Name: Izolacja mitochondriów od mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Naucz się izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych szczurów i pomiaru ich respiracji metodą poligraficzną. Protokół obejmuje homogenizację, wirowanie oraz analizę zużycia tlenu w różnych stanach oddechowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była finansowana z grantu National Eye Institute (R01 EY12998) przyznanego F.H. Andrade.

1. Przygotowanie buforów
<ol>
	<li>Włącz wirówkę 5804R i ustaw temperaturę na 4°C. Włącz łaźnię wodną Isotemp 3006D i ustaw temperaturę na 37°C.</li>
	<li>Przed izolacją mięśni przygotuj następujące roztwory:
	<ul>
		<li>PBS: Rozpuść tabletki soli fosforanowo-buforowanej (PBS) w wodzie destylowanej (5 tabletek/litr). Wymieszaj dokładnie.</li>
		<li>PBS z 10 mM EDTA: Aby przygotować 100 ml roztworu, dodaj 2 ml 500 mM EDTA do 98 ml PBS.</li>
		<li>Bufor mitochondrialny 8X: 10,28 g sacharozy dla stężenia końcowego 0,6 M, 400 mg albuminy surowicy wołowej (BSA) wolnej od kwasów tłuszczowych dla stężenia końcowego 0,8%, 2,08 g HEPES dla stężenia końcowego 160 mM, dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij wodą destylowaną do objętości 50 ml.</li>
		<li>Bufor izolacyjny 1 (IB1): Dodaj 200 μl 500 mM EDTA dla stężenia końcowego 10 mM, 0,392 g D-mannitolu dla stężenia końcowego 215 mM, 1,25 ml buforu mitochondrialnego 8X, dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij wodą destylowaną do objętości 10 ml.</li>
		<li>Bufor izolacyjny 2 (IB2): Dodaj 60 μl 500 mM EGTA dla stężenia końcowego 3 mM, 0,392 g D-mannitolu dla stężenia końcowego 215 mM, 1,25 ml buforu mitochondrialnego 8X, dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij wodą destylowaną do objętości 10 ml.</li>
		<li>Bufor eksperymentalny (EB): Dodaj 100 μl 500 mM MgCl2 dla stężenia końcowego 5 mM, 0,392 g D-mannitolu dla stężenia końcowego 215 mM, 25 μl 2,5 mM KH2PO4 dla stężenia końcowego 6,25 μM, 2 μl 100 mM EGTA dla stężenia końcowego 20 μM, 1,25 ml buforu mitochondrialnego, dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij wodą destylowaną do objętości 10 ml.</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
2. Izolacja mięśnia
<ol>
	<li>W wiaderku z lodem umieścić trzy zlewki o pojemności 10 ml, homogenizatory tkankowe Potter-Elvehjem oraz wszystkie pozostałe niezbędne narzędzia i materiały. Wszystkie elementy muszą pozostać schłodzone przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	<li>Po zakończeniu prac umieścić IB1 i IB2 w wiaderku z lodem, a EB w ciepłej łaźni wodnej.</li>
	<li>Do trzech zlewek o pojemności 10 ml należy dodać następujące roztwory:
	<ul>
		<li>Zlewka 1: 10 ml PBS</li>
		<li>Zlewka 2: 10 ml PBS/EDTA</li>
		<li>Zlewka 3: 3 ml IB1</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Humanitarnie uśmiercić szczura zgodnie z zatwierdzeniem lokalnej Komisji ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach (IACUC).</li>
	<li>Szybko wyizolować 250-500 mg mięśnia szkieletowego, opłukać w zlewce 1, a następnie przenieść do zlewki 2.</li>
</ol>
3. Homogenizacja/izolacja mitochondriów
<ol>
	<li>Przenieś mięsień do Zlewki 3 i drobno posiekaj go nożyczkami.</li>
	<li>Przenieś roztwór do homogenizatora Potter-Elvehjem. Zhomogenizuj mięsień za pomocą zmotoryzowanego tłoka (można użyć wiertarki stołowej), powtarzając czynność 10 razy i przez cały czas utrzymując probówkę w lodzie.</li>
	<li>Przenieś homogenat do schłodzonych wcześniej probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml i wiruj przy 700 g przez 10 minut w temperaturze 4° C.</li>
	<li>Przenieś nadosad do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do mikrocentryfugi. Osad odrzuć.</li>
	<li>Wiruj nadosad przy 10 500 g przez 10 minut w temperaturze 4° C.</li>
	<li>Przenieś nadosad do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do mikrocentryfugi i oznacz ją jako SN1 (nadosad nr 1) oraz podaj typ mięśnia.</li>
	<li>Resuspenduj osad w 500 μl buforu IB2.</li>
	<li>Wiruj przy 10 500 g przez 10 minut w temperaturze 4° C.</li>
	<li>Przenieś nadosad do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do mikrocentryfugi i oznacz ją jako SN2 (nadosad nr 2) oraz podaj typ mięśnia.</li>
	<li>Suspenduj końcowy osad mitochondrialny w 100 μl buforu IB2.</li>
	<li>Ponownie wiruj końcową zawiesinę mitochondrialną w mikrocentryfudze przez kilka sekund. Jeśli utworzy się osad, przenieś nadosad do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do mikrocentryfugi, a osad odrzuć.</li>
	<li>Wyznacz stężenie białka za pomocą metody Bradforda 8.</li>
</ol>
4. Kalibracja elektrody
UWAGA: Przeprowadź pełną kalibrację elektrody podczas izolacji mitochondriów.
<ol>
	<li>Do kolby o pojemności 250 ml dodać 100 ml wody destylowanej. Mieszać intensywnie przez 20 minut w celu wyrównania stężenia gazów atmosferycznych w wodzie.</li>
	<li>Do elektrody oksygrafu dodać kilka kropli 50% KCl.</li>
	<li>Na wierzchu elektrody umieścić mały kawałek niebieskiego papierka do skręcania Rizla.</li>
	<li>Na papierku do skręcania umieścić kawałek membrany PTFE.</li>
	<li>Za pomocą aplikatora do pierścieni założyć pierścień wewnętrzny, a następnie umieścić pierścień zewnętrzny w rowku elektrody.</li>
	<li>Podłączyć elektrody i złożyć resztę aparatury: większą plastikową podstawę pierścieniową, komorę mitochondrialną oraz węże wodne.</li>
	<li>Włączyć urządzenia Oxygraph i uruchomić oprogramowanie Oxygraph.</li>
	<li>Wlać wyrównaną wodę do komory mitochondrialnej.</li>
	<li>Włożyć mieszadło magnetyczne i ustawić prędkość obrotową na 60.</li>
	<li>Rozpocząć nowy eksperyment.</li>
	<li>Kliknąć opcję „calibrate”, a następnie „liquid phase calibration” dla Box 1. Zmienić temperaturę na 37° C i dwukrotnie kliknąć „OK”.</li>
	<li>Gdy napis „Override” zmieni się na „OK”, kliknąć go i otworzyć butlę z azotem.</li>
	<li>Wprowadzić końcówkę podłączoną do butli z azotem do komory, aby uzyskać zero tlenu. Kliknąć „OK”, gdy napis zmieni się z „Override”.</li>
	<li>Odssać wodę i dodać 500 μl buforu EB do komór mitochondrialnych.</li>
	<li>Zamknąć komorę za pomocą tłoka.</li>
	<li>W przypadku użycia wielu urządzeń powtórzyć kroki 11–15 w celu kalibracji Box 2.</li>
</ol>
5. Oddychanie mitochondrialne
<ol>
	<li>Rozpocznij nowy eksperyment; pozwól mu trwać przez około 1 minutę w celu stabilizacji sygnału.</li>
	<li>Dodaj niezbędną objętość zawiesiny mitochondrialnej (krok 3.11), aby uzyskać 150 μg w każdej komorze, zaznacz zdarzenie i pozwól urządzeniu pracować przez 1 minutę.</li>
	<li>Dodaj 10 μl podgrzanego roztworu glutaminianu/malonianu 250 mM/125 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 5 mM/2.5 mM. Zaznacz zdarzenie i pozwól urządzeniu pracować przez 1 minutę. Jest to definiowane jako Stan 2.</li>
	<li>Dodaj 7,5 μl 10 mM ADP, aby uzyskać stężenie końcowe 150 μM, zaznacz zdarzenie i pozwól urządzeniu pracować przez 30 sekund. Jest to definiowane jako Stan 3.</li>
	<li>Dodaj kolejne 7,5 μl 10 mM ADP, zaznacz zdarzenie i pozwól urządzeniu pracować przez 1,5 minuty.</li>
	<li>Dodaj 0,5 μl schłodzonej oligomycyny 10 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 1 μM, zaznacz zdarzenie i pozwól urządzeniu pracować przez 3 minuty. Jest to definiowane jako Stan 4.</li>
	<li>Dodaj 1 μl schłodzonego FCCP 0,1 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 0,2 μM, zaznacz zdarzenie i pozwól urządzeniu pracować przez 3 minuty. Jest to definiowane jako Stan 5.</li>
	<li>Po zakończeniu zakończ eksperyment i zapisz dane.</li>
	<li>Pozyskaj wartości tempa oddychania za pomocą oprogramowania Oxygraph.</li>
	<li>Wprowadź czynnik normalizacji: jeśli dodano 150 μg białka mitochondrialnego, czynnik normalizacji wyniesie 0,15.</li>
	<li>Oblicz znormalizowane tempa oddychania dla poszczególnych stanów oddychania.</li>
	<li>Oblicz wskaźnik kontroli oddychania (RCR), dzieląc wartość dla Stanu 3 przez wartość dla Stanu 4.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="Wykres respiracji mitochondrialnej; nmol O2/ml w funkcji czasu; glutaminian/malonian, ADP, oligomycyna, FCCP." data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. przedstawia reprezentatywny zapis zużycia tlenu przez mitochondria mięśni szkieletowych. Po ustabilizowaniu sygnału z elektrody, próbkę mitochondriów dodaje się do komory Oxygraph. Respiracja stanu 2 rozpoczyna się po dodaniu glutaminianu i malonianu. Dodatek ADP zwiększa zużycie tlenu, co definiuje respirację stanu 3. Syntaza ATP zostaje zablokowana poprzez dodanie oligomycyny w celu uzyskania respiracji stanu 4. Na koniec dodaje się FCCP, aby odsprzęgać respirację mitochondrialną (stan 5). Tabela 1 przedstawia reprezentatywne tempo zużycia tlenu dla stanów 2, 3, 4 i 5. Dla każdego eksperymentu obliczany jest wskaźnik kontroli oddechowej (RCR). Wartość RCR ≥4 jest uznawana za dowód żywotności preparatu mitochondriów.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stany</td>
			<td>Znormalizowane szybkości</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stan 2</td>
			<td>34.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stan 3</td>
			<td>153.40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stan 4</td>
			<td>16.49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stan 5</td>
			<td>143.70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCR</td>
			<td>9.30</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Tempo respiracji mitochondrialnej.Reprezentatywne tempo zużycia tlenu w mitochondriach mięśni szkieletowych. Wartości zostały znormalizowane do ilości mitochondriów dodanych do komory. Współczynnik kontroli oddechowej (RCR) wyznaczono poprzez podzielenie stanu 3 przez stan 4. Wartość RCR≥4 oznacza żywotną preparację mitochondriów.

<ol><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).</li>
<li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li>
<li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria%3A+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiamy protokół izolacji żywych mitochondriów z mięśni szkieletowych. W przypadku niskiej wydajności protokół można zmodyfikować, inkubując wyizolowany mięsień w 5 ml PBS/10mM EDTA/0,01% trypsyny przez 30 minut w lodzie. Aby zapewnić całkowite trawienie mięśnia trypsyną, mięsień musi zostać w pełni rozdrobniony. Po 30-minutowej inkubacji roztwór PBS/10mM EDTA/0,01% trypsyny należy całkowicie zastąpić 3 ml buforu izolacyjnego 1 (IB1). Ponadto zastosowanie trypsyny może wpływać na niektóre substraty mitochondrialne ...

<table><tbody><tr><td>95% CO2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5% O2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; wymieszać</td><td>Lokalny dostawca gazu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenozyna 5&amp;#8242;-difosforan, sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski papier Rizla</td><td>Hansatech</td><td>890101</td><td></td></tr><tr><td>Oznaczanie białka metodą Bradforda</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Karbonylocyjanek p-trifluorometoksyfenylohydrazony (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprężony azot</td><td>Lokalny dostawca gazu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenoglikolobis(tetraoctowy) (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodianmiotetraoctowy (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0728</td><td></td></tr><tr><td>Albumin seryjny bydlęcy z wolnymi kwasami tłuszczowymi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Kwas glutaminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5889</td><td></td></tr><tr><td>sól sodowa HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006D</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Samce szczurów Sprague Dawley</td><td>Harlan Laboratories</td><td>300–500 g</td><td></td></tr><tr><td>Kwas jabłkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9138</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C1301P</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Tarcza elektrody tlenowej</td><td>Hansatech</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>Oksygraf</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Oxygraph Plus V1.01</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Mettler Toledo</td><td>1225506149</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8416</td><td></td></tr><tr><td>homogenizatory Potter-Elvehjem</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0,0125 mm &amp;#215; membrana 25 mm)</td><td>Hansatech</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>wiertarka stołowa SKIL 3320</td><td>Sklep z artykułami budowlanymi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria są organellami kontrolującymi życie i śmierć komórki. Uczestniczą w kluczowych reakcjach metabolicznych, syntetyzują większość ATP i regulują szereg kaskad sygnalizacyjnych2,3. Badacze w przeszłości i obecnie izolowali mitochondria z tkanek szczura i myszy, takich jak wątroba, mózg i serce4,5. W ostatnich latach wielu badaczy skoncentrowało się na badaniu funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych.
W niniejszej pracy opisujemy metodę, którą z sukcesem stosowaliśmy do izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych 6. Nasza procedura wymaga, aby wszystkie bufory i odczynniki były świeżo przygotowane, a do analizy niezbędne jest około 250-500 mg mięśnia szkieletowego. Badaliśmy mitochondria izolowane z mięśnia brzuchatego łydki i przepony szczura i myszy oraz z mięśni pozagałkowych szczura. Stężenie białek mitochondrialnych mierzy się za pomocą analizy Bradforda. Istotne jest, aby próbki mitochondrialne były utrzymywane w niskiej temperaturze (na lodzie) podczas przygotowania, a badania funkcjonalne przeprowadzono w stosunkowo krótkim czasie (~1 h). Oddychanie mitochondrialne mierzy się za pomocą polarografii z elektrodą typu Clarka (system Oxygraph) w 37°C7. Kalibracja elektrody tlenowej jest kluczowym etapem tego protokołu i musi być wykonywana codziennie. Izolowane mitochondria (150 μg) dodaje się do 0,5 ml buforu eksperymentalnego (EB). Oddychanie w stanie 2 rozpoczyna się po dodaniu glutaminianu (5mM) i jabłczanu (2,5 mM). Następnie dodaje się adenozynodifosforan (ADP) (150 μM), aby zainicjować stan 3. Do oszacowania stanu 4 stosuje się oligomycynę (1 μM), która jest blokerem syntazy ATP. Na koniec dodaje się cyjano-karbid fenylhydrazonu z grupą p-trifluorometoksylową (FCCP, 0,2 μM), aby zmierzyć stan 5, czyli oddychanie rozsprzęgane 6. Po każdym doświadczeniu oblicza się wskaźnik kontroli oddechowej (RCR), będący stosunkiem stanu 3 do stanu 4. Wartość RCR ≥4 uznaje się za dowód uzyskania żywotnego preparatu mitochondriów.
Podsumowując, prezentujemy metodę izolacji żywych mitochondriów z mięśni szkieletowych, która może być wykorzystana w badaniach biochemicznych (np. aktywność enzymatyczna, detekcja immunologiczna, proteomika) oraz funkcjonalnych (respiracja mitochondrialna).

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Mitochondria to organelle kontrolujące życie i śmierć komórki. Uczestniczą w kluczowych reakcjach metabolicznych, syntetyzują większość ATP oraz ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie mitochondriów i przeprowadzenie pomiaru oddychania mitochondrialnego. Cel ten osiąga się poprzez wstępne wyizolowanie mięśni szkieletowych od szczurów utrwalonych metodą suszenia rozpyłowego. Następnie mięśnie poddaje się homogenizacji, a mitochondria izoluje za pomocą wirowania.Następnie stężenie białka określa się za pomocą metody Bradforda. Na koniec, oddychanie mitochondrialne mierzy się za pomocą poligrafii. W rezultacie można uzyskać wyniki obrazujące zużycie tlenu w różnych stanach oddychania mitochondrialnego.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mięśni szkieletowych, takie jak wpływ różnych interwencji na funkcję mitochondriów. Choć metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w metabolizm mięśni szkieletowych, może być ona również zastosowana do innych organów, takich jak wątroba, mózg, nerka lub niemal każda tkanka. Przed rozpoczęciem procedury, w celu izolacji mięśni szkieletowych, należy przygotować następujące roztwory: PBS, PBS z dodatkiem 10 mM EDTA, bufor do izolacji mitochondriów 8x, bufor do izolacji 1 (IB1), bufor do izolacji 2 (IB2) oraz bufor eksperymentalny (EB).Instrukcje z

mitochondrial-isolation-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolowanie mitochondria z mięśni szkieletowych

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Mitochondria są kluczowymi organellami metabolicznymi, które wykazują wysoki poziom plastyczności fenotypowej w mięśniach szkieletowych. Import białek z cytozolu jest krytycznym szlakiem biogenezy organelli, niezbędnym do ekspansji retikulum i utrzymania funkcji mitochondriów.  Dlatego import białka służy jako barometr zdrowia komórek.

Pomiar zdolności importowej białek z mitochondriów mięśni szkieletowych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Badania bioenergetyczne i metabolomiczne mitochondriów ujawniły ich wieloaspektową rolę w wielu chorobach, ale metody izolacji tych organelli są różne. Opisana tutaj metoda jest w stanie oczyścić wysokiej jakości mitochondria z wielu źródeł tkankowych. Jakość określa się na podstawie współczynników kontroli oddechu i innych wskaźników ocenianych za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Solidna izolacja mitochondriów z tkanki serca gryzoni

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Metoda enzymatycznej dysocjacji, znakowania powierzchniowego i oczyszczania za pomocą cytometrii przepływowej progenitorów fibro/adipogennych i miogennych z mięśni szkieletowych myszy.

Oczyszczanie progenitorów z mięśni szkieletowych

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Naucz się izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych szczurów i pomiaru ich respiracji metodą poligraficzną. Protokół obejmuje homogenizację, wirowanie oraz analizę zużycia tlenu w różnych stanach oddechowych.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów