Oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów Medicago truncatula

Ogólnym celem tego opartego na macierzy porównawczego protokołu hybrydyzacji genomowej jest szybka identyfikacja zmian liczby kopii w mutantach indukowanych szybkim bombardowaniem neutronami rośliny strączkowej Medicago truncatula. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii roślin strączkowych. Na przykład ułatwienie identyfikacji empatogenów w niskim miejscu zaangażowanych w regulację rozwoju guzków w roślinach strączkowych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że cieszy się ona najwyższą renomą i jest czuła w wykrywaniu zmian liczby kopii, takich jak mutacje delecyjne w mutantach bombardowania neutronami rośliny strączkowej Medicago truncatula. Tę procedurę zademonstruję ja i Hongcheng Wang, lekarz gospodarz z Laboratorium Genetycznego. Szybko zamroź jeden gram młodej tkanki liściowej pobranej z pojedynczych roślin w ciekłym azocie.

Następnie za pomocą moździerza i tłuczka zmielić zamrożoną tkankę liści na drobny proszek w ciekłym azocie. Ekstrahuj próbki genomowego DNA typu dzikiego i zmutowanego z drobnego proszku za pomocą zestawu do izolacji DNA. Użyj probówek wirówkowych o pojemności 500 mikrolitrów, aby rozcieńczyć po jednym mikrogramie każdego dzikiego typu i zmutowanego genomowego DNA podwójnie destylowaną wodą do końcowej objętości 20 mikrolitrów.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów losowego startera do probówek wirówkowych. Szybko zawiruj probówki, a po szybkim odwirowaniu umieść je w termocyklerze na 10 minut, aby zdenaturować próbki DNA w temperaturze 98 stopni Celsjusza. Po 10 minutach wyjmij probówki z termocyklera i natychmiast umieść je w lodowatej wodzie na pięć minut.

Następnie przygotuj dwie mieszanki do znakowania i dodaj 25 mikrolitrów mieszanki do znakowania jako jeden i dwa odpowiednio do probówek DNA typu dzikiego i zmutowanego. Odpipetować DNA i etykietę wymieszać trzy razy, a następnie krótko obrócić probówki. Po wirowaniu inkubuj probówki w termocyklerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby dezaktywować egzoenzym Klenowa.

Następnie dodaj 430 mikrolitrów buforu One X TE i wymieszaj zawartość w każdej probówce. Następnie krótko obróć probówki i przenieś roztwór z probówek do kolumn oczyszczających z dwiema mililitrowymi probówkami zbiorczymi. Odwirować kolumny oczyszczające przy 14 000 razy G przez 10 minut i odrzucić przepływ.

Dodać 480 mikrolitrów buforu One X TE do każdej kolumny i ponownie odwirować przy 14 000 razy G przez 10 minut. Odrzuć przepływ. Przenieść każdy z DNA znakowanych typu dzikiego i zmutowanego z dna kolumny do nowych probówek wirówkowych.

Po zmierzeniu objętości każdego ze znakowanych DNA za pomocą pipety, dostosuj końcową objętość do 80 mikrolitrów za pomocą buforu One X TE, a następnie zmierz stężenie znakowanych DNA w spektrofotometrze. Następnie wymieszaj równoważne objętości zmutowanych i dzikich DNA, aby zhybrydyzować sondy na chipie mikromacierzy w celu hybrydyzacji porównawczej. Doprowadź końcową objętość do 160 mikrolitrów za pomocą buforu One X TE.

Następnie przygotuj roztwór hybrydyzacyjny i odpipetuj go trzy razy, aby dobrze wymieszać trzy czynniki z mieszanym DNA. Po krótkim zawirowaniu probówek inkubuj je w termocyklerze w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 10 minut, a w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Pamiętaj, aby ustawić temperaturę na 67 stopni Celsjusza, aby rozgrzać piekarnik do hybrydyzacji na cztery godziny przed hybrydyzacją.

Następnie należy umieścić szkiełko uszczelniające na podstawie komory hybrydyzacyjnej i załadować na nią 490 mikrolitrów roztworu hybrydyzacyjnego po 20 minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termocyklerze. Aby utworzyć komorę hybrydyzacyjną, przykryj suwak uszczelki chipem mikro macierzy genomu Medicago truncatula, a następnie przykryj komorę hybrydyzacyjną i bezpiecznie dokręć ją zaciskami. Zmontowaną komorę hybrydyzacyjną inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 67 stopni Celsjusza przez 40 do 48 godzin.

W międzyczasie przygotuj dwa naczynia do mycia szkiełek z 250 mililitrami Washing Buffer One utrzymywanym w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj jedno naczynie do mycia szkiełka z buforem myjącym nr 2 utrzymywanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj jeden słoik do mycia szkiełek z 70 mililitrami acetonitrylu, a drugi słoik do mycia szkiełek z 70 mililitrami roztworu stabilizującego i ciągnącego.

Umieść oba słoiki do mycia szkiełek w dygestorium o temperaturze pokojowej. Po inkubacji wyjmij komorę hybrydyzacyjną z pieca do hybrydyzacji i poluzuj zaciski komory, aby otworzyć pokrywę. Następnie wyjmij chip mikroukładu ze szkiełka uszczelki i umieść je na naczyniu do mycia szkiełek z Wash Buffer One.

Odizoluj układ mikromacierzy od szkiełka pokrywy. Następnie przenieś chip mikromacierzy do drugiego naczynia do mycia szkiełek za pomocą Wash Buffer One. Za pomocą mieszadła delikatnie mieszaj roztwór na magnetycznej płytce mieszającej w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Umieść chip mikro macierzy na naczyniu do mycia szkiełek ze wstępnie podgrzanym buforem myjącym dwa, a następnie mieszaj mieszadłem, aby myć roztwór w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Wyjmij chip mikromacierzy i umieść go w słoiku do mycia szkiełek zawierającym acetonitryl w okapie wyciągowym w celu mycia przez 30 sekund. Przenieś chip mikromacierzy do słoika do mycia szkiełek z roztworem stabilizującym i suszącym i myj ponownie, przez 30 sekund.

Ostrożnie usuń wiór i susz przez minutę w dygestorium. Zeskanuj układ mikromacierzy za pomocą skanera w rozdzielczości dwóch mikrometrów. Oprogramowanie do mapowania sygnałów wykorzystano jako interfejs do analizy rozkładu znormalizowanych stosunków logarytmu dwa sygnałów zmutowanych i dzikich w ośmiu chromosomach.

W przypadku przypuszczalnych delecji uwzględnia się wartość stosunku logarytmu dwa równą lub mniejszą niż minus dwa punkty pięć, odchylenie standardowe. Analiza segmentacyjna oprogramowania wykazała szacowany region delecji 22 kilozasad na chromosomie czwartym pokazanym na wykresie. Analiza granic delecji otoczonych sondami mikromacierzowymi wykazała zmniejszony średni znormalizowany stosunek logarytmu dwóch.

Wykres pokazuje również sześć innych genów z adnotacjami, w tym gen son obejmujący usunięty region. Gen Son jest odpowiedzialny za kontrolowanie guzków w Metecago truncatula. Następnie, amplifikacja PCR wykonana w celu potwierdzenia granic delecji pokazuje produkt o wartości jednego punktu i pięciu kilozasad amplifikowany z mutanta FN6191, ale nie w typie dzikim.

Sekwencjonowanie DNA zostało wykonane, aby pokazać połączenie delecyjne w mutancie FN6191 pokazanym na czarnej strzałce. Przeprowadzono również sekwencjonowanie, które potwierdziło lokalizację granic usuwania. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu 72 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Aby uzyskać wysokiej jakości dane, należy pamiętać o utrzymaniu niskiego stężenia ozonu w pomieszczeniu, w którym wykonywany jest zabieg. Po tej procedurze można wykonać inne pomiary, takie jak reakcje łańcuchowe polimerazy sekwencjonowania całego genomu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zmiany rozmiaru i liczby kopii w genomie. Wydarzenie i walidacja tej techniki utorowały naukowcom drogę do zbadania zmienności liczby kopii, którą wywołują w przypadku mutantów i naturalnych wariantów u gatunków roślin, które nie są podatne na mutagenezę insercyjną, takich jak Garden P. Nie zapominaj, że praca z acetonitrylem, roztworem stabilizującym i suszącym może być niezwykle niebezpieczna.

Środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych, unikanie bezpośredniego kontaktu ze środkami i ostrożność, są absolutnie niezbędne.