Izolacja mitochondriów od mięśni szkieletowych

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie mitochondriów i przeprowadzenie oddychania mitochondrialnego. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie mięśni szkieletowych od szczurów w sprayu. Następnie mięsień jest homogenizowany, a mitochondria izolowane są przez wirowanie.

Stężenie białka jest następnie oznaczane za pomocą testu Bradforda. Wreszcie, oddychanie mitochondrialne mierzy się za pomocą poligrafii. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zużycie tlenu przez różne stany oddychania mitochondrialnego.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mięśni szkieletowych, takie jak wpływ różnych interwencji na funkcję mitochondriów. Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w metabolizm mięśni szkieletowych, może być również stosowana do innych narządów, takich jak wątroba, mózg, nerki lub prawie każda tkanka Przed rozpoczęciem zabiegu. Aby wyizolować mięśnie szkieletowe, przygotuj następujące roztwory: P-B-S-P-B-S plus 10 milimolowy EDTA, ośmiokrotny bufor izolacyjny mitochondriów bufor jeden lub IB jeden, bufor izolacyjny drugi lub IB dwa i bufor eksperymentalny lub eb.

Instrukcje można znaleźć w dołączonym pisemnym protokole. Następnie włącz wirówkę i ustaw ją na cztery stopnie Celsjusza. Włącz łaźnię wodną i ustaw ją na 37 stopni Celsjusza.

W ładnym wiadrze umieść na lodzie trzy 10-mililitrowe zlewki, łokieć garncarski, młynki do tkanek szlachetnych, małe nożyczki chirurgiczne i 10 mikroprobówek wirówkowych. Wszystko musi pozostać lodowate przez cały czas trwania eksperymentu. Umieść IB jeden i IB dwa na ICE i EB w ciepłej kąpieli wodnej.

Następnie dodaj następujące roztwory do trzech zlewek na zlewce lodowej: jedną 10 mililitrów zlewki PBS, dwie 10 mililitrów zlewki P-B-S-E-D-T-A. Trzy. Trzy mililitry ib. Jeden z nich poddać szczura eutanazji zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez lokalną instytucję opieki nad zwierzętami i komitetem ds. soków.

Następnie szybko wyizoluj od 250 do 500 miligramów mięśni szkieletowych za pomocą kleszczy i nożyczek Mayo Clinic. Opłucz go w beca jeden, a następnie przenieś do beca dwa, aby ujednolicić mięsień. Najpierw przenieś go do zlewki trzeciej, a na koniec zmiel nożyczkami.

Przenieś roztwór do homogenizatora klejnotów garncarskich Elva, homogenizuj mięsień za pomocą zmotoryzowanego tłuczka 10 razy, cały czas trzymając rurkę w lodzie. Następnie przenieś homogenat do wstępnie schłodzonej dwumililitrowej mikrowirówki, probówek i wirówki o stężeniu 700 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant S do nowej, wstępnie wypełnionej probówki do mikrowirówek i wyrzucić wirówkę do peletów.

Supernatant S w temperaturze 10, 500 G przez 10 minut W temperaturze czterech stopni Celsjusza przenieś SNAT do nowej, wstępnie napełnionej mikroprobówki wirówkowej i oznacz ją SN one i typu mięśniowego Reese. Zawiesić osad w 500 mikrolitrach IB dwa, a następnie odwirować w temperaturze 10 500 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś supinat do nowej, wstępnie napełnionej mikroprobówki wirówkowej i oznacz ją SN dwa i typ mięśnia.

Zawiesić końcowy osad mitochondrialny w 100 mikrolitrach IB dwa. Obracaj nim w mini krówce przez kilka sekund. Jeśli jest osad, przenieś supinat do nowej, wstępnie napełnionej probówki mikrowirówki i wyrzuć osad Kalibracja elektrody tlenowej jest kluczowym krokiem w tym protokole i musi być wykonywana codziennie.

Kalibrację elektrody można przeprowadzić podczas izolacji mitochondrialnej. Na początek energicznie dodaj 100 mililitrów wody destylowanej do 250-mililitrowej kolby gwiaździstej przez 20 minut. Aby zrównoważyć wodę z gazem atmosferycznym, przykryj elektrodę GRAT kilkoma kroplami 50% chlorku potasu.

Następnie umieść mały kawałek niebieskiego papieru do zwijania rizla na elektrodzie. Następnie kawałek membrany PTFE. Na wierzchu bibułki.

Nałożyć pierścień wewnętrzny za pomocą aplikatora pierścieniowego, a następnie umieścić pierścień zewnętrzny w rowku elektrody. Podłącz elektrody i zmontuj większą plastikową podstawę pierścienia, komorę mitochondrialną i węże wodne. Włącz GRAT boxy i uruchom oprogramowanie GRAS.

Dodaj zrównoważoną wodę do komory mitochondrialnej. Następnie dodaj mieszadło, aby włączyć mieszadło. Kliknij sprzęt.

Następnie zamieszaj prędkość. Dostosuj prędkość do 60 i kliknij. Następnie rozpocznij nowy eksperyment.

Kliknij kalibrację, a następnie kalibrację fazy ciekłej. W polu pierwszym zmień temperaturę na 37 stopni Celsjusza i kliknij dwukrotnie przycisk OK. Gdy zastąpienie zmieni się na, w porządku, kliknij go i otwórz zbiornik azotu gazowego.

Umieść końcówkę podłączoną do zbiornika azotu w komorze i ustal zero tlenu. Kliknij OK po przełączeniu z zastąpienia. Odessać wodę i dodać 500 mikrolitrów EB do komór mitochondrialnych.

Uszczelnij komorę tłokiem. Jeśli używasz wielu pudełek, powtórz czynności od kroku kalibracji dla każdego pudełka. Rozpocznij nowy eksperyment i pozwól mu działać przez około minutę.

Aby ustabilizować sygnał, dodaj niezbędną objętość zawiesiny mitochondriów, aby osiągnąć 150 mikrogramów w każdej komorze. Oznacz zdarzenie i pozwól mu działać. Na jedną minutę dodaj 10 mikrolitrów ciepłego 250-milimolowego glutaminianu, 125-milimolowego jabłczanu, aby uzyskać końcowe stężenie pięciomilimolowego glutaminianu, 2,5 milimolowego znaku jabłczanu i pozwól mu działać przez jedną minutę.

Jest to zdefiniowane jako stan drugi. Następnie dodaj 7,5 mikrolitra 10 milimolów DP, aby uzyskać końcowe stężenie 150 mikromolowych. Następnie zaznacz i pozwól mu działać przez 30 sekund.

Określa się to jako stan trzeci. Dodaj kolejne 7,5 mikrolitra 10 milimoli na znak DP i pozwól mu działać przez 1,5 minuty. Dodaj 0,5 mikrolitra zimnej 10-milimolowej oligomycyny, aby uzyskać końcowe stężenie jednego znaku mikromolowego i pozwól mu działać przez trzy minuty.

Jest to zdefiniowane jako stan czwarty. Dodaj jeden mikrolitr zimnego, 0,1 milimolowego FCCP, aby uzyskać końcowe stężenie 0,2 mikromolowego znaku i pozostaw RUM na trzy minuty. Jest to zdefiniowane jako stan piąty.

Po zakończeniu zakończ eksperyment i zapisz go. Uzyskaj częstość oddechów za pomocą oprogramowania tratwy. Wprowadź współczynnik normalizacji.

Jeśli dodasz 150 mikrogramów białka mitochondrialnego, współczynnik normalizacji wyniesie 0,15. Oblicz znormalizowane częstości oddechów dla różnych stanów oddychania. Oblicz współczynnik kontroli oddechowej lub RCR, dzieląc stan trzeci przez stan czwarty.

Rysunek ten przedstawia reprezentatywne śledzenie zużycia tlenu przez mięśnie szkieletowe. Mitochondria. Po ustabilizowaniu sygnału elektrody próbka mitochondriów jest dodawana do komory GRAT. Stan drugi, oddychanie rozpoczyna się od dodania glutaminianu i jabłczanu.

Dodatek A DP zwiększa zużycie tlenu. Definiowanie stanu trzeciego. Oddychanie Syntaza TP jest blokowana przez dodanie liga mycyny w celu uzyskania czwartego stanu oddychania.

Na koniec dodaje się FCCP w celu rozłączenia oddychania mitochondrialnego. Ten diagram przedstawia reprezentatywne wskaźniki zużycia tlenu dla stanów 2, 3, 4 i piątego. Współczynnik kontroli oddechowej lub RCR jest obliczany dla każdego eksperymentu.

RCR większy niż cztery jest uważany za dowód na żywotne przygotowanie mitochondriów podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby przez cały czas przechowywać próbki mitochondriów w lodzie. Postępując zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak Western blot, można wykonać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zawartość białek mitochondrialnych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak odizolować mitochondria od mięśni szkieletowych, a także oddychanie mitochondrialne.