Ulepszona wizualizacja i analiza ilościowa efektów działania leków przy użyciu komórek z mikrowzorem

Ogólnym celem poniższej procedury jest pokazanie, w jaki sposób normalizacja architektury i położenia komórek osiągnięta na określonych mikrowzorcach adhezyjnych umożliwia łatwą automatyzację akwizycji obrazu i proste przetwarzanie obrazu z czułą i solidną kwantyfikacją efektów działania leku, co jest nieosiągalne na konwencjonalnych szklanych podłożach nakrywkowych. Osiąga się to poprzez wysiewanie komórek heli na dwóch chipach SI, które mają SI w kształcie litery L z trzema oznaczonymi mikrowzorami. Komórki przyjmują trójkątny kształt, budując główne włókno naprężeniowe obejmujące dwa końce L. Komórki wzorcowe są następnie inkubowane ze statyną lebos lub pozostawiane bez leczenia, a następnie utrwalane i barwione w celu uwidocznienia cytoszkieletu i jąder aktonowych.

Obrazy komórek mikrowzorca są następnie pozyskiwane i przetwarzane za pomocą makra ref komórki w celu wygenerowania stosu obrazów do analizy oraz makro przeciwprostokątnej w celu ilościowego określenia fenotypów. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują na znaczący wpływ niskich dawek statyn BLE na mikrowzorcowe komórki HELOC, który jest niewykrywalny w standardowych warunkach hodowli komórkowej. Cześć, witamy.

Jesteśmy tu dzisiaj, aby przeprowadzić Cię przez nasz protokół eksperymentalny, wyjaśniający, jak używać mikrowzorów adhezyjnych do analizy komórek, a także pokazując dane eksperymentalne ilustrujące łatwą kwantyfikację bardzo niskich dawek leków na tych samoprzylepnych mikrowzorcach. Kiedy więc po raz pierwszy zobaczysz te mikrowzorce, natychmiast zrozumiesz, w jaki sposób może to rozwiązać problemy ze zmiennością w przechwytywaniu obrazu podczas analizy komórek. Ponieważ mając naprawdę szereg komórek, podobnie jak mikromacierz, możesz łatwo przesuwać stolik mikroskopu z komórki do komórki, aby móc rejestrować obrazy w sposób krokowy.

Ale to oczywiście nie jedyna zaleta mikrowzorów, które oferuje. Oferuje znacznie więcej ulepszeń, ponieważ w rzeczywistości na niektórych typowych mikrowzorcach, takich jak crossbo lub Y, w rzeczywistości normalizujemy wewnętrzną architekturę komórki, co oznacza, że organelle, wrzeciono mitotyczne, cytoszkielet i różne sieci białkowe znajdują się w tych samych miejscach od komórki do komórki lub w tej samej orientacji od komórki do komórki, co znacznie ułatwia przewidywanie i ilościowe określanie wpływu leków na te konkretne wzorce. Może się to wydawać sprzeczne z intuicją w porównaniu z tym, co zwykle robi się na klasycznej szalce Petriego lub mikropłytce.

Cóż, oczywiście często widzisz, że komórki poruszają się i przyjmują różne morfologie. Natomiast w przypadku mikrowzorów adhezyjnych wszystkie komórki zaczną wyglądać podobnie, ponieważ reagują na ten samoprzylepny mikrowzór i organizują swoją architekturę w ten sam sposób. W rzeczywistości może się to wydawać nieco sztuczne, ale kiedy przyjrzysz się temu bliżej, czy szalka Petriego nie jest jeszcze bardziej sztuczna?

Ponieważ w tkankach komórki są ograniczone przez sąsiednie komórki, a także przez macierz zewnątrzkomórkową. Otrzymują więc bardzo dużo informacji przestrzennych, które orientują architekturę komórki. I to na miejscu do reklamowania mikro wzorów to jest to, co robimy.

Przywracamy tę informację przestrzenną do komórek, a wszystkie komórki reagują na to i organizują się w ten sam sposób. A teraz, ponieważ wszystkie komórki wyglądają podobnie, możemy wprowadzić koncepcję komórki referencyjnej, co oznacza, że możemy uśrednić wszystkie obrazy i uzyskać pojedynczy obraz, który jest naprawdę reprezentatywny, jak komórka wygląda w danym stanie. Następnie możesz dodać lek i ponownie spojrzeć na tę komórkę referencyjną i zobaczyć, jak zmodyfikowała morfologię lub organizację komórki w odpowiedzi na ten lek.

Umieść dwa chipy situ pojedynczo w dwóch niezależnych dołkach na płytce sześciodołkowej, upewniając się, że logo situ two jest czytelne. Dwa chipy situ użyte w tym eksperymencie mają mikro wzory wybarwione FibroGen SI three i powinny być przechowywane w ciemności przed użyciem. Zbierz komórki hela, które są w około 80% zlewane przez trypsynę i sprawdź, czy są odpowiednio zindywidualizowane pod wirówką mikroskopową o sile 300 G przez cztery minuty, a następnie zawiesić komórki, delikatnie policz i rozcieńcz komórki do stężenia 15 000 komórek na mililitr.

W niekompletnych pożywkach hodowlanych D-M-E-M-F 12 należy dozować 60 000 komórek na studzienkę. Płytkę należy przesuwać tak rzadko, jak to możliwe, aby uniknąć wprowadzania ruchów obrotowych w podłożu, które będą miały tendencję do koncentrowania komórek w środku. Pozwól komórkom osadzać się przez 10 minut pod maską, a następnie przenieś je do inkubatora komórkowego.

W ciągu 10 do 20 minut w inkubatorze komórkowym komórki zaczną przylegać po 10 minutach, regularnie sprawdzaj pod mikroskopem, kiedy komórki się przyczepią. Zmień pożywkę komórkową i usuń nadmiar komórek, powtarzając poniższą procedurę cztery razy. Trzymając płaską płytkę, delikatnie zasysaj pożywkę z boku studzienki.

Uważaj, aby zachować wystarczającą ilość nośnika, aby uniknąć wyschnięcia wiórów. Dodaj cztery mililitry PBS i zassaj, zaczynając od środka chipa. Następnie przesuwając się na bok studzienki, aby zassać większość PBS, jak poprzednio, sprawdź pod mikroskopem, czy nie ma pływających komórek.

Jeśli pozostanie duża ilość pływających komórek, powtórz procedurę mycia. Jeśli obecnych jest bardzo mało komórek, odessać część PBS i zastąpić ją dwoma mililitrami świeżej pożywki i dwukrotnie dodać cztery mililitry świeżej pożywki. Inkubuj komórki przez trzy godziny w inkubatorze komórkowym, aby umożliwić komórkom pełne rozprzestrzenienie się.

Stosując tę metodę, od 10 do 30% mikrowzorów będzie zajętych przez pojedynczą komórkę, podczas gdy inne wzory będą albo puste, albo zajęte przez wiele komórek. Aby potraktować komórki BLE, statyny rozcieńczyć 17-milimolowy roztwór podstawowy leku do końcowego stężenia pięciu mikromoli z 0,1% DMSO w czterech mililitrach pożywki. Do kontroli przygotuj pożywkę z 0,1% DMSO, tylko zasysaj pożywkę komórkową i szybko zastąp ją statyną BLE lub roztworami kontrolnymi, aby uniknąć wysychania chipa.

Inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Podczas tej inkubacji należy przygotować bufor cytoszkieletu. Dodaj jeden gram sacharozy do dwóch mililitrów cb.

Pomaga to zachować wewnętrzne struktury komórkowe. Wymieszaj jeden mililitr sacharozy CB z czterema mililitrami 5% PFA. Dodaj dwa mililitry PFA w roztworze sacharozy CB.

W dwóch studzienkach świeżej sześciodołkowej płyty. Aby naprawić komórki, użyj kleszczy, aby podnieść dwuchipowy CY i umieścić go w sześciodołkowej płytce zawierającej dwa mililitry PFA w roztworze sacharozy CB. Inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, usunąć PFA i przemyć komórki raz PBS, a następnie przemyć komórki dwoma mililitrami 100-milimolowego chlorku amonu przez 10 minut.

Aby ugasić resztkową aktywność sieciowania PFA, przepuszczalność komórek przez dodanie dwóch mililitrów PBS zawierającego 0,1% trytonu X 100 przez trzy minuty, dwukrotne przemycie włóknami aktynowymi barwienia PBS z dwoma mililitrami sprzężonej ZI fainy w temperaturze od jednego do 2000 w PBS z 1,5% BSA inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie umyj komórki raz dwoma mililitrami PBS. Następnie podtrzymaj jądra.

Dodaj dwa mililitry jednego miligrama na mililitr umieszczony w PBS i inkubuj przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Umyć dwukrotnie dwoma mililitrami PBS. Zamontuj dwa boczne chipy na standardowej prowadnicy za pomocą rozwiązań montażowych o pojemności od 25 do 30 mikrolitrów, takich jak al.

Do pozyskiwania obrazów na trzech długościach fal używamy oprogramowania do obrazowania Metamorph oraz mikroskopu NIK icon eclipse T. Wyposażony w kamerę CCD Hema Matsu oraz oświetlacz światłowodowy intens lite. Najpierw wybierz 20-krotne powiększenie.

Następnie na pasku menu otwórz akwizycję wielowymiarową. , aby skonfigurować różne parametry eksperymentu. Najpierw wskaż, gdzie chcesz zapisać swoje dane.

Ustaw liczbę długości fal na trzy, wybierz trzy długości fali SI i ustaw szkiełko nakrywkowe tak, aby 12 mikrowzorów było wyśrodkowanych w polu kamery. Liczba mikrowzorów wizualizowanych w każdym polu będzie się różnić w zależności od ustawień kamery i obiektywu. Ustaw czas naświetlania dla każdej długości fali i automatycznego ustawiania ostrości.

Dla PS 3 utwórz dziennik z uruchomioną akwizycją wielowymiarową i zapisz go jako MDA jnl. Otwórz funkcję etapu skanowania, aby uzyskać 24 obrazy, z których każdy zawiera 12 mikrowzorów. Wprowadź sześć kolumn i cztery wiersze z minus 400 mikronami x rozmiar kroku i 300 mikronów y rozmiar kroku w ustawionym dzienniku do wykonania, prześlij dziennik MDA jnl naciśnij skan, aby rozpocząć automatyczną akwizycję 24 obrazów na trzech długościach fali.

W tym filmie mikrowzorce L są wykorzystywane do wywołania tworzenia pojedynczego głównego włókna naprężeniowego aktyny, które podtrzymuje nieprzyłączoną część komórki i upraszcza wizualizację i pomiar wpływu statyn BLE na komórki w porównaniu z komórkami osadzonymi na zwykłej fibronektynie. W celu zautomatyzowanego przetwarzania i analizy obrazu przedstawiamy dwa niestandardowe makra napisane dla obrazu programu open source J ze stosu surowych obrazów, pierwsze makro wyodrębnia pojedyncze komórki i tworzy komórkę odniesienia. Drugi makro mierzy zapadnięcie się błony komórkowej.

Pierwszym krokiem jest segmentacja poszczególnych komórek z surowych obrazów. Fluorescencyjnie znakowane obrazy mikrowzorów są używane do delitowania obszarów wyśrodkowanych na mikrowzorcach, które są przycinane na obrazach dla każdej długości fali i ponownie składane w stosy dla każdej długości fali. Aby wybrać mikrowzory z pojedynczymi komórkami, makro wykrywa liczbę jąder na obrazie i eliminuje we wszystkich stosach te, które zawierają więcej niż jedno jądro lub nie zawierają żadnych jąder.

Wreszcie, wtyczka obrazu J multi-stack reg służy do wyrównania wszystkich zebranych obrazów i wszystkich kanałów w oparciu o pozycję mikrowzoru. Ten krok generuje stosy liniowe pojedynczych obrazów, które można teraz wykorzystać do analizy pojedynczej komórki lub do utworzenia komórki referencyjnej. Na obrazie J komórka referencyjna jest konstruowana przez wykonanie projekcji przefiltrowanych i wyrównanych obrazów ze stosu.

Można zastosować kilka metod projekcji, ale zazwyczaj wybiera się projekcję medianową w celu wyeliminowania wartości odstających stosu obrazów. Komórka referencyjna jest unikalnym i użytecznym narzędziem do reprezentacji i analizy obrazu uzyskanego tylko za pomocą komórek z mikrowzorcem. Aby ułatwić jego badanie, stosuje się tabelę przeglądową lub LUT w celu przekształcenia kolorowego obrazu mono w zakodowaną mapę częstotliwości.

Aby scharakteryzować efekt statyn BLE, sztywność i zapadanie się komórki analizowano przy użyciu drugiego makra obrazu J. Krótko mówiąc, obrazy progowe mikrowzoru L są używane do zdefiniowania teoretycznej przeciwprostokątnej kształtu trójkąta komórkowego. Następnie przeprowadzane jest progowanie obrazów barwienia aktonu w celu zdefiniowania kształtu komórki.

Następnie mierzy się różnicę w obszarze między teoretyczną przeciwprostokątną a rzeczywistą wklęsłą błoną komórkową, komórki znajdujące się pod teoretyczną przeciwprostokątną uważa się za zapadnięte. Wpływ statyn z pięcioma mikromolowymi BLE scharakteryzowano poprzez porównanie liczby zapadniętych komórek w warunkach leczonych i kontrolnych. Pokazano typowe obrazy komórek z mikrowzorem L leczonych statyną BLE lub pozostawionych nieleczonych: komórki były utrwalone i barwione mikrowzorcami.

Aktyna i jądra są pokazane odpowiednio na czerwono, zielono i niebiesko. Zwróć uwagę na wpływ statyn BLE na kształt komórki w porównaniu z warunkami kontrolnymi. Reprezentatywne komórki po inkubacji ze statyną BLE lub kontrolami na zwykłej fibronektynie są pokazane tutaj.

Komórki zostały utrwalone i wybarwione aktyną i jądrami odpowiednio na zielono i niebiesko. Zwróć uwagę na podobieństwo między stanami leczonymi i kontrolowanymi. Przedstawiono typowe obrazy komórek referencyjnych uzyskane z komórek leczonych statyną BLE lub nieleczonych.

Zwróć uwagę na potencjał tego podejścia dla łatwej obserwacji badanego fenotypu. Oto przykład analizy wpływu statyn BLE na komórki przy użyciu makro przeciwprostokątnej. Podczas gdy 25% komórek kontrolnych uległo zapadnięciu, liczba ta wzrosła trzykrotnie o 75% w pięciu mikromolowych komórkach traktowanych statynami BLE, co odzwierciedla osłabioną sieć skurczową aktyniny.

Po obejrzeniu tego powinieneś teraz dobrze zrozumieć, w jaki sposób mikrowzory adhezyjne rozwiązują kilka wąskich gardeł w analizie o wysokiej zawartości. Po pierwsze, zastosowanie mikrowzorów adhezyjnych znacznie uprościło analizę przetwarzania obrazu. Po drugie, mikrowzorce pozwalają na wykrycie bardzo subtelnych efektów działania leków w bardzo niskich dawkach, ponieważ redukujesz zmienność między komórkami poprzez normalizację ich morfologii i zachowania.

I wreszcie, w porównaniu z tysiącami komórek, które są zwykle niezbędne do uzyskania dobrego wyniku w analizie komórek, potrzebujesz tylko kilkudziesięciu komórek, aby uzyskać solidny i znaczący wynik przy użyciu naszej komórki referencyjnej.