Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie porównawczej hybrydyzacji genomowej w celu zidentyfikowania zaburzeń równowagi w genomie, które mogą prowadzić do wielu różnych chorób genetycznych. Osiąga się to poprzez uprzednie znakowanie DNA pacjenta barwnikiem fluorescencyjnym. W drugim etapie pacjent, DNA i inaczej znakowane referencyjne DNA, są hybrydyzowane z matrycą.

Następnie matryca jest skanowana w celu zmierzenia ilości pacjenta i referencyjnej DN obfitującej w każdą sondę. W ostatnim kroku zeskanowany obraz jest przetwarzany w celu zidentyfikowania regionów genomu, w których DNA pacjenta ma więcej lub mniej materiału niż ostateczny układ referencyjnego DNA. Porównawcza hybrydyzacja genomowa służy do określenia, czy pacjent jest nosicielem wariantu liczby kopii, który powoduje zespół genetyczny.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ montaż szkiełka matrycowego może być trudny i łatwy do hybrydyzacji. Wymieszać rozlany płyn z komory przed rozpoczęciem reakcji etykietowania. Rozmrozić gotową do użycia 96-dołkową płytkę nukleotydów i starterów w temperaturze czterech stopni Celsjusza i chronić przed światłem przez około godzinę.

Po rozmrożeniu równoważ przykrytą płytkę przez kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej, w tym czasie również równoważ próbki DNA przez 15 minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Podczas podgrzewania próbek użyj robota do obsługi cieczy, aby dozować wystarczającą ilość wody wolnej od nukleaz do każdej studzienki nowej płytki 96-dołkowej. Następnie, gdy DNA jest gotowe, przenieś jeden mikrogram próbki na studzienkę do 96-dołkowej płytki z wodą.

Teraz przenieś 20 mikrolitrów równoważących nukleotydów i starterów do każdej z płytek zawierających rozcieńczone próbki DNA i uszczelnij płytkę nakrętkami paskowymi, uważając, aby uzyskać szczelne uszczelnienie. Następnie po 10 minutach należy denaturować DNA w temperaturze 99 stopni Celsjusza w maszynie do PCR z podgrzewaną pokrywką i zaklęć startery, schładzając płytkę na lodzie przez pięć minut. Następnie użyj robota do obsługi cieczy, aby dodać 10 mikrolitrów czystego enzymu polimerazy egzoDNA do każdej próbki.

Wymieszać próbki za pomocą pipety, a następnie zamknąć i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Następnego dnia zakończ reakcję pięcioma mikrolitrami buforu zatrzymującego na studzienkę, a następnie usuń niewłączone nukleotydy. Przenieś zawartość każdej studzienki do indywidualnych, wstępnie oznakowanych dwumililitrowych probówek.

Załaduj próbki i kolumny wirowe do oczyszczania DNA do robota przetwarzającego kolumny wirowe, a także odpowiednie powiązane. Zgodnie z instrukcjami producenta, robot przetwarzający kolumnę wirującą zwiąże znakowane DNA z membraną krzemionkową za pomocą 250 mikrolitrów buforu wiążącego DNA o wysokiej zawartości soli na probówkę, po czym zanieczyszczenia zostaną usunięte z membran za pomocą dwóch płukań po 500 mikrolitrów każde. Następnie robot doda 15 mikrolitrów buforu roztworu o niskiej zawartości soli do membran, aby odzyskać oczyszczone znakowane próbki DNA w objętościach około 12 mikrolitrów w celu hybrydyzacji próbek.

Następnie rozgrzej piec do hybrydyzacji do 65 stopni Celsjusza i podgrzej szkiełka podkładowe oraz komory hybrydyzacyjne. Aby przygotować mieszankę hybrydyzacyjną, połącz 1,1 mikrolitra łóżeczka 1D NA, 4,95 mikrolitra dostarczonej przez producenta mieszanki blokującej i 24,75 mikrolitrów buforu hybrydyzacyjnego. Użyj robota do obsługi cieczy, aby przydzielić tę mieszaninę do każdej studzienki nowej 96-dołkowej płytki, wstępnie zwilżając każdą końcówkę, aby zwiększyć dokładność transferu.

Następnie odpipetować 9,35 mikrolitra odpowiedniego znakowania, trzy znakowane DNA, a następnie 9,35 mikrolitrów odpowiedniego znakowania, pięć znakowanych DNA. Aby każda studzienka uszczelniła płytkę, należy cztery próbki przez jedną minutę i szybko obrócić płytkę, aby zebrać zawartość na dnie każdej z nich. Dobrze denaturować znakowane DNA w inkubatorze przed hybrydyzacją.

Najpierw przez trzy minuty w temperaturze 95 stopni Celsjusza, a następnie przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie praca na platformie podgrzewanej w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Umieść szkiełko nośne w komorze hybrydyzacji, upewniając się, że przezroczysta część uszczelki jest wyrównana z okienkową częścią komory hybrydyzacji za pomocą wstępnie zmoczonych końcówek.

Teraz powoli odpipetować 42 mikrolitry mieszanki hybrydyzacyjnej do środka odpowiedniej pozycji szkiełka podkładowego matrycy. Uważając, aby płyn nie dotykał granicy gumowego pierścienia. Gdy wszystkie pozycje zostaną wypełnione, ostrożnie opuść suwak matrycy na suwak podkładowy i zmontuj komorę hybrydyzacyjną.

Zwracając uwagę, aby strona tablicy z napisem była skierowana w stronę suwaka nośnego, należy całkowicie dokręcić komory hybrydyzacji i sprawdzić zmontowaną komorę hybrydyzacyjną, potwierdzając, że nie ma wycieku hybrydyzacji. Wymieszać poza granicami gumowego pierścienia i upewnić się, że każdy pęcherzyk powietrza ma około czterech milimetrów wysokości. Gdy komora hybrydyzacji spoczywa na swoim końcu pionowo, obróć komorę hybrydyzacyjną, aby to sprawdzić.

Wszystkie pęcherzyki powietrza w każdej pozycji poruszają się. Jeśli któraś z bąbelków utknęła, mocno uderz komorę w ławkę. Następnie umieść komory hybrydyzacyjne w piekarniku obrotowym w temperaturze 65 stopni Celsjusza na 24 godziny.

Następnego dnia zanurz komory hybrydyzacyjne w pierwszym buforze do mycia i użyj pary plastikowych kleszczy o płaskich krawędziach, aby podważyć szkiełka. Następnie wyrzuć prowadnice uszczelek i umieść suwaki matrycy w stojaku, zanurz się w nowym buforze. Umyj szkiełka w około 700 mililitrach buforu do płukania przez jedną do pięciu minut, energicznie mieszając pchłą i gwiazdą magnetyczną.

Następnie przenieś szkiełka do około 700 mililitrów bufora do płukania, dwa na 90 sekund z bardziej energicznym mieszaniem pod koniec drugiego prania. Delikatnie podnieś prowadnice macierzy z bufora. Powinny wyschnąć.

Następnie załaduj szkiełka do uchwytów szkiełek przy skanerze wraz z ochraniaczami szkiełek, a następnie zeskanuj próbki. Zgodnie z instrukcjami producenta matrycy, każda sonda na hybrydyzowanej matrycy jest wizualizowana jako mieszanina czerwonych i zielonych fluorochromów. Proporcje sygnału fluorescencyjnego czerwonego do zielonego dla każdej sondy są określane ilościowo przez skaner, a powiązane oprogramowanie grupuje je jako stosunki logarytmiczne dwa zgodnie z ich pozycją genomową.

Uzyskane w ten sposób ślady macierzy pozwalają na interpretację regionów zidentyfikowanych jako niezrównoważone genomowo. Na przykład w tym śladzie od dziecka z zespołem Williamsa, nawracającym zespołem mikrodelecji, w którym pośredniczy mała liczba powtórzeń kopii w proksymalnym regionie chromosomu siódmego, nierównowaga genomowa została zidentyfikowana przez oprogramowanie za pomocą czerwonej linii. Stosunek logarytmu fluorescencyjnego rekwizytu powinien skupiać się blisko zera, wskazując na stosunek koloru zielonego do czerwonego równy jeden do jednego dla normalnych regionów genomu.

Rozproszone ślady matrycy, jak zaobserwowano w tym skanie, mogą skutkować niedokładnym wywoływaniem nieprawidłowych regionów lub niemożnością zidentyfikowania nierównowagi genomowej i mogą być spowodowane wieloma czynnikami, w tym niską jakością DNA lub obecnością promieni, poziomem ozonu w sferze atmosfery. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przetwarzać próbki pacjentów do badania przez A CGH i uzyskiwać dobrej jakości dane do dalszej analizy i wykrywania zmienności liczby kopii.