Mikromacierze DNA: kontrola jakości próbek, hybrydyzacja i skanowanie macierzy

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie eksperymentu z mikromacierzą przy użyciu zautomatyzowanego aparatu mieszającego. Osiąga się to poprzez analizę jakości próbek RNA za pomocą bioanalizatora, a następnie amplifikację i znakowanie RNA. Próbki RNA są hybrydyzowane z mikromacierzami.

Na koniec zhybrydyzowane mikromacierze są myte i skanowane. Ostatecznie uzyskuje się wyniki, które pokazują zróżnicowaną ekspresję transkryptów RNA poprzez analizę dwukolorowych obrazów mikromacierzy fluorescencyjnych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy hybrydyzacji mikromacierzy są trudne do nauczenia się ze względu na specjalistyczny sprzęt.

Analiza kontroli jakości rozpoczyna się od przygotowania urządzenia do bioanalizowania 2 100 i stacji zasysania chipów, zgodnie z zaleceniami w pisemnej procedurze. Matryca żelowa jest następnie filtrowana przez pipetowanie 550 mikrolitrów do filtra wirowego wyposażonego w wirówkę RNA 6 000 nano kit. Filtr przy 1 500 RCF przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przefiltrowany żel podzielić na 65 mikrolitrowych porcji, które można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca. Wiruj koncentrat barwnika przez 10 sekund i dodaj jeden mikrolitr do podwielokrotności 65 mikrolitrów. Przefiltrowany żel po wirowaniu mieszaniny odwirować przy 13 000 RCF przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu uruchomienia próbek.

Najpierw umieść chip na stacji zasysającej. W tej demonstracji użyto 6 000 nano chippów. Załaduj dziewięć mikrolitrów mieszanki barwników żelowych do studzienki oznaczonej białą literą G na czarnym tle.

Końcówka pipety znajduje się na samym dnie studzienki. Ustawić tłok strzykawki na jednym mililitrze i zamknąć stację zasysającą. Wciskać tłok powoli, ale systematycznie, aż zostanie przytrzymany przez zacisk.

Po 30 sekundach zwolnij zacisk i pozwól tłokowi unieść się przez kilka sekund. Po zatrzymaniu tłoka pociągnąć go z powrotem do pozycji jednego mililitra i otworzyć stację zasysającą. Załaduj dziewięć mikrolitrów matrycy żelowej.

Wymieszaj w każdym z dwóch dołków. Znak G. Następnie wsyp pięć mikrolitrów markera do studzienki drabinkowej i do każdej z 12 studzienek na próbki. Następnie wsad, jeden mikrolitr denaturowanej drabiny do studzienki drabinkowej i jeden mikrolitr każdej denaturowanej próbki do studzienek na próbki.

Na koniec dodaj jeden mikrolitr markera do każdej niewykorzystanej próbki. Cóż, po załadowaniu wiruj chip przez jedną minutę przy 2 400 obr./min. Po uruchomieniu oprogramowania eksperckiego 2, 100 ustaw chip i zamknij pokrywę.

Upewnij się, że wybrano właściwy port i uruchom test w ciągu pięciu minut od załadowania próbek, aby zapobiec parowaniu. Metody przeprowadzania amplifikacji i znakowania RNA można znaleźć w pisemnym protokole. Po oznakowaniu oczyść CRNA, aby usunąć wszelkie nieinkorporowane nukleotydy Za pomocą kogenów i łatwych mini kolumn, znakowany CRNA można następnie określić ilościowo za pomocą fotometru widmowego NanoDrop 2000.

W trybie pomiaru mikromacierzy rejestruj stężenie próbki, wydajność i aktywność właściwą. W przypadku hybrydyzacji mikromacierzy konieczne jest osiągnięcie wydajności co najmniej 825 nanogramów i aktywności właściwej co najmniej ośmiu komoli na mikrogram co najmniej dwie godziny przed hybrydyzacją mikromacierzy. Włącz stację hybrydyzacyjną i ustaw na 65 stopni Celsjusza.

Protokół ten opisuje użycie matryc Agilent 4 na 40 4K z systemem hybrydyzacji Roche nimble gen i czterema komorami mieszalnika, po fragmentacji CRNA przeprowadzonej zgodnie z opisem w pisemnym protokole, przygotuj komorę hybrydyzacyjną. Umieść slajd z mikromacierzą po stronie narzędzia do demontażu zestawu z kodem kreskowym. Najpierw otwórz mieszalnik A four i odsłoń klej przytrzymujący matrycę i narzędzie do demontażu zespołu, aby zapobiec wszelkim ruchom.

Umieść mikser A four na szkiełku, zaczynając od drugiego końca. Upewnij się, że jest prawidłowo wyrównany z narzędziem i przyklej mikser wzdłuż tablicy. Przesuń pociągnij za koniec miksera, aby wyjąć zespół miksera suwakowego.

Za pomocą narzędzia do ryglowania dociśnij uszczelkę samoprzylepną wzdłuż całej długości, aby upewnić się, że jest mocno przyklejona do prowadnicy. Na ciemnym tle widać małe pęcherzyki powietrza uwięzione między klejem a szkiełkiem. Poświęć więcej czasu na usunięcie tych bąbelków za pomocą narzędzia do ryczenia.

Macierz jest teraz gotowa do załadowania. Użyj czynnika wyporowego, aby załadować 100 mikrolitrów próbki hybrydyzacji. Wciśnij mocno końcówkę do iluminatora i dozuj powoli i płynnie, aby powietrze nie zostało uwięzione w obszarze matrycy.

Gdy próbka pokryje całą matrycę, a ciecz zacznie wypływać, otwór odpowietrzający szybko wyjmij pipetę, a jedynie zwolnij tłok. Gdy końcówka znajdzie się z dala od szkiełka, delikatnie przetrzyj nadmiar płynu w oba porty, uważając, aby nie pobrać próbki z samej komory. Następnie przykryj iluminatory naklejkami za pomocą pęsety.

Umieść szkiełko na stacji hybrydyzacji i sprawdź, czy otwory pęcherza są prawidłowo umieszczone nad O-ringami. Zapewni to prawidłowe mieszanie podczas hybrydyzacji. Zamknij przesuwaną pokrywę i pokrywę stacji.

Ustaw stację w trybie mieszania B i hybrydyzuj matrycę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 17 godzin. Po zakończeniu napełniania szklanego naczynia oznaczonego jako A z buforem do mycia, naczynie powinno być wystarczająco duże, aby pomieścić narzędzie do demontażu zespołu i umożliwić pewne manewrowanie. Wszystkie mycia powinny być wykonywane w naczyniach szklanych, ponieważ plastik ma tendencję do wypłukiwania związków, co powoduje wysokie tło w układzie.

Umieść stojak na szkiełka i mieszadło w naczyniu do barwienia. Oznaczone jako B, napełnij naczynie buforem do mycia zakrywającym ruszt i umieść naczynie na talerzu mieszającym w temperaturze pokojowej. Dodaj również mieszadło do pustego naczynia do barwienia oznaczonego C i umieść na talerzu do mieszania.

Wyjmij macierz ze stacji hybrydyzacji i umieść ją w narzędziu do demontażu zespołu. Zanurz cały zespół w naczyniu, trzymając jedną ręką narzędzie do demontażu zespołu i suwak z przeciwnych stron. Ostrożnie zdejmij mikser A four, uważając, aby nie zarysować obszaru tablicy.

Szybko umieść szkiełko na stojaku i naczyniu barwiącym B. Narażenie na powietrze powinno być zminimalizowane, ponieważ barwnik SCI five jest wrażliwy na ozon. Myj gumkę przez minutę, mieszając na średnich obrotach. Napełnij naczynie barwiące C wstępnie ciepłym buforem do mycia dwa.

Przenieś szkiełka i myj przez minutę. Po umyciu bardzo powoli wyjmij ruszt na szkiełko z naczynia do barwienia C, aby zminimalizować kropelki pozostawione na szkiełku. Wysuszyć szkiełko, obracając je przez dwie minuty.

Następnie umieść szkiełko w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i natychmiast napełnij argonem, skanując za pomocą skanera genów 4 000 B z urządzeń molekularnych, aby uniknąć pokazanej utraty sygnału. Oto przykłady czterech próbek RNA wyizolowanych z ludzkiego mózgu. Jakość próbki tkanki nowotworowej oceniano za pomocą bioanalizatora 2 100 na chipie RNA 6 000.

Pełne i otwarte groty strzałek wskazują pozycję odpowiednio gatunków 18 s i 28 S-R-R-N-A. Liczba integralności RNA lub RIN jest ilościową miarą jakości RNA dobrej jakości Total. Próbki RNA powinny wytwarzać tylko dwa główne piki, gdy są uruchamiane w bioanalizatorze w celu kontroli jakości odpowiadającym dwóm głównym gatunkom rybosomalnego RNA.

Pewna degradacja RNA objawi się jako rozmaz przed pierwszym pikiem rybosomalnego RNA i znacznie niższym pikiem dla 28 S-R-R-N-A poważnie zdegradowanym. RNA niskiej jakości będzie wykazywać szeroki pik lub serię pików przy niskich czasach retencji. Podczas gdy dwa piki rybosomalnego RNA będą miały bardzo niską intensywność lub w ogóle nie będą możliwe do zidentyfikowania.

Dobrej jakości matryce powinny generować wysoki sygnał przy stosunkowo niskich wartościach PMT. Oczekuje się, że większość transkryptów będzie obecna na podobnym poziomie w próbie eksperymentalnej i referencyjnej. Ogromne, powszechne zmiany w ekspresji genów prawdopodobnie nie będą miały żadnego znaczenia biologicznego.

W związku z tym większość tablicy powinna wyglądać na żółtą, a nie zieloną lub czerwoną. Sygnały dobrej jakości powinny również znajdować się w zakresie dynamicznym, tak aby histogramy sygnałów w pełni się pokrywały, jak widać na wykresie rozrzutu obrazu tablicy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić eksperyment z mikromacierzą przy użyciu automatycznego aparatu hybrydyzacyjnego.