Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie porównawczej hybrydyzacji genomowej na mikromacierzy w celu zidentyfikowania niezrównoważeń w genomie, które mogą prowadzić do szerokiej gamy chorób genetycznych. Jest to realizowane poprzez wstępne znakowanie DNA pacjenta barwnikiem fluorescencyjnym. W drugim kroku DNA pacjenta oraz inaczej znakowane DNA referencyjne są hybrydyzowane z mikromacierzą.

Następnie macierz jest skanowana w celu zmierzenia ilości DNA pacjenta i DNA referencyjnego związanych z każdą sondą. W ostatnim kroku obraz ze skanowania jest przetwarzany, aby zidentyfikować regiony genomu, w których DNA pacjenta wykazuje większą lub mniejszą ilość materiału niż DNA referencyjne na macierzy. Porównawcza hybrydyzacja genomowa jest stosowana w celu ustalenia, czy pacjent posiada wariant liczby kopii, który prowadzi do wystąpienia zespołu genetycznego.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ montaż szkiełka z matrycą może być trudny, a hybrydyzacja podatna na błędy. Przed rozpoczęciem reakcji znakowania wymieszaj zawartość komory. Rozmroź gotową do użycia płytkę 96-dołkową z nukleotydami i starterami w temperaturze 4 °C, chroniąc ją przed światłem przez około godzinę.

Po rozmrożeniu pozostaw przykrytą płytkę na kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej w celu wyrównania temperatury; w tym samym czasie inkubuj próbki DNA przez 15 minut w temperaturze 60°C. Podczas ogrzewania próbek użyj robota do manipulacji cieczami, aby rozdać odpowiednią ilość wody wolnej od nukleaz do każdej studzienki nowej płytki 96-dołkowej. Następnie, gdy DNA będzie gotowe, przenieś 1 µg próbki na studzienkę do płytki 96-dołkowej z wodą.

Następnie przenieś 20 µL nukleotydów równoważących i starterów do każdej studzienki płytki zawierającej rozcieńczone próbki DNA i zamknij płytkę nakładkami paskowymi, dbając o szczelne zamknięcie. Następnie zdenaturuj DNA w temperaturze 99 °C w termocyklerze z grzaną pokrywą przez 10 minut i zwiąż startery poprzez szybkie schłodzenie płytki na lodzie przez pięć minut. Następnie użyj robota do obsługi cieczy, aby dodać 10 µL enzymu polimerazy DNA clean out exo do każdej próbki.

Wymieszaj próbki za pomocą pipety, a następnie zamknij płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37°C przez 16 godzin. Następnego dnia zatrzymaj reakcję, dodając 5 µL buforu stopującego do każdego dołka. Następnie usuń niewbudowane nukleotydy. Przenieś zawartość każdego dołka do oddzielnych, wcześniej oznakowanych probówek o pojemności 2 mL.

Załaduj próbki, kolumny wirowe do oczyszczania DNA oraz odpowiednie bufory pomocnicze do robota do przetwarzania kolumn wirowych. Zgodnie z instrukcjami producenta, robot do przetwarzania kolumn wirowych zwiąże znakowane DNA z membraną krzemionkową przy użyciu 250 µL buforu do wiązania DNA o wysokim stężeniu soli na probówkę, po czym z membran zostaną usunięte zanieczyszczenia poprzez dwa przemycia, każdorazowo 500 µL buforu do przemywania. Następnie robot doda do membran 15 µL buforu do elucji o niskim stężeniu soli, aby odzyskać oczyszczone próbki znakowanego DNA w objętościach około 12 µL w celu przeprowadzenia hybrydyzacji próbek.

Następnie rozgrzej piec do hybrydyzacji do 65 °C i podgrzej szkiełka podkładowe oraz komory hybrydyzacyjne. Aby przygotować mieszaninę do hybrydyzacji, połącz 1,1 µL cot 1D NA, 4,95 µL mieszaniny blokującej dostarczonej przez producenta oraz 24,75 µL buforu do hybrydyzacji. Użyj robota do obsługi cieczy, aby rozdzielić tę mieszaninę do każdego dołka nowej płytki 96-dołkowej, uprzednio zwilżając każdą końcówkę w celu zwiększenia dokładności transferu.

Następnie pipetuj 9,35 µL odpowiednio znakowanego DNA 3, a następnie 9,35 µL odpowiednio znakowanego DNA 5. Uszczelnij płytkę w każdym dołku, wiruj próbki przez jedną minutę i krótko zakręć płytkę, aby zebrać zawartość na dnie każdego dołka. Zdenaturuj znakowane DNA w inkubatorze do prehybrydyzacji.

Najpierw przez trzy minuty w temperaturze 95°C, następnie przez 30 minut w temperaturze 37°C. Następnie należy pracować na platformie grzewczej o temperaturze 42°C. Umieść szkiełko nośne w komorze hybrydyzacyjnej, upewniając się, że przezroczysta część uszczelki pokrywa się z okienkiem komory hybrydyzacyjnej, używając wcześniej zwilżonych końcówek.

Teraz powoli pipetuj 42 µL mieszaniny do hybrydyzacji do środka odpowiedniej pozycji na szkiełku podkładowym macierzy. Należy uważać, aby ciecz nie dotknęła krawędzi gumowego pierścienia. Po wypełnieniu wszystkich pozycji ostrożnie opuść szkiełko macierzy na szkiełko podkładowe i złóż komorę hybrydyzacyjną.

Upewniając się, że strona macierzy z napisami jest skierowana w stronę szkiełka podkładowego, należy całkowicie dokręcić śrubę komory hybrydyzacyjnej i sprawdzić zmontowaną komorę, aby potwierdzić brak wycieków mieszaniny hybrydyzacyjnej poza obręb pierścienia gumowego oraz upewnić się, że każdy pęcherzyk powietrza ma wysokość około 4 mm. Aby to sprawdzić, należy ustawić komorę hybrydyzacyjną pionowo na jednym z końców i nią obrócić.

Wszystkie pęcherzyki powietrza w każdej pozycji poruszają się. Jeśli którykolwiek z pęcherzyków utknie, należy energicznie stuknąć komorą o blat. Następnie komory do hybrydyzacji należy umieścić w obrotowym inkubatorze w temperaturze 65 °C na 24 godziny.

Następnego dnia należy zanurzyć komory hybrydyzacyjne w buforze piorącym nr 1, a następnie za pomocą plastikowych pęset o płaskich końcach delikatnie rozdzielić szkiełka. Po tym zabiegu należy usunąć szkiełka uszczelniające, a szkiełka z macierzą umieścić w statywie zanurzonym w świeżym buforze nr 1. Płukanie szkiełek z macierzą należy przeprowadzić w około 700 ml buforu piorącego przez okres od jednej do pięciu minut, intensywnie mieszając roztwór za pomocą magnetycznego mieszadełka i pchełki.

Następnie przenieś szkiełka z matrycą do około 700 ml buforu płuczącego, płucząc je dwukrotnie przez 90 s, z intensywniejszym mieszaniem pod koniec drugiego płukania. Ostrożnie wyjmij szkiełka z matrycą z buforu. Powinny być one suche.

Następnie umieść szkiełka z macierzami w uchwytach skanera wraz z osłonami szkiełek, a następnie przeprowadź skanowanie próbek. Zgodnie z instrukcjami producenta macierzy, każda sonda na zhybrydyzowanej macierzy jest wizualizowana jako mieszanina czerwonych i zielonych fluorochromów. Stosunki sygnału fluorescencji czerwonej do zielonej dla każdej sondy są kwantyfikowane przez skaner, a powiązane oprogramowanie nanosi je jako wartości log2 stosunku w zależności od ich pozycji genomowej.

Otrzymane ślady macierzy pozwalają na interpretację obszarów zidentyfikowanych jako genomowo niezrównoważone. Na przykład, na tym śladzie pochodzącym od dziecka z zespołem Williamsa — nawracającym zespołem mikrodelecyjnym wywołanym przez niskokopiowe powtórzenia w proksymalnym regionie chromosomu 7 — niezrównoważenie genomowe zostało zidentyfikowane przez oprogramowanie za pomocą czerwonej linii. Logarytmiczny stosunek fluorescencji powinien skupiać się blisko zera, co wskazuje na stosunek zielonego do czerwonego sygnału wynoszący jeden do jednego dla prawidłowych regionów genomu.

Rozproszone ślady macierzy zaobserwowane w tym skanie mogą prowadzić do błędnego określenia regionów nieprawidłowych lub do niezdolności do zidentyfikowania niezrównoważenia genomowego i mogą być spowodowane szeregiem czynników, w tym niską jakością DNA, obecnością promieniowania lub poziomem ozonu w atmosferze. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować próbki pacjentów do badania aCGH oraz jak uzyskać dane dobrej jakości do dalszych analiz i detekcji zmienności liczby kopii.