Name: Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę array CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych w diagnostyce chorób genetycznych. Technika ta pozwala na precyzyjną identyfikację niezrównoważeń chromosomalnych u pacjentów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

1. Reakcja na etykietowanie
<ol>
	<li>Przed użyciem wstępnie wyznacznikowane cyjaniną 3 i 5 dUTP, nieznakowane nukleotydy i losowe startery w stężeniach zalecanych przez producenta umieścić na 96-dołkowych płytkach i przechowywać w temperaturze -20 C w stanie gotowym do użycia. Do celów niniejszego protokołu, do każdego dołka należy podwielokrotność 10,5 μl odpowiedniego znakowanego dUTP i 10,5 μl nieznakowanych nukleotydów i losowych starterów.</li>
	<li>Rozmrażać gotową do użycia 96-dołkową płytkę nukleotydów i starterów w temperaturze 4 °C przez około 1 godzinę, chroniąc ją przed światłem.</li>
	<li>Po rozmrożeniu należy zrównoważyć tę płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, chroniąc ją przed światłem.</li>
	<li>Równoważyć próbki DNA w temperaturze 60 °C przez co najmniej 15 minut.</li>
	<li>Za pomocą robota do obsługi cieczy dozuj wodę wolną od nukleaz do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce. 
	UWAGA: Objętość wody będzie zależeć od stężenia każdej wejściowej próbki DNA i powinna być wystarczająca, aby uzyskać końcowe stężenie 50 ng / ul.</li>
	<li>Używając robota do obsługi cieczy, odpipetować 1 μg DNA do dołka na płytce 96-dołkowej (patrz 1.5), aby uzyskać całkowitą objętość do 20 μl. 
	UWAGA: Można użyć mniejszych ilości DNA, chociaż jakość uzyskanych danych może być zagrożona (w przypadku cennych próbek można użyć wejściowych ilości DNA do 400 ng).</li>
	<li>Za pomocą robota do obsługi cieczy przenieś 20 μl zrównoważonych nukleotydów i starterów do każdej studzienki płytki rozcieńczonego DNA.</li>
	<li>Uszczelnij 96-dołkową płytkę nakrętkami paskowymi (kluczowe znaczenie ma szczelne uszczelnienie).</li>
	<li>Denaturować DNA w temperaturze 99 °C przez 10 minut w maszynie do PCR z podgrzewaną pokrywką, a następnie schłodzić na lodzie przez 5 minut, aby wyżarzyć startery.</li>
	<li>Za pomocą robota do obsługi cieczy dodaj 10 μl enzymu polimerazy DNA Klenow Exo do każdego DNA i dokładnie wymieszaj pipetą. 
	UWAGA: Całkowita objętość powinna wynosić 50 μl.</li>
	<li>Zamknąć 96-dołkową płytkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godz. 
	UWAGA: Wystarczająca jest krótsza inkubacja trwająca 4 godziny, jednak inkubacja O/N może być wygodniejsza.</li>
	<li>Za pomocą robota do obsługi cieczy dodać 5 μl buforu zatrzymującego do każdej studzienki. 
	UWAGA: Podsumowanie odczynników stosowanych w reakcji znakowania przedstawiono w Tabeli 1.</li>
</ol>
2. Usuwanie nieinkorporowanych nukleotydów
<ol>
	<li>Usuń nieinkorporowane nukleotydy za pomocą kolumn wirowych opartych na membranie krzemionkowej i dedykowanego robota przetwarzającego kolumny wirowe (kolumny wirowe mogą być również przetwarzane ręcznie). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Przenieść zawartość każdej studzienki do probówki o pojemności 2 ml; wstępnie oznaczyć je identyfikatorami studzienek. 
		UWAGA: Ten krok można wykonać ręcznie lub najlepiej za pomocą robota do obsługi cieczy.</li>
		<li>Jeśli używasz robota przetwarzającego kolumnę wirową, załaduj robota probówkami o pojemności 2 ml, kolumnami wirowymi do oczyszczania DNA i powiązanymi.</li>
		<li>Dodać 250 μl buforu wiążącego DNA o wysokiej zawartości soli (bufor PB) do reakcji znakowania, aby związać znakowane DNA z błoną krzemionkową.</li>
		<li>Usunąć zanieczyszczenia poprzez dwukrotne przemycie membrany 500 μl buforem płuczącym (bufor PE).</li>
		<li>Dodać 15 μl buforu elucyjnego o niskiej zawartości soli (bufor EB) do membrany, aby odzyskać oczyszczone, znakowane DNA w objętości ~12 μl.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Połącz pary Hyb
<ol>
	<li>Połącz odpowiednie pary DNA znakowanego cyjaniną 3 i 5, DNA COT-1, dostarczoną przez producenta mieszankę blokującą i dostarczony przez producenta bufor hybrydyzacyjny za pomocą robota do obsługi cieczy. 
	UWAGA: Te pary hyb mogą być próbką i odniesieniem lub próbka kontra próbka, jeśli wspólne CNV nie stanowią problemu (np. rutynowo łączymy w pary próbki niedopasowane fenotypiowo, takie jak pacjent z dysplazją nerek i pacjent z kraniosynostozą, ponieważ jest bardzo mało prawdopodobne, aby zawierały one ten sam klinicznie istotny CNV). W przypadku stosowania referencyjnego DNA zaleca się komercyjne zaopatrzenie go w DNA, które powinno być przetwarzane razem z próbką.
	<ol>
		<li>Za pomocą robota do obsługi cieczy dodaj DNA COT-1 (3333 ng / μl), dostarczoną przez producenta mieszankę blokującą i bufor hybrydyzacyjny do każdej studzienki 96-dołkowej płytki, tak aby każda studzienka zawierała 1,1 μl DNA COT-1, 4,95 μl mieszanki blokującej i 24,75 μl buforu hybrydyzacyjnego.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 9,35 μl odpowiedniego DNA znakowanego cyjaniną 3. Wstępnie zwilż każdą końcówkę, aby zwiększyć dokładność pipetowania.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 9,35 μl odpowiedniego DNA znakowanego cyjaniną 5. Wstępnie zwilż każdą końcówkę, aby zwiększyć dokładność pipetowania.</li>
		<li>Zamknij 96-dołkową płytkę i wiruj przez 1 minutę. Zakręć 96-dołkową płytką, aby zebrać zawartość na dnie każdej studzienki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Hybrydyzacja
<ol>
	<li>Rozgrzej piec do hybrydyzacji do 65oC i podgrzej jedno szkiełko podstawowe i jedną komorę hybrydyzacyjną na każde szkiełko macierzy.
	<ol>
		<li>Denaturować znakowane DNA w inkubacji przed hybrydyzacją przed nałożeniem na matryce. Wykonaj hybrydyzację w piecu obrotowym przez 24 godziny.</li>
		<li>Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 70 °C przez 30 minut, a następnie pozostawić w temperaturze 37 °C na co najmniej 5 minut.</li>
		<li>Pracując na podgrzewanej platformie w temperaturze 42 °C, przed użyciem załaduj każdy szkiełko nośne do komory hybrydyzacyjnej. Upewnij się, że przezroczysta część suwaka uszczelki jest wyrównana z "okienkową" częścią komory hybrydyzacji.</li>
		<li>Odpipetować 42 μl przygotowanej wcześniej mieszanki do hybrydyzacji (patrz sekcja 3) na odpowiednie miejsce na szkiełku podstawowym matrycy. Wstępnie zwilż każdą końcówkę, aby zwiększyć dokładność pipetowania. Powoli pipetuj na środek każdej pozycji, upewniając się, że płyn nie dotyka granicy gumowego pierścienia.</li>
		<li>Gdy wszystkie pozycje na szkiełku podkładowym zostaną wypełnione, ostrożnie opuść na nim suwak matrycy i zmontuj komorę hybrydyzacyjną. Upewnij się, że strona tablicy, na której znajduje się napis, jest skierowana w stronę suwaka podkładowego. Pamiętaj, aby całkowicie dokręcić komory hybrydyzacji.</li>
		<li>Sprawdź zmontowaną komorę hybrydyzacyjną. Upewnij się, że nie ma wycieku mieszanki hybrydyzacyjnej poza granice gumowego pierścienia, a każdy pęcherzyk powietrza ma wysokość ~ 4 mm, gdy komora hybrydyzacji spoczywa pionowo na swoim końcu. Obróć komorę hybrydyzacyjną i sprawdź, czy nie ma pęcherzyków powietrza, które utknęły na miejscu i nie poruszają się. Jeśli jest którykolwiek z nich, mocno postukaj w ławkę. Sprawdź, czy wszystkie pęcherzyki powietrza się poruszają.</li>
		<li>Umieścić komorę hybrydyzacyjną w piecu obrotowym w temperaturze 65 °C na 24 godziny. Upewnij się, że wirnik piekarnika jest wyważony; w razie potrzeby użyj innych pustych komór.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Mycie i skanowanie slajdów
<ol>
	<li>Umyj matryce, aby usunąć nadmiar znakowanego DNA, a następnie zeskanuj, aby zmierzyć fluorescencję każdej sondy.
	<ol>
		<li>Wyjmij komory hybrydyzacyjne z piekarnika i zdemontuj. Prowadnice i prowadnice uszczelek zostaną ze sobą sklejone; Zanurz je w buforze do mycia 1 i użyj plastikowych kleszczy o płaskich krawędziach, aby je podważyć.</li>
		<li>Wyrzuć suwak uszczelki i umieść suwak matrycy w stojaku zanurzonym w buforze 1.</li>
		<li>Umyj szkiełko w ~700 ml świeżego buforu do płukania 1 przez 5 minut, energicznie mieszając (użyj pcheł i mieszadła magnetycznego).</li>
		<li>Przenieś szkiełko do ~700 ml buforu do płukania 2 i myj przez 90 sekund, energicznie mieszając. Delikatnie wyjmij prowadnice matrycy z bufora płuczącego 2, powinny wyschnąć.</li>
		<li>Załaduj szkiełko matrycy do uchwytu suwaka skanera za pomocą osłony suwaka. Załaduj szkiełko do skanera macierzy i zeskanuj zgodnie z instrukcjami producenta macierzy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+statement%3A+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years%27+clinical+application+for+over+8%2C700+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li>
<li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Dev%22%5BJournal%5D)">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12(2011).</li>
<li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li>
<li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li>
<li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2%28BP1-BP2%29+deletion%3A+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li>
<li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay%2C+postnatal+overgrowth%2C+hypoplastic+male+genitals%2C+and+characteristic+facial+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li>
<li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365(2013).</li>
<li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes%3A+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Array CGH nie wykryje zrównoważonych rearanżacji ani nieprawidłowości ploidalnych, takich jak triploidia. Co więcej, nierównowaga mozaiki niskiego poziomu może nie zostać wykryta. Jednak matryca CGH ma wyższą rozdzielczość wykrywania CNV niż analiza chromosomów w pasmach G, którą zastąpiła w wielu laboratoriach cytogenetycznych. Jest to zatem obecnie złoty standard w wykrywaniu CNV w całym genomie. W przyszłości może zostać zastąpiona przez technologie sekwencjonowania nowej generacji, ale obecnie ich koszt i złożoność t...

Od wielu lat wiadomo, że delecje lub dodatkowe kopie segmentów chromosomów powodują niepełnosprawność intelektualną, dysmorfię i wrodzone wady rozwojowe, a w niektórych przypadkach powodują zespoły genetyczne1. Jednak jedyną dostępną do połowy 2000 roku technologią do wykrywania tych zmian w całym genomie była analiza chromosomów z pasmem G, która ma rozdzielczość około 5-10 Mb, w zależności od regionu i charakteru nierównowagi, i która nie może wykryć nieprawidłowych chromosomów, w których materiał został zastąpiony regionem z innego chromosomu o tym samym schemacie prążkowania. Pomocnicze techniki cytogenetyczne, takie jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ i amplifikacja sondy specyficznej dla ligacji multipleksowej, były dostępne do badania określonych loci w przypadkach podejrzenia specyficznej nierównowagi syndromicznej, ale nie było to aż do wprowadzenia porównawczej hybrydyzacji genomowej (macierzy CGH) do rutynowej klinicznej usługi diagnostycznej2-5 To wykrywanie wariantów liczby kopii (CNV) w całym genomie stało się możliwe przy znacznie zwiększonej rozdzielczości (zwykle około 120 KB). Prace kliniczne prowadzone równolegle z badaniami naukowymi wykazały, że CNV w niektórych regionach są szeroko rozpowszechnione w normalnej populacji6-7, podczas gdy inne CNV, wcześniej niewykrywalne, są związane z niepełnosprawnościami neurologicznymi, takimi jak autyzm i padaczka8-11.
Protokół opisany w tym artykule jest używany w naszym klinicznym laboratorium diagnostycznym brytyjskiej Narodowej Służby Zdrowia (NHS); używamy nowatorskich strategii hybrydyzacji, testów wsadowych i robotyki, aby zminimalizować koszty w tej finansowanej przez państwo usłudze.
Przed opisanym poniżej protokołem, wysokiej jakości DNA powinno być ekstrahowane z odpowiedniego materiału wyjściowego, zwykle krwi, hodowanych komórek lub próbek tkanek. Spektrofotometria może być używana do pomiaru stężenia (powinno wynosić >50 ng/ul) i sprawdzania współczynników absorbancji 260:280 (powinno wynosić 1,8-2,0). Elektroforeza żelowa może być stosowana do sprawdzania, czy DNA ma wysoką masę cząsteczkową bez znaczącej degradacji.
Ten protokół jest przeznaczony dla laboratoriów o wyższej przepustowości, które oznaczają 96 próbek na przebieg za pomocą zautomatyzowanej robotyki do obsługi cieczy. Można go jednak dostosować do laboratoriów o niższej przepustowości bez automatyzacji.

<table><tbody><tr><td>Mikromacierz CGH 8 x 60K</td><td>Agilent</td><td>G4126</td><td></td></tr><tr><td>Array płuczące CGH</td><td>Agilent</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny CGH</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania Minelute</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Array Zestaw do etykietowania CGH</td><td>Enzo</td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

array comparative genomic hybridization (array cgh) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Tablica CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych zastąpiła analizę kariotypu w pasmach G. W artykule opisano technologię i jej zastosowanie w klinicznym laboratorium diagnostycznym. DNA wyekstrahowane z próbki pacjenta (krew, ślina lub inne rodzaje tkanek) jest znakowane fluorochromem (cyjaniną 5 lub cyjaniną 3). Referencyjna próbka DNA jest znakowana przeciwległym fluorochromem. Następuje etap oczyszczania w celu usunięcia nieinkorporowanych nukleotydów, zanim znakowane DNA zostaną zmieszane i ponownie zawieszone w buforze hybrydyzacyjnym i zastosowane do macierzy składającej się z ~ 60 000 sond oligonukleotydowych z loci w całym genomie, o dużej gęstości sondy w klinicznie ważnych obszarach. Po hybrydyzacji matryce są myte, a następnie skanowane, a uzyskane obrazy są analizowane w celu zmierzenia czerwonej i zielonej fluorescencji dla każdej sondy. Oprogramowanie służy do oceny jakości każdego pomiaru sondy, obliczania stosunku fluorescencji czerwonej do zielonej oraz wykrywania potencjalnych wariantów liczby kopii.

Każda sonda na hybrydyzowanej macierzy jest wizualizowana jako mieszanina czerwonych i zielonych fluorochromów (patrz Rysunek 1). Stosunek czerwonego do zielonego sygnału fluorescencji dla każdej sondy jest kwantyfikowany przez skaner, a powiązane oprogramowanie przedstawia je jako stosunki log2 w zależności od ich pozycji genomowej i identyfikuje regiony wykraczające poza określone granice. Powstałe profile macierzy pozwalają na interpretację regionów zidentyfikowanych jako niezrównoważone genomowo. Na ...

Tablica CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych zastąpiła analizę kariotypów w pasmach G. W artykule opisano technologię i jej zastosowanie w laboratorium usług diagnostycznych.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie porównawczej hybrydyzacji genomowej na mikromacierzy w celu zidentyfikowania niezrównoważeń w genomie, które mogą prowadzić do szerokiej gamy chorób genetycznych. Jest to realizowane poprzez wstępne znakowanie DNA pacjenta barwnikiem fluorescencyjnym. W drugim kroku DNA pacjenta oraz inaczej znakowane DNA referencyjne są hybrydyzowane z mikromacierzą.Następnie macierz jest skanowana w celu zmierzenia ilości DNA pacjenta i DNA referencyjnego związanych z każdą sondą. W ostatnim kroku obraz ze skanowania jest przetwarzany, aby zidentyfikować regiony genomu, w których DNA pacjenta wykazuje większą lub mniejszą ilość materiału niż DNA referencyjne na macierzy. Porównawcza hybrydyzacja genomowa jest stosowana w celu ustalenia, czy pacjent posiada wariant liczby kopii, który prowadzi do wystąpienia zespołu genetycznego.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ montaż szkiełka z matrycą może być trudny, a hybrydyzacja podatna na błędy. Przed rozpoczęciem reakcji znakowania wymieszaj zawartość komory. Rozmroź gotową do użycia płytkę 96-dołkową z nukleotydami i starterami w temperaturze 4 °C, chroniąc ją przed światłem przez około godzinę.Po rozmrożeniu pozostaw przykrytą płytkę na kolejne 30 minut w temperaturze pokojowej w celu wyrównania temperatury; w tym samym czasie inkubuj próbki DNA przez 15 minut w temperaturze 60°C. Podczas ogrzewania próbek użyj robota do manipulacji cieczami, aby rozdać odpowiednią ilość wody wolnej od nukleaz do każdej studzienki nowej płytki 96-dołkowej. Następnie, gdy DNA będzie gotowe, przenieś 1 µg próbki na studzienkę do płytki 96-dołkowej z wodą.Następnie przenieś 20 µL nukleotydów równoważących i starterów do każdej studzienki płytki zawierającej rozcieńczone próbki DNA i zamknij płytkę nakładkami paskowymi, dbając o szczelne zamknięcie. Następnie zdenaturuj DNA w temperaturze 99 °C w termocyklerze z grzaną pokrywą przez 10 minut i zwiąż startery poprzez szybkie schłodzenie płytki na lodzie przez pięć minut. Następnie użyj robota do obsługi cieczy, aby dodać 10 µL enzymu polimerazy DNA clean out exo do każdej próbki.Wymieszaj próbki za pomocą pipety, a następnie zamknij płytkę i inkubuj ją w temperaturze 37°C przez 16 godzin. Następnego dnia zatrzymaj reakcję, dodając 5 µL buforu stopującego do każdego dołka. Następnie usuń niewbudowane nukleotydy. Przenieś zawartość każdego dołka do oddzielnych, wcześniej oznakowanych probówek o pojemności 2 mL.Załaduj próbki, kolumny wirowe do oczyszczania DNA oraz odpowiednie bufory pomocnicze do robota do przetwarzania kolumn wirowych. Zgodnie z instrukcjami producenta, robot do przetwarzania kolumn wirowych zwiąże znakowane DNA z membraną krzemionkową przy użyciu 250 µL buforu do wiązania DNA o wysokim stężeniu soli na probówkę, po czym z membran zostaną usunięte zanieczyszczenia poprzez dwa przemycia, każdorazowo 500 µL buforu do przemywania. Następnie robot doda do membran 15 µL buforu do elucji o niskim stężeniu soli, aby odzyskać oczyszczone próbki znakowanego DNA w objętościach około 12 µL w celu przeprowadzenia hybrydyzacji próbek.Następnie rozgrzej piec do hybrydyzacji do 65 °C i podgrzej szkiełka podkładowe oraz komory hybrydyzacyjne. Aby przygotować mieszaninę do hybrydyzacji, połącz 1,1 µL cot 1D NA, 4,95 µL mieszaniny blokującej dostarczonej przez producenta oraz 24,75 µL buforu do hybrydyzacji. Użyj robota do obsługi cieczy, aby rozdzielić tę mieszaninę do każdego dołka nowej płytki 96-dołkowej, uprzednio zwilżając każdą końcówkę w celu zwiększenia dokładności transferu.Następnie pipetuj 9,35 µL odpowiednio znakowanego DNA 3, a następnie 9,35 µL odpowiednio znakowanego DNA 5. Uszczelnij płytkę w każdym dołku, wiruj próbki przez jedną minutę i krótko zakręć płytkę, aby zebrać zawartość na dnie każdego dołka. Zdenaturuj znakowane DNA w inkubatorze do prehybrydyzacji.Najpierw przez trzy minuty w temperaturze 95°C, następnie przez 30 minut w temperaturze 37°C. Następnie należy pracować na platformie grzewczej o temperaturze 42°C. Umieść szkiełko nośne w komorze hybrydyzacyjnej, upewniając się, że przezroczysta część uszczelki pokrywa się z okienkiem komory hybrydyzacyjnej, używając wcześniej zwilżonych końcówek.Teraz powoli pipetuj 42 µL mieszaniny do hybrydyzacji do środka odpowiedniej pozycji na szkiełku podkładowym macierzy. Należy uważać, aby ciecz nie dotknęła krawędzi gumowego pierścienia. Po wypełnieniu wszystkich pozycji ostrożnie opuść szkiełko macierzy na szkiełko podkładowe i złóż komorę hybrydyzacyjną.Upewniając się, że strona macierzy z napisami jest skierowana w stronę szkiełka podkładowego, należy całkowicie dokręcić śrubę komory hybrydyzacyjnej i sprawdzić zmontowaną komorę, aby potwierdzić brak wycieków mieszaniny hybrydyzacyjnej poza obręb pierścienia gumowego oraz upewnić się, że każdy pęcherzyk powietrza ma wysokość około 4 mm. Aby to sprawdzić, należy ustawić komorę hybrydyzacyjną pionowo na jednym z końców i nią obrócić.Wszystkie pęcherzyki powietrza w każdej pozycji poruszają się. Jeśli którykolwiek z pęcherzyków utknie, należy energicznie stuknąć komorą o blat. Następnie komory do hybrydyzacji należy umieścić w obrotowym inkubatorze w temperaturze 65 °C na 24 godziny.Następnego dnia należy zanurzyć komory hybrydyzacyjne w buforze piorącym nr 1, a następnie za pomocą plastikowych pęset o płaskich końcach delikatnie rozdzielić szkiełka. Po tym zabiegu należy usunąć szkiełka uszczelniające, a szkiełka z macierzą umieścić w statywie zanurzonym w świeżym buforze nr 1. Płukanie szkiełek z macierzą należy przeprowadzić w około 700 ml buforu piorącego przez okres od jednej do pięciu minut, intensywnie mieszając roztwór za pomocą magnetycznego mieszadełka i pchełki.Następnie przenieś szkiełka z matrycą do około 700 ml buforu płuczącego, płucząc je dwukrotnie przez 90 s, z intensywniejszym mieszaniem pod koniec drugiego płukania. Ostrożnie wyjmij szkiełka z matrycą z buforu. Powinny być one suche.Następnie umieść szkiełka z macierzami w uchwytach skanera wraz z osłonami szkiełek, a następnie przeprowadź skanowanie próbek. Zgodnie z instrukcjami producenta macierzy, każda sonda na zhybrydyzowanej macierzy jest wizualizowana jako mieszanina czerwonych i zielonych fluorochromów. Stosunki sygnału fluorescencji czerwonej do zielonej dla każdej sondy są kwantyfikowane przez skaner, a powiązane oprogramowanie nanosi je jako wartości log2 stosunku w zależności od ich pozycji genomowej.Otrzymane ślady macierzy pozwalają na interpretację obszarów zidentyfikowanych jako genomowo niezrównoważone. Na przykład, na tym śladzie pochodzącym od dziecka z zespołem Williamsa — nawracającym zespołem mikrodelecyjnym wywołanym przez niskokopiowe powtórzenia w proksymalnym regionie chromosomu 7 — niezrównoważenie genomowe zostało zidentyfikowane przez oprogramowanie za pomocą czerwonej linii. Logarytmiczny stosunek fluorescencji powinien skupiać się blisko zera, co wskazuje na stosunek zielonego do czerwonego sygnału wynoszący jeden do jednego dla prawidłowych regionów genomu.Rozproszone ślady macierzy zaobserwowane w tym skanie mogą prowadzić do błędnego określenia regionów nieprawidłowych lub do niezdolności do zidentyfikowania niezrównoważenia genomowego i mogą być spowodowane szeregiem czynników, w tym niską jakością DNA, obecnością promieniowania lub poziomem ozonu w atmosferze. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować próbki pacjentów do badania aCGH oraz jak uzyskać dane dobrej jakości do dalszych analiz i detekcji zmienności liczby kopii.

array-comparative-genomic-hybridization-array-cgh-for-detection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Miejscowa hybrydyzacja genomowa porównawcza na mikroarray (Array CGH) w wykrywaniu wariantów liczby kopii genomowych

Niniejsze wideo jest demonstracją techniczną protokołu hybrydyzacji dla zestawu CGH z płytkami o gęstym pokryciu całego genomu (whole genome tiling path array CGH), który pozwala na przeskanowanie całego ludzkiego genomu przy użyciu zaledwie 25-100 ng DNA, które można wyizolować z różnych źródeł, w tym z archiwalnego materiału utrwalonego w formalinie.

Demonstracja techniczna porównawczej hybrydyzacji genomowej całego genomu z wykorzystaniem macierzy (array CGH)

Niniejszy artykuł opisuje dobór odpowiednich sond do techniki single-cell FISH, metody preparowania jąder blastomerów, a także hybrydyzację in situ i ocenę sygnałów w kontekście diagnostyki przedimplantacyjnej (PGD) stosowanej w warunkach klinicznych.

FISH w diagnostyce preimplantacyjnej

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Sekwencjonowanie pojedynczych komórek jest coraz bardziej popularnym i dostępnym narzędziem do rozwiązywania problemów związanych ze zmianami genomowymi w wysokiej rozdzielczości. Udostępniamy protokół, który wykorzystuje sekwencjonowanie pojedynczych komórek do identyfikacji zmian liczby kopii w pojedynczych komórkach.

Wykrywanie zmian numeru kopii za pomocą sekwencjonowania pojedynczych komórek

Ten protokół dostarcza kroków eksperymentalnych i informacji o odczynnikach, sprzęcie i narzędziach analitycznych dla badaczy, którzy są zainteresowani przeprowadzeniem analizy porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) na bazie całego genomu zmian liczby kopii u roślin.

Oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów Medicago truncatula

Ten manuskrypt opisuje analizę zmienności liczby kopii przeprowadzoną w DNA surowicy lub osocza przy użyciu metody PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta jest odpowiednia do przewidywania oporności na leki u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego opornym na kastrację, ale może być również pouczająca w przypadku innych chorób.

Wykrywanie liczby kopii w surowicy i osoczu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Rękopis opisuje cyfrowy test PCR oparty na chipie, który wykrywa rzadki wariant transkryptu CDH1 (CDH1a) w świeżo zamrożonych tkankach normalnych i nowotworowych pobranych od pacjentów z rakiem żołądka.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

Biblioteka CRISPR/sgRNA została zastosowana do badania genów kodujących białka. Jednak wykonalność biblioteki sgRNA w celu odkrycia funkcji granicy CTCF w regulacji genów pozostaje niezbadana. W tym miejscu opisujemy bibliotekę sgRNA specyficzną dla loci HOX, aby wyjaśnić funkcję granic CTCF w loci HOX.

PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

Tutaj opisujemy procedurę analizy całego genomu metylacji DNA w nowotworach przewodu pokarmowego. Procedura ta ma znaczenie dla badań, które badają związki między wzorcami metylacji genów a czynnikami przyczyniającymi się do kancerogenezy w nowotworach przewodu pokarmowego.

Analiza całego genomu metylacji DNA w raku przewodu pokarmowego

Protokół przedstawia ogólne procedury laboratoryjne wymagane w preimplantacyjnych testach genetycznych na aneuploidię na platformie sekwencjonowania nowej generacji opartej na półprzewodnikach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe etapy amplifikacji całego genomu, selekcji fragmentów DNA, budowy biblioteki, przygotowania szablonów i przepływu roboczego sekwencjonowania z reprezentatywnymi wynikami.

Preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku aneuploidii na półprzewodnikowej platformie sekwencjonowania nowej generacji

Protokół ten opisuje zautomatyzowany, akredytowany przez ISO15189 proces sekwencjonowania nowej generacji do wykrywania celowanych zmian genomowych w tkankach formalinowych osadzonych w parafinie tkankach raka płuc niedrobnokomórkowych (NSCLC).

Wykrywanie celowalnych zmian w niedrobnokomórkowym raku płuc za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Poznaj metodę array CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych w diagnostyce chorób genetycznych. Technika ta pozwala na precyzyjną identyfikację niezrównoważeń chromosomalnych u pacjentów.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych

Przeglądaj więcej filmów