Ustawione na 30 kHz i 10 kHz (odpowiednio filtr Bessela 1 i 2) podczas pomiaru relaksacji, aby upewnić się, że szybka składowa nie zostanie pominięta.
Podczas rejestracji mini, Xinsheng używał 10 kHz i 5 kHz. LGW poprosił mnie o użycie wyłącznie zestawu filtra 1 ustawionego na 30 kHz, aby upewnić się, że możemy zmierzyć czas narastania mini.
Nazewnictwo plików: 7 cyfr 000mmxx, gdzie mm oznacza miesiąc (lub miesiąc i rok), a xx numer komórki.
Czyszczenie linii z roztworami: Linie czyszczone pod koniec eksperymentu 20 ml 0.1 M HCl, a następnie 200 ml ddH2O.
Roztwory zewnętrzne są recyrkulowane, prędkość pompy wynosi 20-30 rpm.  
(roztwór powracający z komory kąpieli spływa z powrotem do cylindra miarowego).
Przygotuj 3 linie odpływowe, aby zapewnić wystarczające ssanie.
Pipetuj roztwór do rejestracji presynaptycznej: ~310 milli Osmolar 
Roztwór Presyn powinien mieć osmolalność ~310 mOsm, aby zapobiec wzrostowi R-access podczas eksperymentu.
Roztwór do pipety presynaptycznej różni się od roztworu do pipety postsynaptycznej (np. roztwór presynaptyczny zawiera ATP i GTP).
Roztwór TTX-TEA (do izolacji prądów Ca):
<ul>
<li>Należy dążyć do aplikacji po uszczelnieniu, a nawet utworzeniu kontaktu typu patch z komórką, ponieważ TEA w roztworze blokuje kanały potasowe i depolaryzuje komórkę. Jest to niekorzystne dla komórki. Z tego samego powodu ponowne wykorzystanie skrawka po zastosowaniu TTX może być niemożliwe.</li>
<li>Należy porównać pierwszą i ostatnią odpowiedź komórki lub skrawka, aby sprawdzić, czy wystąpił efekt przedłużonej depolaryzacji.</li>
<li>Stosuje się TTX w stężeniu 1 μM zamiast 0,5 μM, aby efekt wystąpił szybciej. Dzięki temu czas oczekiwania po zmianie roztworów jest krótszy.</li>
</ul>
Wycinanie plastrów
Ustawienia mikrotomu wibracyjnego:
<ul>
<li>Wibracje boczne 70Hz</li>
<li>Amplituda: 1.0 mm</li>
<li>Prędkość posuwu 0.01-0.02 mm/sec podczas wycinania plastrów z kielichem, 0.1 w pozostałych przypadkach; grubość: 180 μm (~150 μm u starszych zwierząt)</li>
</ul>
Przecięcia inkubuje się w temperaturze 37ºC przez 1 godzinę (wliczając czas krojenia), t.j. pozostawia się je w kąpieli przez 15-20 minut po zakończeniu krojenia.
Pipety:
Presyn: początkowo 3,5-4,5 MΩ, następnie 3,0-3,5 MΩ po nabyciu większej wprawy
Ustawienia należy skonfigurować zgodnie z instrukcją obsługi wyciągacza. Ze względu na grubość szkła należy skorzystać z funkcji opóźnienia (skuteczne są opóźnienia 200 lub 1)
Rodzaj szkła: Borokrzemowe, standardowa ścianka, bez włókna
Średnica zewnętrzna: 2.0 mm
Średnica wewnętrzna 1,16 mm
Długość: 7.5 cm

metody pomiarów pojemności metodą patch-clamp w kaliksie

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

Prezentujemy podstawowe techniki rejestracji patch clamp z błony presynaptycznej w kielichu Held (calyx of Held), który jest zakończeniem nerwowym w centralnym układzie nerwowym ssaków. Rejestracje elektryczne z zakończenia presynaptycznego umożliwiają pomiar potencjałów czynnościowych, prądów kanałów wapniowych, fuzji pęcherzyków (egzocytozy) oraz następującego po niej pobierania błony (endocytozy). Fuzja pęcherzyków zawierających neuroprzekaźnik powoduje włączenie błony pęcherzykowej do błony komórkowej kielicha. Ten wzrost ilości błony komórkowej jest mierzony jako wzrost pojemności elektrycznej. Następcza redukcja pojemności wskazuje na endocytozę, czyli proces pobierania lub usuwania błony z błony kielicha. Endocytoza jest niezbędna do utrzymania struktury kielicha, a także do tworzenia pęcherzyków, które zostaną wypełnione neuroprzekaźnikiem na potrzeby przyszłych zdarzeń egzocytatywnych. Rejestracje pojemności w kielichu Held umożliwiły bezpośredni i szybki pomiar uwalniania pęcherzyków oraz następującej po nim endocytozy w zakończeniu nerwowym OUN ssaków. Dodatkowo, odpowiadającą temu aktywność postsynaptyczną można mierzyć jednocześnie, stosując rejestracje parzyste. Dzięki temu, wykorzystując ten preparat, możliwe jest uzyskanie pełnego obrazu aktywności elektrycznej presynaptycznej i postsynaptycznej w synapsie ośrodkowego układu nerwowego. W niniejszym materiale przedstawiono metody przygotowania skrawka, cechy morfologiczne służące do identyfikacji kielichów Held, podstawowe techniki patch clamp oraz przykłady rejestracji pojemności w celu pomiaru egzocytozy i endocytozy.

Prezentujemy podstawowe techniki rejestracji metodą patch clamp z błony presynaptycznej w kielichu Held (calyx of Held), który jest zakończeniem nerwowym w centralnym układzie nerwowym ssaków.

Metody pomiarów pojemności metodą patch-clamp w kaliksie

Prezentujemy podstawowe techniki rejestracji patch-clamp z błony presynaptycznej w kielichu Held (calyx of Held), będącym zakończeniem nerwowym w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków. ...

Witajcie, nazywam się Ken Paradiso. Pracuję u Ling Gang Wu w programie wewnątrzinstytutowym Narodowego Instytutu Zaburzeń i Udarów Neurologicznych (National Institute of Neurological Disorders and Stroke), który znajduje się w kampusie NIH w Bethesda. Przedstawię Państwu techniki rejestracji presynaptycznej z wykorzystaniem patch-clampu w kaliksie.Aby przygotować tkankę mózgu, usuwamy mózg szczura. Umieszczamy go w tym roztworze, który powinien być lodowaty, z niską zawartością wapnia i napowietrzany karbogenem, aby zapewnić stały dopływ tlenu do mózgu. Roztwór musi być również lodowaty, aby zminimalizować zakres uszkodzeń.Mózg znajduje się teraz w tym roztworze. Wyjmujemy go i odpowiednio przycinamy, aby można go było umieścić na bloku, a następnie montujemy na bloku za pomocą Sano correlate lub kleju kropelkowego. Następnie wypełniamy komorę lodowatym roztworem o niskiej zawartości wapnia, napowietrzamy go, umieszczamy na wibratorze, a następnie wykonujemy skrawki o grubości od 180 do 190 µm, przy częstotliwości ostrza 70 Hz i prędkości posuwu od 0,01 do 0,02 mm/s. Odpowiada to prędkości od 10 do 20 µm/s.Po wykonaniu każdego przekroju przenosimy go z lodowatego roztworu soli fizj

methods-for-patch-clamp-capacitance-recordings-from-the-calyx

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metody rejestracji pojemności zaciskowej Patch Clamp z kaliksa

Niniejszy materiał stanowi wprowadzenie do rejestracji metodą patch clamp z oocytów Xenopus laevis. Obejmuje on usuwanie błony witelinowej, tworzenie uszczelnienia gigaomowego (gigaseal) oraz opcjonalną konwersję patcha do topologii outside-out.

Rejestracja metodą patch clamp kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Przedstawiamy szczegółowy protokół rejestracji prądów wapniowych aktywowanych uwalnianiem wapnia (CRAC) metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell w ludzkich limfocytach T pochodzących z mononuklearnych komórek krwi obwodowej.

Rejestracja w konfiguracji whole-cell prądów wapniowych aktywowanych przez uwalnianie wapnia (CRAC) w ludzkich limfocytach T

W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania skrawków siatkówki zatopionych w agarze, które nadają się do elektrofizjologii oraz obrazowania Ca2+. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstążkowych w mikroobwodach siatkówki przy użyciu bezpośrednich rejestracji patch-clamp z pojedynczych przedsynaptycznych zakończeń nerwowych.

Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Ten protokół opisuje technikę zwaną elektrofizjologią klamer całokomórkowych, która jest metodą badania właściwości elektrycznych neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego.

Elektrofizjologia klamer krosowych całych komórek: metoda badania właściwości elektrycznych neuronów

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Po egzocytozie, zrośnięta błona plazmatyczna jest odzyskiwana w procesie znanym jako endocytoza. Mechanizm ten reformuje nowe pęcherzyki synaptyczne do następnej rundy uwalniania. Poszczególne zdarzenia endocytarne są wychwytywane i analizowane za pomocą zapisów pojemności przyłączonych do komórek w chromochłonnych komórkach nadnerczy myszy.

Metody pomiarów pojemności przyłączonej do komórki w komórkach chromochłonnych nadnerczy myszy

Obecny protokół opisuje efektywną metodę dynamicznego pozyskiwania prądów kanału potasowego (Kv) w czasie rzeczywistym w kardiomiocytach H9c2 za pomocą techniki patch-clamp dla całych komórek.

Zależny od napięcia zapis prądu potasu na kardiomiocytach H9C2 za pomocą techniki Whole-Cell Patch-Clamp

Niniejszy przewodnik opisuje metodę modyfikacji kształtu szklanych mikropipet. W szczególności, poprzez zastosowanie ciepła i ciśnienia powietrza, poszerza się zwężenie pipety bez zwiększania otworu końcówki, co prowadzi do obniżenia oporu pipety. Jest to kluczowe dla uzyskania pomiarów o niskim poziomie szumów w małych komórkach, lecz znajduje zastosowanie w wielu innych obszarach.

Polerowanie pipet pod ciśnieniem w celu poprawy jakości rejestracji metodą patch-clamp

Poznaj techniki zapisów patch clamp z kielicha u szczura, kluczowe dla badania przekaźnictwa synaptycznego w układzie słuchowym. Metoda umożliwia pomiar kanałów wapniowych i egzocytozy.

Metody pomiarów pojemności metodą patch-clamp w kaliksie

Przeglądaj więcej filmów