Name: Mikromacierze DNA: kontrola jakości próbek, hybrydyzacja i skanowanie macierzy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj protokół mikromacierzy DNA do profilowania ekspresji w układzie nerwowym, obejmujący kontrolę jakości RNA, hybrydyzację i skanowanie fluorescencyjne. Ta metoda umożliwia badaczom analizę różnicowej ekspresji transkryptów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez granty przyznane E. D. w ramach Programu Nagród James S. McDonnell Foundation 21stCentury oraz NIH Director's New Innovator Award. G. A. B. otrzymał częściowe wsparcie w formie stypendium podoktorskiego z California Institute of Regenerative Medicine.

1. Analiza kontroli jakości próbki RNA za pomocą Bioanalizatora 2100
Przed rozpoczęciem,
<ol>
	<li>Denaturuj marker wielkości oraz próbki w temperaturze 70 °C przez 10 min. Natychmiast schłodź na lodzie.</li>
	<li>Oczyść elektrody instrumentu preparatem RNaseZAP przez 1 min, a następnie wodą wolną od RNaz przez 10 s. Pozostaw elektrody do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Przygotuj macierz żelową, pipetując 550 μl macierzy żelowej do filtra wirowego dołączonego do zestawu. Wirować przy 1,500 RCF przez 10 min w temperaturze pokojowej. Podziel przefiltrowany żel na aliquoty po 65 μl i przechowuj w temperaturze 4°C do 1 miesiąca.</li>
	<li>Aby przygotować stację do przygotowania chipa,
	<ol class="lalpha">
		<li>Wsuń strzykawkę 1-ml przez uchwyt do adaptera luer lock.</li>
		<li>Ustaw płytę podstawy w pozycji C, luzując śrubę pod podstawą, podnosząc płytę i ponownie dokręcając śrubę.</li>
		<li>Ustaw uchwyt strzykawki w górnej pozycji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj temperaturę koncentratu barwnika do temperatury pokojowej. Wymieszaj w wortexie przez 10 s. Dodaj 1 μl barwnika do 65 μl aliquotu przefiltrowanego żelu. Dobrze wymieszaj w wortexie i wiruj przy 13,000 RCF przez 10 min w temperaturze pokojowej. Zużyć w ciągu jednego dnia. 
	Gdy będziesz gotowy do analizy próbek,</li>
	<li>Umieść chip w stacji do przygotowania. W tym protokole używamy chipów RNA 6000 nano. Aby załadować żel,
	<ol class="lalpha">
		<li>Pipetuj 9 μl mieszaniny żel-barwnik do dołka oznaczonego białą literą „G” na czarnym tle. Upewnij się, że końcówka znajduje się na samym dnie dołka.</li>
		<li>Ustaw tłok strzykawki na 1 ml. Zamknij stację do przygotowania. Upewnij się, że została zablokowana z kliknięciem.</li>
		<li>Powoli, ale jednostajnie naciśnij tłok w dół, aż zostanie zatrzymany przez uchwyt.</li>
		<li>Odczekaj 30 s. Zwolnij uchwyt.</li>
		<li>Pozwól tłokowi samoczynnie wrócić do góry. Po zatrzymaniu ruchu odczekaj kilka sekund i cofnij tłok do pozycji 1 ml. Otwórz stację do przygotowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pipetuj 9 μl mieszaniny żel-barwnik do każdego z 2 dołków oznaczonych literą „G”.</li>
	<li>Pipetuj 5 μl markera do każdego z 12 dołków na próbki oraz do dołka na marker wielkości.</li>
	<li>Pipetuj 1 μl przygotowanego markera wielkości do dołka na marker wielkości.</li>
	<li>Pipetuj 1 μl każdej próbki do dołków na próbki.</li>
	<li>Pipetuj 1 μl markera do każdego nieużywanego dołka na próbki.</li>
	<li>Mieszaj chip w wortexie przez 1 min przy 2,400 rpm.</li>
	<li>Aby przeprowadzić analizę z chipem,
	<ol class="lalpha">
		<li>Uruchom oprogramowanie 2100 Expert Software.</li>
		<li>Umieść chip w urządzeniu i zamknij pokrywę. Jeśli instrument jest w trybie online, ikona wskaże, czy pokrywa jest otwarta czy zamknięta oraz jaki typ chipa został włożony. Upewnij się, że wybrano odpowiedni port.</li>
		<li>Przeprowadź analizę w ciągu 5 min od załadowania próbek, aby zapobiec parowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Amplifikacja i znakowanie
W celu przygotowania do analizy mikromacierzy próbki RNA są amplifikowane i znakowane, zazwyczaj w reakcji opartej na polimerazie RNA T73. Dwuniciowe cDNA jest generowane poprzez odwrotną transkrypcję. cDNA jest wykorzystywane w reakcji transkrypcji in vitro do wytworzenia tzw. cRNA. Reakcja ta przebiega w obecności znakowanych rybonukleotydów, co pozwala na otrzymanie mikrogramowych ilości znakowanego RNA do hybrydyzacji z macierzą. Wybór metod amplifikacji/znakowania zależy od platformy mikromacierzy, która zostanie użyta w kolejnym etapie. W tej sekcji opisujemy generowanie fluorescencyjnie znakowanego RNA przy użyciu zestawu do znakowania Agilent Quick Amp.
<ol>
	<li>Do probówki o pojemności 1,5 ml pipetować od 50 ng do 5 μg RNA. Objętość nie powinna przekraczać 8,3 μl. W razie potrzeby próbkę RNA należy zagęścić za pomocą wirowania próżniowego lub wytrącania alkoholem.</li>
	<li>Dodać 1,2 μl startera T7.</li>
	<li>Uzupełnić objętość końcową do 11,5 μl wodą wolną od RNaz.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 65°C przez 10 min w celu denaturacji RNA. Zaleca się stosowanie termocyklera z grzaną pokrywą, aby zapobiec kondensacji pary w górnej części probówki.</li>
	<li>Podczas 10-minutowej inkubacji ogrzać 5X First Strand Buffer do temperatury 80°C przez 5 min. Wymieszać na wirówce typu vortex i odwirować. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) do momentu użycia.</li>
	<li>Po 10-minutowej inkubacji szybko schłodzić zdenaturowane próbki RNA na lodzie.</li>
	<li>Przygotować master mix do syntezy cDNA. Na jedną reakcję dodać następujące składniki:
	<ol class="lalpha">
		<li>4 μl 5X First Strand Buffer</li>
		<li>2 μl 0,1 M DTT</li>
		<li>1 μl 10 mM dNTPs</li>
		<li>1 μl enzymu MMLV-RT</li>
		<li>0,5 μl RNase Out.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszać składniki, odwracając probówkę 4 razy. Nie używać wirówki typu vortex. Odwirować, aby zebrać zawartość na dnie probówki.</li>
	<li>Dodać 8,5 μl master mixu do każdej próbki. Wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół.</li>
	<li>Inkubować przez 2 h w temperaturze 40°C, a następnie przez 10 min w temperaturze 65°C. Zaleca się stosowanie termocyklera z grzaną pokrywą.</li>
	<li>Przenieść probówki na lód na 5 min.</li>
	<li>Przygotować master mix do transkrypcji. Na jedną reakcję dodać następujące składniki:
	<ol class="lalpha">
		<li>15,3 μl wody wolnej od nukleaz</li>
		<li>20 μl 4X transcription buffer</li>
		<li>6 μl 0,1 M DTT</li>
		<li>8 μl NTPs</li>
		<li>6,4 μl 50% PEG (PEG należy uprzednio ogrzać do 40°C i wymieszać na wirówce typu vortex, aby zapewnić resuspensję)</li>
		<li>0,5 μl RNase Out</li>
		<li>0,6 μl nieorganicznej pirofosfatazy</li>
		<li>0,8 μl polimerazy RNA T7</li>
		<li>2,4 μl Cy3- lub Cy5 CTP</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Krótko odwirować próbki, aby zebrać zawartość na dnie probówki.</li>
	<li>Dodać 60 μl Transcription Master Mix do każdej próbki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 40°C przez 2 h.</li>
	<li>Dodać 20 μl wody wolnej od RNaz.</li>
	<li>Oczyścić znakowane cRNA w celu usunięcia niewbudowanych nukleotydów. Zaleca się stosowanie kolumienek RNeasy mini firmy Qiagen.</li>
	<li>Oznaczyć ilość znakowanego cRNA. Zaleca się stosowanie spektrofotometru NanoDrop2000 w trybie Microarray Measurement. Należy upewnić się, że jako typ próbki wybrano RNA-40.</li>
	<li>Zanotować stężenie próbki, wydajność (obliczaną jako iloczyn stężenia i objętości) oraz aktywność właściwą (obliczaną jako iloczyn 1000 i stosunku stężenia barwnika do stężenia cRNA). Dla hybrydyzacji mikromacierzy konieczne jest uzyskanie wydajności co najmniej 825 ng oraz aktywności właściwej co najmniej 8 pmol/μg.</li>
</ol>
3. Hybrydyzacja mikromacierzy
<ol>
	<li>Włącz stację do hybrydyzacji i ustaw temperaturę 65°C co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem hybrydyzacji.</li>
	<li>Aby przygotować próbkę do hybrydyzacji, wymieszaj następujące składniki w probówce 1,5 ml:
	<ol class="lalpha">
		<li>825 ng Cy3-cRNA (zazwyczaj jest to próbka „traktowana”)</li>
		<li>825 ng Cy5-cRNA (zazwyczaj jest to próbka „referencyjna”)</li>
		<li>11 μl 10X czynnika blokującego.</li>
		<li>Dodaj wodę wolną od RNaz do uzyskania objętości końcowej 52,8 μl</li>
		<li>Dodaj 2,2 μl buforu do fragmentacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszaj w wirówce typu vortex przy niskich obrotach.</li>
	<li>Inkubuj w temperaturze 60°C przez dokładnie 30 min. Jest to etap fragmentacji cRNA, który generuje znakowane fragmenty do hybrydyzacji na macierzy. Bardzo ważne jest zachowanie dokładnego czasu inkubacji zgodnie z opisem. Zaleca się stosowanie termocyklera z grzaną pokrywą. Precyzyjna inkubacja jest kluczowa dla uzyskania sond o prawidłowej średniej długości. Nadmierna lub niewystarczająca fragmentacja doprowadzi do wyników fałszywie ujemnych lub fałszywie dodatnich.</li>
	<li>Dodaj 55 μl 2X buforu do hybrydyzacji, aby zatrzymać fragmentację. Wymieszaj poprzez pipetowanie, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wiruj przez 1 min przy maksymalnej prędkości, aby zebrać zawartość na dnie probówki. Jeśli zauważysz pęcherzyki powietrza, wydłuż czas wirowania w celu ich usunięcia.</li>
	<li>Umieść probówkę na lodzie, chroniąc ją przed światłem. Nanieś próbkę na macierz tak szybko, jak to możliwe.</li>
	<li>Aby nanieść próbkę na macierz, przygotuj najpierw komorę hybrydyzacyjną. Niniejszy protokół opisuje użycie macierzy Agilent 4x44K z systemem hybrydyzacyjnym Roche-Nimblegen i komorami mieszającymi A4.
	<ol class="lalpha">
		<li>Umieść szkiełko z mikromacierzą w narzędziu do montażu/demontażu, zaczynając od strony z kodem kreskowym.</li>
		<li>Otwórz mieszalnik A4 i odsłoń warstwę klejącą. Trzymając macierz i narzędzie do montażu/demontażu w sposób zapobiegający przesunięciom, nałóż mieszalnik A4 na szkiełko, zaczynając od dalnego końca. Upewnij się, że jest on prawidłowo wyrównany względem narzędzia. Przyklej mieszalnik wzdłuż całego szkiełka z macierzą.</li>
		<li>Pociągnij za koniec mieszalnika, aby wyjąć zespół szkiełko/mieszalnik.</li>
		<li>Za pomocą narzędzia do dociskania dociśnij całą długość uszczelki klejącej, aby upewnić się, że jest ona szczelnie przyklejona do szkiełka. Małe pęcherzyki powietrza uwięzione między klejem a szkiełkiem są widoczne na ciemnym tle. Poświęć dodatkowy czas na ich usunięcie za pomocą narzędzia do dociskania. Macierz jest teraz gotowa do naniesienia próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając pipety z tłokiem wypierającym, nanieś 100 μl próbki do hybrydyzacji. Wciśnij końcówkę ściśle do otworu wlotowego, a następnie dozuj powoli i płynnie, aby powietrze nie zostało uwięzione w obszarze macierzy. Nigdy nie próbuj zasysać próbki z powrotem. Po dozowaniu całej próbki pozostaw końcówkę w otworze wlotowym, nie zwalniając tłoka. Gdy próbka pokryje całą macierz, a ciecz zacznie wypływać przez otwór odpowietrzający, szybko wyjmij pipetę. Zwolnij tłok dopiero po odsunięciu końcówki od szkiełka.</li>
	<li>Delikatnie odsącz nadmiar cieczy z obu portów. Upewnij się, że nie wyciągasz próbki z wnętrza komory.</li>
	<li>Zaklej otwory portów naklejkami za pomocą pęsety.</li>
	<li>Umieść szkiełko na stacji do hybrydyzacji i sprawdź, czy otwory pęcherzyka są prawidłowo ustawione nad o-ringami. Zapewni to właściwe mieszanie podczas hybrydyzacji.</li>
	<li>Zamknij osłonę szkiełka oraz pokrywę stacji. Ustaw stację w trybie mieszania B.</li>
	<li>Przeprowadź hybrydyzację macierzy w temperaturze 65°C przez 17 godzin.</li>
	<li>Przygotuj Bufor Płuczący 2, dodając Triton X-102 do stężenia końcowego 0,005%. Przechowuj w temperaturze 37°C przez noc.</li>
</ol>
4. Przemywanie mikromacierzy
<ol>
	<li>Dodaj Triton X-102 do Buforu do przemywania 1 do stężenia końcowego 0.005%. Przechowuj w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po zakończeniu hybrydyzacji napełnij szklany pojemnik „A” Buforem do przemywania 1. Pojemnik powinien być wystarczająco duży, aby pomieścić narzędzie do montażu/demontażu i umożliwić swobodne manewrowanie. Wszystkie etapy przemywania należy przeprowadzać w szkle. Należy unikać pojemników plastikowych, ponieważ mają one tendencję do wymywania związków, co skutkuje wysokim tłem w matrycy.</li>
	<li>Umieść statyw na szkiełka i mieszadło magnetyczne w kuwecie do barwienia „B”. Napełnij ją Buforem do przemywania 1, upewniając się, że statyw jest całkowicie zakryty. Postaw na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść mieszadło magnetyczne w pustej kuwecie do barwienia „C” i postaw na mieszadle magnetycznym.</li>
	<li>Wyjmij matrycę i umieść ją w narzędziu do montażu/demontażu. Zanurz cały zespół w pojemniku „A”.</li>
	<li>Trzymając jedną ręką narzędzie do montażu/demontażu oraz szkiełko po przeciwnych stronach, ostrożnie odklej mikser A4. Upewnij się, że nie porysowałeś obszaru matrycy.</li>
	<li>Szybko umieść szkiełko w statywie w kuwecie do barwienia „B”. Od tego momentu należy zminimalizować ekspozycję na powietrze, ponieważ barwnik Cy5 jest wrażliwy na ozon. Nie przemywaj więcej niż 8 matryc jednocześnie.</li>
	<li>Przemywaj przez 1 minutę, mieszając z umiarkowaną prędkością.</li>
	<li>Napełnij kuwetę do barwienia „C” uprzednio ogrzanym Buforem do przemywania 2. Przenieś szkiełka i przemywaj przez 1 minutę.</li>
	<li>Bardzo powoli wyjmij statyw ze szkiełkami z kuwety do barwienia „C”, aby zminimalizować ilość kropel pozostających na szkiełku.</li>
	<li>Osusz szkiełko poprzez wirowanie przez 2 minuty. Jeśli odpowiednia wirówka nie jest dostępna, odwiruj szkiełko w stożkowej probówce 50 ml lub przedmuchaj je gazem argonowym.</li>
	<li>Umieść szkiełka w stożkowej probówce 50 ml i napełnij ją argonem. Przystąp do skanowania natychmiast, aby uniknąć utraty sygnału. Zalecamy użycie skanera GenePix 4000B firmy Molecular Devices.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki:
Próbki całkowitego RNA dobrej jakości powinny wykazać jedynie dwa główne piki podczas analizy w Bioanalyzerze w celu kontroli jakości, odpowiadające dwóm głównym gatunkom RNA rybosomalnego. Pewna degradacja RNA objawi się jako rozmycie przed pierwszym pikiem RNA rybosomalnego. Silnie zdegradowane RNA niskiej jakości wykaże szeroki pik lub serię pików przy niskich czasach retencji, podczas gdy dwa piki RNA rybosomalnego będą miały bardzo niską intensywność lub nie będą w ogóle identyfikowalne. Przykłady wyników z Bioanalyzer 2100 przedstawiono na rysunku 1.
Oprogramowanie Expert 2100 obliczy wskaźnik integralności RNA, czyli RIN, jako ilościowy pomiar jakości RNA. Próbki wysokiej jakości, z wartościami RIN wyższymi niż 9, są oczywiście najlepsze do zastosowań w mikromacierzach. Jednakże, do generowania danych z mikromacierzy o zadowalającej jakości wykorzystywaliśmy próbki z wartościami RIN tak niskimi jak 5,2.
Zespoły macierzy wysokiej jakości powinny generować silny sygnał przy stosunkowo niskich wartościach PMT. W naszym doświadczeniu oczekuje się, że większość transkryptów będzie występować na podobnych poziomach w próbce eksperymentalnej i referencyjnej; masywne, rozległe zmiany w ekspresji genów prawdopodobnie byłyby pozbawione znaczenia biologicznego. W związku z tym większość macierzy powinna mieć kolor żółty, a nie zielony lub czerwony. Sygnały wysokiej jakości powinny znajdować się również w zakresie dynamicznym takim, aby histogramy sygnałów w pełni się pokrywały. Przykłady przedstawiono na rysunku 2.
<img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig1.jpg" alt="Analiza integralności RNA: cztery wykresy elektroforezy, wartości RIN 9,0, 5,4, 2,7, 2,2; ocena jakości." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przykład czterech próbek RNA wyizolowanych z tkanki guza mózgu człowieka. RNA wyizolowano zgodnie z protokołem przedstawionym w 3.1.1. Jakość próbek oceniono za pomocą Bioanalyzer 2100 na chipie RNA 6000, zgodnie z opisem w 3.1.3. Próbki są reprezentatywne dla 4 różnych poziomów jakości RNA: A, bardzo dobra jakość RNA (RIN&gt;9); B, częściowo zdegradowane RNA (RIN 5-6, zwróć uwagę na znacznie niższy pik dla 28S rRNA); C, silnie zdegradowane RNA (RIN&lt;3); D, prawie całkowicie zdegradowane RNA (RIN=2). Z sukcesem wykorzystaliśmy próbki o jakości podobnej lub lepszej niż B (RIN&gt;5,2) w dalszych zastosowaniach z wykorzystaniem mikromacierzy. Pełne i puste groty strzałek wskazują odpowiednio pozycje frakcji 18S i 28S rRNA.
<img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig2.jpg" alt="Analiza mikromacierzy DNA; obraz macierzy, gęstość próbek, dane fluorescencyjne; wykres genomiki porównawczej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przykłady obrazów macierzy i wykresów rozrzutu. A, podgląd całego slajdu, pokazujący cztery macierze w formacie 4X44K Agilent; B, skan o wysokiej rozdzielczości jednego z obszarów macierzy, należy zauważyć, że żaden z sygnałów (czerwony lub zielony) nie dominuje; C, wykres rozrzutu obrazu z B, należy zauważyć, że sygnały w pełni się pokrywają i nie więcej niż 1x10-6 cech znajduje się na poziomie intensywności nasycenia.

<ol><li>Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+Decade+Later%3A+What+has+Gene+Expression+Profiling+Told+us+About+Neuronal+Cell+Types%2C+Brain+Function+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease.</a> Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).</li>
<li>Barisone, G. A. Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , SPRINGER SCIENCE+BUSINESS MEDIA, LLC. New York. (2010).</li>
<li>Gelder, R. N. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Profilowanie ekspresji z wykorzystaniem mikromacierzy DNA stanowi bezpośrednie podejście do identyfikacji genów o różnym poziomie ekspresji pomiędzy dwiema próbkami biologicznymi. Pomyślne eksperymenty z profilowania ekspresji wymagają wysokiej jakości próbek RNA, skutecznego znakowania oraz hybrydyzacji. W naszym doświadczeniu komercyjne macierze i zestawy do znakowania firmy Agilent dostarczają wysokiej jakości dane przy rozsądnym koszcie. Choć Agilent oferuje również własne urządzenia do hybrydyzacji i skanowania, preferujemy system hybrydyzacji firmy Roche-Nimblegen oraz skaner mikromacierzy GenePix 4000B firmy Molecular Devices. Należy zauważyć, że jednostka hybrydyzacyjna Roche-Nimblegen była wcześniej znana jako system hybrydyzacji MAUI. Po niedawnym przejęciu korporacyjnym przez Roche, mieszalniki A4 zostały wycofane z produkcji. W momencie pisania tego tekstu można je nadal znaleźć u innych sprzedawców, takich jak Kreatech Diagnostics (<a href="http://www.kreatech.com/">www.kreatech.com</a>; ta strona oferuje również wygodne narzędzie do sprawdzania kompatybilności macierzy), jednak długoterminowa dostępność zapasów jest niepewna. Dostępne są inne systemy hybrydyzacji (na przykład od firmy Agilent); niemniej jednak, jeśli uda się znaleźć kompatybilne mieszalniki dla używanej macierzy, rekomendujemy system Roche-Nimblegen ze względu na jego jakość i powtarzalność.

<table><tbody><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2943CA</td><td>Obejmuje stację przygotowawczą do chipów, wortexer, oprogramowanie i komputer przenośny</td></tr><tr><td>Zestaw do elektroforezy Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2947CA</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNA 6000 Nano</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td>obejmuje drabinę wielkości, marker, macierz żelową, barwnik, środki do czyszczenia elektrod, filtry wirówkowe i nanochipy</td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9780M</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania Quick Amp, dwukolorowy</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-0444</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do hybrydyzacji ekspresji genów</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-542</td><td>Obejmuje środek blokujący, bufor do fragmentacji i bufor do hybrydyzacji</td></tr><tr><td>Zestaw buforów do przemywania ekspresji genów</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5327</td><td>Obejmuje bufory do przemywania 1 i 2 oraz Triton X-102</td></tr><tr><td>Stacja hybrydyzacyjna</td><td>Roche Group</td><td>05223652001</td><td>Model na 4 slajdy</td></tr><tr><td>Zestaw akcesoriów do systemu hybrydyzacyjnego</td><td>Roche Group</td><td>05327695001</td><td>Zawiera zespół weryfikacyjny do testowania mieszania, zapasowe pierścienie O-ring, narzędzie do demontażu, pęsetę i wałek</td></tr><tr><td>Komory hybrydyzacyjne z mieszadłem A4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligo Microarray całego ludzkiego genomu (4x44)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4112F</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta o wyporze dodatnim</td><td>Gilson, Inc.</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>Tłoki kapilarne do pipety o wyporze dodatnim</td><td>Gilson, Inc.</td><td>F148415</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka do mikromacierzy</td><td>Nimblegen</td><td>05223636001</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny skaner mikromacierzy, Axon GenePix 4000B</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX4000B</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie GenePix Pro 6.0</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikromacierze dna: kontrola jakości próbek, hybrydyzacja i skanowanie macierzy

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Profilowanie ekspresji genów w układzie nerwowym za pomocą mikromacierzy stanowi potężne narzędzie do identyfikacji aktywności genów w różnych etapach rozwoju, w różnych stanach fizjologicznych lub patologicznych, w odpowiedzi na terapię, a w ogólnym ujęciu – w każdym stanie poddawanym testom eksperymentalnym1. Profilowanie ekspresji tkanek neuronalnych wymaga izolacji wysokiej jakości RNA, amplifikacji wyizolowanego RNA oraz hybrydyzacji z mikromacierzami DNA. W niniejszym artykule opisujemy protokoły powtarzalnych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy w tkance guza mózgu2. Rozpoczniemy od przeprowadzenia analizy kontroli jakości wyizolowanych próbek RNA przy użyciu technologii „lab-on-a-chip” z Bioanalizatora 2100 firmy Agilent. Wysoka jakość próbek RNA jest kluczowa dla powodzenia każdego eksperymentu z mikromacierzami, a Bioanalizator 2100 umożliwia szybki, ilościowy pomiar jakości próbki. Następnie próbki RNA są amplifikowane i znakowane poprzez przeprowadzenie odwrotnej transkrypcji w celu uzyskania cDNA, a następnie transkrypcji in vitro w obecności znakowanych nukleotydów w celu wytworzenia znakowanego cRNA. Korzystając z zestawu do znakowania dwukolorowego, znakujemy próbkę eksperymentalną Cy3, a próbkę referencyjną Cy5. Obie próbki zostaną następnie połączone i poddane hybrydyzacji z macierzami 4x44 K firmy Agilent. Macierze dwukolorowe oferują zaletę bezpośredniego porównania dwóch próbek RNA, co zwiększa dokładność pomiarów, szczególnie w przypadku niewielkich zmian poziomów ekspresji, ponieważ dwie próbki RNA hybrydyzują konkurencyjnie do jednej mikromacierzy. Macierze zostaną przeskanowane przy dwóch odpowiadających im długościach fal, a stosunek sygnału Cy3 do Cy5 dla każdego elementu posłuży jako bezpośredni pomiar względnej zawartości odpowiadającego mRNA. Analiza ta pozwala zidentyfikować geny, których ekspresja różni się w odpowiedzi na badane warunki eksperymentalne.

Prezentujemy zastosowanie mikromacierzy DNA w profilowaniu ekspresji układu nerwowego. Opisujemy kontrolę jakości RNA, znakowanie próbek oraz hybrydyzację i skanowanie macierzy.

Mikromacierze DNA: kontrola jakości próbek, hybrydyzacja i skanowanie macierzy

Profilowanie ekspresji za pomocą mikromacierzy w układzie nerwowym stanowi potężne podejście do identyfikacji aktywności genów na różnych etapach rozwoju, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie eksperymentu z wykorzystaniem mikromacierzy przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia mieszającego. Jest to realizowane poprzez wstępną analizę jakości próbek RNA za pomocą bioanalizatora po amplifikacji i znakowaniu RNA. Próbki RNA są następnie hybrydyzowane z mikromacierzyami.Na koniec zhybrydyzowane mikromacierze są płukane i skanowane. Ostatecznie uzyskuje się wyniki wykazujące różnicową ekspresję transkryptów RNA poprzez analizę obrazów z dwukolorowej fluorescencyjnej mikromacierzy. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy hybrydyzacji mikromacierzy są trudne do opanowania ze względu na specjalistyczny sprzęt.Analiza kontroli jakości rozpoczyna się od przygotowania instrumentu bioanalyzer 2100 oraz stacji do przygotowania chipów zgodnie z instrukcją w pisemnej procedurze. Następnie matrycę żelową filtruje się, pipetując 550 µL do filtra wirowego dostarczonego w zestawie RNA 6000 nano kit. Filtr wiruje się przy 1500 RCF przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie podziel przefiltrowany żel na aliquoty po 65 µL, które można przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego miesiąca. Wymieszaj koncentrat barwnika na wirówce typu vortex przez 10 sekund i dodaj 1 µL do aliquotu o objętości 65 µL. Po wymieszaniu przefiltrowanego żelu odwiruj próbki przy 13 000 RCF przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do analizy.Najpierw umieść chip na stacji przygotowawczej. W tej demonstracji zastosowano chipy RNA 6,000 nano. Nalej dziewięć µL mieszaniny barwnika do żelu do dołka oznaczonego białą literą G na czarnym tle.Ustaw końcówkę pipety na samym dnie dołka. Ustaw tłok strzykawki na poziomie 1 mL i zamknij stację przygotowawczą. Powoli, ale jednostajnie naciskaj tłok, aż zostanie on zatrzymany przez klips.Po 30 sekundach zwolnij zacisk i odczekaj kilka sekund, aż tłok się podniesie. Gdy tłok się zatrzyma, cofnij go do pozycji 1 ml i otwórz stację przygotowawczą. Nabierz 9 µL barwnika do żelu.Wymieszaj zawartość w obu studzienkach. Następnie nanieś 5 µL znacznika Mark G do studzienki z drabiną oraz do każdej z 12 studzienek z próbkami. Następnie nanieś 1 µL zdenaturowanej drabiny do studzienki z drabiną oraz 1 µL każdej zdenaturowanej próbki do odpowiednich studzienek z próbkami.Na koniec należy dodać jeden mikrolitr markera do każdej niewykorzystanej próbki. Po załadowaniu chipa, wstrząśnij nim w wortexie przez jedną minutę przy 2 400 RPM. Po uruchomieniu oprogramowania 2 100 expert, umieść chip w odpowiedniej pozycji i zamknij pokrywę.Upewnij się, że wybrano odpowiedni port i przeprowadź analizę w ciągu pięciu minut od nałożenia próbek, aby zapobiec parowaniu. Metody przeprowadzania amplifikacji i znakowania RNA znajdują się w protokole pisemnym. Po znakowaniu oczyść CRNA, aby usunąć nieinkorporowane nukleotydy. Przy użyciu kolumn cogens r an easy mini można następnie oznaczyć ilość znakowanego CRNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop 2000.W trybie pomiaru mikromacierzy należy zapisać stężenie próbki, wydajność oraz aktywność właściwą. W przypadku hybrydyzacji mikromacierzy konieczne jest uzyskanie wydajności wynoszącej co najmniej 825 nanogramów oraz aktywności właściwej wynoszącej co najmniej osiem pikomoli na mikrogram na co najmniej dwie godziny przed hybrydyzacją mikromacierzy. Włączyć stację hybrydyzacji i ustawić temperaturę na 65 °C.Niniejszy protokół opisuje zastosowanie macierzy Agilent 4x40 4K z systemem hybrydyzacji Roche NimbleGen i czterema komorami mieszającymi. Po fragmentacji cRNA przeprowadzonej zgodnie z opisem w protokole pisemnym, należy przygotować komorę hybrydyzacyjną. Umieść slajd z mikromacierzą w narzędziu do montażu i demontażu stroną z kodem kreskowym do dołu. Najpierw otwórz mieszalnik A i odsłoń klej utrzymujący macierz oraz narzędzie do montażu i demontażu, aby zapobiec jakimkolwiek przesunięciom.Umieść mieszalnik A4 na szkiełku, zaczynając od dalszego końca. Upewnij się, że jest on prawidłowo wyrównany względem narzędzia, a następnie przytwierdź mieszalnik wzdłuż matrycy. Pociągnij szkiełko za koniec mieszalnika, aby usunąć zespół szkiełko-mieszalnik.Używając narzędzia do dociskania, dociśnij całą krawędź uszczelki klejącej, aby upewnić się, że jest ona szczelnie przyklejona do szkiełka. Na ciemnym tle można dostrzec małe pęcherzyki powietrza uwięzione między klejem a szkiełkiem. Poświęć dodatkowy czas na usunięcie tych pęcherzyków za pomocą narzędzia do dociskania.Matryca jest teraz gotowa do załadowania. Należy użyć pipety wypierającej dodatnio, aby nabrać 100 µL próbki do hybrydyzacji. Należy mocno wsunąć końcówkę do otworu i powoli oraz płynnie dozować ciecz, aby w obszarze matrycy nie uwięzło powietrze.Gdy próbka pokryje całą matrycę i ciecz zacznie wypływać przez otwór odpowietrzający, szybko wyjmij pipetę, zwalniając jedynie tłok. Po odsunięciu końcówki od szkiełka delikatnie odsącz nadmiar cieczy z obu otworów, dbając o to, aby nie wyciągnąć próbki z samej komory. Następnie za pomocą pęsety zaklej otwory naklejkami.Umieść preparat na stacji do hybrydyzacji i upewnij się, że otwory w pęcherzyku są prawidłowo ustawione nad uszczelkami typu O-ring. Zapewni to właściwe mieszanie podczas hybrydyzacji. Zamknij pokrywę preparatu oraz pokrywę stacji.Ustaw stację w trybie mieszania B i przeprowadź hybrydyzację macierzy w temperaturze 65 °C przez 17 godzin. Po zakończeniu procesu napełnij szklaną szalkę oznaczoną jako A buforem do płukania 1; szalka powinna być wystarczająco duża, aby pomieścić narzędzie do montażu i demontażu oraz umożliwić swobodne manewrowanie. Wszystkie etapy płukania należy przeprowadzać w naczyniach szklanych, ponieważ plastik ma tendencję do uwalniania związków, co skutkuje wysokim tłem w macierzy.Do naczynia do barwienia włóż kasetkę na preparaty oraz mieszadło magnetyczne. Naczynie oznaczone literą B napełnij buforem do płukania 1 tak, aby zakryć kasetkę, a następnie postaw naczynie na mieszalce magnetycznej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo, do pustego naczynia do barwienia oznaczonego literą C włóż mieszadło magnetyczne i postaw je na mieszalce magnetycznej.Wyjmij macierz ze stacji hybrydyzacji i umieść ją w narzędziu do montażu i demontażu. Zanurz cały zestaw w naczyniu, trzymając jednocześnie narzędzie do montażu i demontażu oraz szkiełko przeciwnymi stronami w jednej dłoni. Ostrożnie odklej mieszalnik A4, uważając, aby nie porysować obszaru macierzy.Szybko umieść preparat na statywie i w naczyniu do barwienia B. Należy zminimalizować ekspozycję na powietrze, ponieważ barwnik SCI five jest wrażliwy na ozon. Płucz preparat przez jedną minutę, mieszając z umiarkowaną prędkością. Napełnij naczynie do barwienia C podgrzanym buforem płuczącym dwa.Przenieś preparaty i płucz przez jedną minutę. Po płukaniu bardzo powoli wyjmij kasetę z naczynia barwiącego C, aby zminimalizować liczbę kropel pozostałych na szkiełku. Wysusz preparat, wirując przez dwie minuty.Następnie należy umieścić preparat w probówce stożkowej o pojemności 50 ml i wypełnić ją argonem, a następnie niezwłocznie przeprowadzić skanowanie za pomocą skanera GenePix 4000B firmy Molecular Devices, aby uniknąć utraty sygnału. Oto przykłady czterech próbek RNA wyizolowanych z ludzkiego mózgu. Jakość próbek tkanki nowotworowej oceniono za pomocą analizatora 2100 na chipie RNA 6000.Zamknięte i otwarte groty strzałek wskazują odpowiednio pozycje frakcji 18 s i 28 S-R-R-N-A. Wskaźnik integralności RNA, czyli RIN, jest ilościową miarą jakości RNA. Próbki wysokiej jakości całkowitego RNA powinny wykazywać tylko dwa główne piki podczas analizy w bioanalizatorze w ramach kontroli jakości, odpowiadające dwóm głównym gatunkom rybosomalnego RNA.Pewna degradacja RNA objawi się w postaci smugi przed pierwszym pikiem RNA rybosomalnego oraz znacznie niższym pikiem 28 S-R-R-N-A w przypadku silnej degradacji. RNA niskiej jakości będzie wykazywać szeroki pik lub serię pików przy niskich czasach retencji. Jednocześnie dwa piki RNA rybosomalnego będą miały bardzo niską intensywność lub nie będą w ogóle identyfikowalne.Macierze wysokiej jakości powinny generować silny sygnał przy stosunkowo niskich wartościach PMT. Oczekuje się, że większość transkryptów będzie występować na podobnym poziomie w próbce badawczej i referencyjnej. Masowe, rozległe zmiany w ekspresji genów prawdopodobnie będą pozbawione znaczenia biologicznego.W związku z tym większość matrycy powinna mieć kolor żółty, a nie zielony lub czerwony. Sygnały dobrej jakości powinny znajdować się w zakresie dynamicznym takim, aby histogramy sygnałów w pełni się pokrywały, co widać na wykresie rozrzutu obrazu matrycy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat przeprowadzania eksperymentu z matrycami mikroarray przy użyciu zautomatyzowanego aparatu do hybrydyzacji.

dna-microarrays-sample-quality-control-array-hybridization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroarrayy DNA: Kontrola jakości próbek, hybrydyzacja matrycy i skanowanie

Niniejsze wideo jest demonstracją techniczną protokołu hybrydyzacji dla zestawu CGH z płytkami o gęstym pokryciu całego genomu (whole genome tiling path array CGH), który pozwala na przeskanowanie całego ludzkiego genomu przy użyciu zaledwie 25-100 ng DNA, które można wyizolować z różnych źródeł, w tym z archiwalnego materiału utrwalonego w formalinie.

Demonstracja techniczna porównawczej hybrydyzacji genomowej całego genomu z wykorzystaniem macierzy (array CGH)

Mikromacierze genów są potężnymi narzędziami w profilowaniu ekspresji genów na poziomie całego genomu. Technologia ta znajduje zastosowanie w wielu dyscyplinach biologicznych, w tym w biologii rozwoju i toksykologii. W tym filmie szczegółowo opisujemy protokół globalnej analizy ekspresji genów z wykorzystaniem kompleksowej platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla danio pręgowanego.

Analiza globalnej ekspresji genów z wykorzystaniem platformy mikromacierzy oligonukleotydowych dla ryby danio-ostrobramkowej

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przedstawiona jako niedroga alternatywa dla detekcji fluorescencyjnej w macierzach mikroukładów. W oparciu o fotopolimeryzację, ampliPHOX wytwarza stałe polimerowe plamki widoczne gołym okiem w zaledwie kilka minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, a zarazem wydajnego pakietu oprogramowania.

Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Opisano prostą procedurę przeprowadzania niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA. Kroki obejmują izolację RNA, znakowanie RNA i DNA referencyjnego, hybrydyzację próbek z mikromacierzami, skanowanie mikromacierzy oraz kwantyfikację i analizę sygnałów hybrydyzacji.

Przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA

Ten artykuł wideo opisuje metodę opartą na mikromacierzy in vitro, która pozwala określić cele genów i miejsca wiązania dla regulatorów odpowiedzi systemu dwuskładnikowego.

Metoda DAP-chip oczyszczona z powinowactwa DNA do określania celów genowych dla dwuskładnikowych systemów regulacyjnych bakteryjnych

Tablica CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych zastąpiła analizę kariotypów w pasmach G. W artykule opisano technologię i jej zastosowanie w laboratorium usług diagnostycznych.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych

Ten protokół dostarcza kroków eksperymentalnych i informacji o odczynnikach, sprzęcie i narzędziach analitycznych dla badaczy, którzy są zainteresowani przeprowadzeniem analizy porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) na bazie całego genomu zmian liczby kopii u roślin.

Oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów Medicago truncatula

W tym artykule prezentujemy i omawiamy nowe osiągnięcia w syntezie i zastosowaniach mikromacierzy kwasów nukleinowych wytwarzanych in situ. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób protokoły syntezy DNA można rozszerzyć na RNA i jak można wykorzystać mikromacierze do tworzenia pobieralnych bibliotek kwasów nukleinowych.

Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych

Poznaj protokół mikromacierzy DNA do profilowania ekspresji w układzie nerwowym, obejmujący kontrolę jakości RNA, hybrydyzację i skanowanie fluorescencyjne. Ta metoda umożliwia badaczom analizę różnicowej ekspresji transkryptów.

Mikromacierze DNA: kontrola jakości próbek, hybrydyzacja i skanowanie macierzy

Przeglądaj więcej filmów