Name: Oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów Medicago truncatula (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę CGH do wykrywania zmian liczby kopii u mutantów Medicago truncatula indukowanych prędkimi neutronami. Ta technika umożliwia badanie genetyki rośin strączkowych i rozwoju brodawek korzeniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy jest częściowo zapewnione przez grant od NSF Plant Genome Research (IOS-1127155).

UWAGA: Rysunek 1 pokazuje pięć kroków dla protokołu tablicowego CGH. Są to: 1) Przygotowanie materiałów roślinnych; 2) Izolacja wysokiej jakości próbek DNA; 3) Znakowanie i oczyszczanie próbek DNA; 4) Hybrydyzacja, mycie i skanowanie całych macierzy genomowych; oraz 5) analiza danych CGH. Macierze kafelkowe całego genomu M. truncatula zawierają łącznie 971 041 unikalnych sond oligonugologicznych ukierunkowanych na ponad 50 000 genów lub modeli genów w genomie (patrz tabela materiałów). Unikalne sondy są rozmieszczone w przybliżeniu co 150 par zasad (bp) w regionach egzonicznych i 261 pz w regionach intronowych genomu M. truncatula.
1. Przygotowanie materiałów roślinnych
<ol>
	<li>Wertykulacja typu dzikiego (WT; M. truncatula cv Jemalong A17) i zmutowane nasiona FN6191 ze stężonym kwasem siarkowym przez 8 min (patrz tabela materiałów). Usuń i wyrzuć kwas siarkowy do pojemnika na odpady płynne.</li>
	<li>Trzykrotnie opłucz nasiona autoklawowaną wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Nasiona sterylizować powierzchniowo 20% roztworem wybielacza przez 10 minut.</li>
	<li>Trzykrotnie opłucz nasiona autoklawowaną wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Przechowywać nasiona w temperaturze 4 °C przez 3 dni. Po wernalizacji przenieś i kiełkuj nasiona w glebie przez tydzień w komorze wzrostowej o cyklu 16 godzin/8 godzin światła/ciemności i natężeniu światła 150 μE/m2/s.</li>
	<li>Przesadzaj sadzonki do doniczek o pojemności 1 galona i hoduj je w szklarni z cyklem 16 godzin/8 godzin światła/ciemności, natężeniem światła 150 μE/m2/s przez trzy do czterech tygodni. Zbierz próbki młodych liści od roślin w celu izolacji DNA.</li>
</ol>
2. Izolacja wysokiej jakości próbek DNA
<ol>
	<li>Weź 1 g młodej tkanki liścia z jednej rośliny i natychmiast zamroź ją w ciekłym azocie.</li>
	<li>Zmiel zamrożoną tkankę liści w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka na drobny proszek.</li>
	<li>Wyizolować genomowe DNA za pomocą zestawu do izolacji DNA (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Zawiesić oczyszczone próbki DNA w 50 μl autoklawowanego podwójnie dejonizowanegoH2O(ddH2O) lub 1x bufor TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0).</li>
	<li>Zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Oceń proporcje 260 nm/280 nm i 260 nm/230 nm próbek DNA. 
	UWAGA: Wysokiej jakości próbki DNA powinny mieć stosunek 260 nm/280 nm ≥1,8 i stosunek 260 nm/230 nm ≥2,0.</li>
	<li>Dalsza ocena próbek DNA poprzez umieszczenie ich w 1% żelach agarozowych. 
	UWAGA: Wysokiej jakości próbki DNA powinny mieć dużą masę cząsteczkową i nie powinny być zanieczyszczone RNA. Idealnie, końcowe stężenie próbek DNA powinno wynosić ~150 ng/μL.</li>
</ol>
3. Znakowanie i oczyszczanie DNA
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 1 μg próbek genomowego DNA ddH2O do końcowej objętości 20 μl w probówce wirówkowej o pojemności 500 μl.</li>
	<li>Dodać 5 μl losowego startera (patrz Tabela materiałów) do probówki.</li>
	<li>Krótko zwirować probówkę i umieścić ją w termocyklerze w celu inkubacji i denaturacji DNA w temperaturze 98 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Wyjmij probówkę z termocyklera i natychmiast umieść ją w lodowatej wodzie, aby schłodziła się przez 5 minut.</li>
	<li>Przygotować dwie mieszanki do etykietowania, jak pokazano w Tabeli 1.</li>
	<li>Dodać 25 μl mieszanin do znakowania 1 i 2 odpowiednio do referencyjnego DNA i probówek z próbką DNA.</li>
	<li>Wymieszać mieszaninę do znakowania i DNA, pipetując trzy razy i krótko obrócić probówki.</li>
	<li>Umieścić probówki w termocyklerze w celu inkubacji w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, a następnie w temperaturze 65 °C przez 20 minut w celu inaktywacji enzymu egzo-Klenowa (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Dodać 430 μl 1x buforu TE do każdej probówki.</li>
	<li>Wymieszaj zawartość i krótko odkręć tubki.</li>
	<li>Przenieść roztwór z probówki do kolumny oczyszczającej z probówką zbiorczą o pojemności 2 ml (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Odwirować kolumnę oczyszczającą o stężeniu 14 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Odrzucić roztwór przepuszczający.</li>
	<li>Dodaj 480 μL 1x bufor TE do każdej kolumny.</li>
	<li>Ponownie odwirować kolumnę przy 14 000 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Wyrzuć roztwór przelotowy.</li>
	<li>Przenieść znakowaną próbkę DNA, która pozostaje w dolnej części kolumny, do nowej probówki wirówkowej.</li>
	<li>Zmierzyć objętość znakowanej próbki DNA za pomocą pipety i doprowadzić końcową objętość do 80 μl za pomocą 1x buforu TE.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie znakowanej próbki DNA za pomocą spektrofotometru (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wymieszać równą ilość znakowanego próbki DNA i referencyjnego DNA i doprowadzić końcową objętość do 160 μl za pomocą 1x buforu TE.</li>
	<li>Dodać 256 μl 2x buforu hybrydyzacyjnego, 50 μl ludzkiego DNA Cot-1 i 50 μl 10× środka blokującego aCGH (patrz tabela materiałów) i dobrze wymieszać, pipetując trzy razy.</li>
	<li>Krótko zakręć probówkami i włóż je do termocyklera do inkubacji w temperaturze 98 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
</ol>
4. Hybrydyzacja, mycie i skanowanie tablic genomu
<ol>
	<li>Rozgrzej piec do hybrydyzacji do temperatury 67 °C co najmniej 4 godziny przed rozpoczęciem hybrydyzacji.</li>
	<li>Umieść suwak uszczelki na podstawie komory hybrydyzacyjnej.</li>
	<li>Załaduj 490 μl roztworu hybrydyzacyjnego z kroku 3.23 na suwak uszczelki.</li>
	<li>Przykryj suwak uszczelki chipem mikromacierzy genomowej Medicago truncatula, aby utworzyć komorę hybrydyzacyjną.</li>
	<li>Załóż pokrywy komory hybrydyzacji i mocno dokręć komorę zaciskami.</li>
	<li>Umieścić zmontowaną komorę do hybrydyzacji w piecu do hybrydyzacji i inkubować w temperaturze 67 °C przez 40-48 godzin.</li>
	<li>Przygotuj trzy szkiełka do mycia: dwa z 250 ml buforu do mycia, który trzymałem w temperaturze pokojowej, i jedno z buforem do mycia II utrzymywane w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj dwa słoiki do mycia szkiełek: jeden z 70 ml acetonitrylu i jeden z 70 ml roztworu stabilizującego i suszącego; przechowuj oba w dygestoriach w temperaturze pokojowej (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wyjmij komorę hybrydyzacyjną z piekarnika i zdejmij komorę clamps i pokrywę.</li>
	<li>Przenieś chip mikromacierzy i suwak uszczelki do szkiełek do mycia szkiełek z buforem myjącym I i oddziel chip od szkiełka pokrywy.</li>
	<li>Przenieś chip mikromacierzy do drugiego szkiełka z buforem do mycia I i delikatnie cyrkuluj roztwór za pomocą mieszadła na magnetycznej płytce mieszającej w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Przenieść chip mikromacierzy do trzeciego szkiełka myjącego z podgrzanym buforem myjącym II i delikatnie myć mieszadłem na magnetycznej płytce mieszającej w temperaturze 37 °C przez 1 minutę.</li>
	<li>Przenieś chip mikromacierzy do słoika do mycia szkiełek z acetonitrylem w dygestorium i myj go przez 30 sekund.</li>
	<li>Przenieś chip mikromacierzy do szkiełkowego słoika do mycia z roztworem stabilizującym i suszącym i myj go przez 30 sekund.</li>
	<li>Powoli wyjmij frytki i susz je przez 1 minutę.</li>
	<li>Zeskanuj układ mikromacierzy za pomocą skanera (patrz tabela materiałów) w rozdzielczości 2 μm. Ustaw parametry, aby zapisać wiele obrazów i skany całych slajdów. Ustaw wzmocnienie kanałów 1 i 2 na 100% i anuluj automatyczne wzmocnienie.</li>
</ol>
5. Analiza danych CGH
<ol>
	<li>Wyodrębnij intensywności fluorescencji Cy3 i Cy5 dla każdej sondy na matrycy za pomocą oprogramowania skanującego (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wykorzystaj analizę segmentacyjną oprogramowania do wykrywania zmian liczby kopii (CNV) między DNA próbki a DNA referencyjnym. Do oznaczania CNV należy zastosować próg średniego stosunku próbki log2 do ± 2,5 odchylenia standardowego.</li>
	<li>Sprawdź rozkład proporcji logarytmu2 próbki do odniesienia w całym genomie za pomocą oprogramowania do mapowania sygnałów (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Tang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+genome+release+%28version+Mt4.0%29+for+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula.</a> BMC Genomics. 15, 312(2014).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li>
<li>Wang, H., Li, G., Chen, R. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+H+%22Floriculture%2C+Ornamental+and+Plant+Biotechnology%3A+Advances+and+Topical+Issues%22">Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues</a>. da Silva, J. T. , 1st ed, Global Science Books. Isleworth, UK. 629-639 (2006).</li>
<li>Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion-based+reverse+genetics+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).</li>
<li>Alonso, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+components+of+the+ethylene-response+pathway+identified+in+a+screen+for+weak+ethylene-insensitive+mutants+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).</li>
<li>Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+RGA+gene+encodes+a+transcriptional+regulator+repressing+the+gibberellin+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway.</a> Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).</li>
<li>Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleteagene%3A+a+fast+neutron+deletion+mutagenesis-based+gene+knockout+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants.</a> Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).</li>
<li>Bolon, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+genomic+analyses+of+a+fast+neutron+mutant+population+resource+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean.</a> Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).</li>
<li>Men, A. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/43443373_Fast_Neutron_Mutagenesis_of_Soybean_Glycine_soja_L_Produces_a_Supernodulating_Mutant_Containing_a_Large_Deletion_in_Linkage_Group_H">Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H.</a> Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).</li>
<li>Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodulation+deficiency+caused+by+fast+neutron+mutagenesis+of+the+model+legume+Lotus+japonicus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus.</a> J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+neutron+deletion+mutagenesis-based+reverse+genetics+system+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants.</a> Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).</li>
<li>Bourcy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicago+truncatula+DNF2+is+a+PI-PLC-XD-containing+protein+required+for+bacteroid+persistence+and+prevention+of+nodule+early+senescence+and+defense-like+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22New+phytol%22%5BJournal%5D)">Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions.</a> New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dissected+leaf+morphology+by+a+Cys%282%29His%282%29+zinc+finger+transcription+factor+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).</li>
<li>Ge, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+seed+size+and+quality+by+manipulating+BIG+SEEDS1+in+legume+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).</li>
<li>Kalo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodulation+signaling+in+legumes+requires+NSP2%2C+a+member+of+the+GRAS+family+of+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators.</a> Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).</li>
<li>Oldroyd, G. E., Long, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+nodulation-signaling+pathway+2%2C+a+gene+of+Medicago+truncatula+involved+in+Nod+actor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling.</a> Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+compound+leaf+development+in+Medicago+truncatula+by+fused+compound+leaf1%2C+a+class+M+KNOX+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene.</a> Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).</li>
<li>Tsujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+TOBAMOVIRUS+MULTIPLICATION+%28TOM%29+2+locus+encodes+a+transmembrane+protein+that+interacts+with+TOM1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1.</a> EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nodule-specific+protein+secretory+pathway+required+for+nitrogen-fixing+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis.</a> Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).</li>
<li>Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+array-based+comparative+genomic+hybridization+to+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics.</a> J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).</li>
<li>Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+selection+shapes+genome-wide+patterns+of+copy-number+polymorphism+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster.</a> Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).</li>
<li>Gong, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+rapid+cloning+of+an+ion+accumulation+deletion+mutant+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).</li>
<li>Guryev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+functional+impact+of+DNA+copy+number+variation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat.</a> Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).</li>
<li>Haun, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composition+and+origins+of+genomic+variation+among+individuals+of+the+soybean+reference+cultivar+Williams+82%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82.</a> Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).</li>
<li>Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+amplifications+caused+by+chromosomal+rearrangements+play+a+major+role+in+the+adaptive+evolution+of+natural+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast.</a> Genetics. 165 (4), 1745-1759 (2003).</li>
<li>Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide+Array+Comparative+Genomic+Hybridization+%28oaCGH%29+based+characterization+of+genetic+deficiencies+as+an+aid+to+gene+mapping+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Genomics. 8, 402(2007).</li>
<li>Lakshmi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genomic+representational+oligonucleotide+microarray+analysis%3A+detection+of+copy+number+variations+in+normal+and+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).</li>
<li>Mitra, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+required+for+symbiotic+nodule+development%3A+Gene+identification+by+transcript-based+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).</li>
<li>Rios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+hemizygous+deletions+in+citrus+using+array-comparative+genomic+hybridization+and+microsynteny+comparisons+with+the+poplar+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome.</a> BMC Genomics. 9, 381(2008).</li>
<li>Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+expression+arrays+for+copy+number+detection%3A+an+example+from+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli.</a> BMC Bioinformatics. 8, 203(2007).</li>
<li>Werner, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+locus+mapping+and+DNA+array+hybridization+identify+an+FLM+deletion+as+a+cause+for+natural+flowering-time+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).</li>
<li>Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicago+truncatula+esn1+defines+a+genetic+locus+involved+in+nodule+senescence+and+symbiotic+nitrogen+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation.</a> Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).</li>
<li>Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+truncatula+SUNN+gene+encodes+a+CLV1-like+leucine-rich+repeat+receptor+kinase+that+regulates+nodule+number+and+root+length%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length.</a> Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).</li>
<li>Horvath, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+nodule-specific+cysteine+rich+peptide%2C+NCR169%2C+abolishes+symbiotic+nitrogen+fixation+in+the+Medicago+truncatula+dnf7+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+peptide+essential+for+bacterial+survival+in+the+nitrogen-fixing+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).</li>
<li>Noble Research Institute. Medicago truncatula Mutant Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php">https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php</a> (2017).</li>
<li>Burton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+with+the+next+generation+of+CGH+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22MLO+Med+Lab+Obs%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping with the next generation of CGH microarray.</a> MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Opracowaliśmy opartą na macierzy platformę CGH do wykrywania i charakteryzowania mutantów indukowanych szybkim bombardowaniem neutronami (FNB) u M. truncatula cv. Jemalong A17. Aby zademonstrować zastosowanie metody macierzy CGH w wykrywaniu mutacji genów, przeprowadziliśmy analizę aCGH zmutowanego FN6191, który wykazywał fenotyp hiperguzkowy w przeciwieństwie do roślin typu dzikiego, po inokulacji S. meliloti Sm1021. Na potrzeby analizy segmentacyjnej segment został uznany za istotny, jeśli średnia ze ...

Rośliny strączkowe (Fabaceae) to trzecia co do wielkości rodzina roślin kwitnących, z wieloma ważnymi gospodarczo gatunkami, takimi jak soja (Glycine max) i lucerna (Medicago sativa). Rośliny strączkowe mogą wchodzić w interakcje z bakteriami glebowymi wiążącymi azot, ogólnie nazywanymi Rhizobia, w celu wytworzenia guzków korzeniowych, w których atmosferyczny diazot jest redukowany do amoniaku do wykorzystania przez roślinę żywicielską. W związku z tym uprawa roślin strączkowych wymaga niewielkiego nakładu nawozów azotowych, a tym samym przyczynia się do zrównoważonego rolnictwa. Rośliny strączkowe wytwarzają liście i nasiona o wysokiej zawartości białka, które służą jako doskonałe rośliny pastewne i zbożowe. Jednak uprawiane gatunki roślin strączkowych mają na ogół złożone struktury genomu, co sprawia, że badania funkcjonalne genów, które odgrywają kluczową rolę w procesach specyficznych dla roślin strączkowych, są uciążliwe. Medicago truncatula został szeroko przyjęty jako gatunek modelowy do badań nad roślinami strączkowymi, głównie dlatego, że (1) ma diploidalny genom o stosunkowo małym haploidalnym rozmiarze genomu (~550 Mbp); (2) rośliny mogą być stabilnie przekształcane do badań funkcjonalnych genów; oraz (3) jest blisko spokrewniony z lucerną siewną (M. sativa), królową roślin pastewnych i wielu innych roślin uprawnych ważnych gospodarczo dla badań translacyjnych. Niedawno ukazała się sekwencja genomu M. truncatula cv Jemalong A171,2. Adnotacja genomu pokazuje, że w genomie znajduje się ponad 50 000 przewidywanych genów lub modeli genów. Określenie funkcji większości genów w genomie M. truncatula jest trudnym zadaniem. Aby ułatwić funkcjonalne badania genów, stworzono obszerną kolekcję mutantów w zakresie ponad 150 000 linii M1 przy użyciu mutagenezy bombardowania szybkimi neutronami (FNB) w M. truncatula cv Jemalong A173,4. Neutron prędki, mutagen jonizacji o wysokiej energii, był używany do generowania mutantów u wielu gatunków roślin, w tym Arabidopsis5,6, ryż (Oryza sativa)7, pomidor (Solanum lycopersicum), soja (Glycine soja; G. max)8,9, jęczmień (Hordeum vulgare) oraz Lotus japonicus10. Duża część mutacji wywodzących się z mutagenezy FNB jest spowodowana delecjami DNA, które wahają się od kilku par zasad do mega par zasad9,11. Wiele genów związanych z fenotypem zostało pomyślnie zidentyfikowanych i scharakteryzowanych4,12,13,14,15,16,17,18,19. Wcześniej klonowanie molekularne genów leżących u podstaw mutantów FNB opierało się na podejściu opartym na mapie, które było czasochłonne i ograniczało liczbę mutantów, które można scharakteryzować na poziomie molekularnym. Ostatnio zastosowano kilka uzupełniających się podejść, w tym metody oparte na transkryptach, porównawczą hybrydyzację genomową (CGH) opartą na macierzy kafelkowania genomu do wykrywania zmienności liczby kopii DNA oraz sekwencjonowanie całego genomu, aby ułatwić charakterystykę mutantów delecyjnych w różnych organizmach, w tym u zwierząt i roślin20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31.
Aby ułatwić charakterystykę mutantów FNB u M. truncatula, opracowano i zweryfikowano platformę porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) opartą na macierzy całego genomu. Jak podano w systemach zwierzęcych, platforma CGH oparta na macierzy umożliwia wykrywanie zmian liczby kopii (CNV) na poziomie całego genomu u mutantów Fnb M. truncatula. Ponadto zmiany chorobowe można potwierdzić za pomocą PCR, a granice delecji można zidentyfikować za pomocą sekwencjonowania. Ogólnie rzecz biorąc, platforma macierzy CGH jest wydajnym i skutecznym narzędziem do identyfikacji zmian chorobowych u mutantów FNB M. truncatula. W tym miejscu zilustrowano procedurę macierzy CGH i charakterystykę PCR granic delecji w mutancie FNB M. truncatula.
Poniższy protokół dostarcza kroków eksperymentalnych i informacji o odczynnikach, sprzęcie i narzędziach analitycznych dla badaczy, którzy są zainteresowani przeprowadzeniem analizy porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) w oparciu o matrycę całego genomu zmian liczby kopii u roślin. Na przykład mutant Medicago truncatula FN6191 został wykorzystany do identyfikacji regionów delecji i genów kandydujących związanych ze zmutowanymi fenotypami. M. truncatula Mutant FN6191, pierwotnie wyizolowany z kolekcji mutantów delecyjnych wywołanych szybkim bombardowaniem neutronami32 (patrz Tabela materiałów), wykazywał fenotyp hiperguzkowości po inokulacji bakterią glebową, Sihorhizobium meliloti Sm1021, w przeciwieństwie do roślin typu dzikiego.

<table><tbody><tr><td>Medicago truncatula macierz genomowa, 1 x 1 M</td><td>Agilent</td><td>G4123A</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula FN6191 (mutant)</td><td>We własnym zakresie</td><td>FN6191</td><td></td></tr><tr><td>Medicago truncatula Jemalong A17 (odniesienie)</td><td>W domu</td><td>A17</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Plant Mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000D</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania DNA SureTag</td><td>Agilent</td><td>5190-3400</td><td></td></tr><tr><td>Losowy starter</td><td>Agilent</td><td>5190-3399</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>MJ research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Labnet international Inc</td><td>Spectrafuge 24D</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do stabilizacji i suszenia</td><td>Agilent</td><td>5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do hybrydyzacji Oligo aCGH/ChIP-on-chip</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice uszczelkowe komory hybrydyzacji</td><td>Agilent</td><td>G2505</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie łóżeczko 1 DNA</td><td>Agilent</td><td>5190-3393</td><td></td></tr><tr><td>Bufor myjący Oligo aCGH/ChIP-on-chip 1 i 2</td><td>Agilent</td><td>5188-5221</td><td></td></tr><tr><td>Komora hybrydyzacyjna, nierdzewna</td> Piec do hybrydyzacji <td>Agilent</td><td>G2534A</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny</td><td></td><td></td>oczyszczające <td>Agilent</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5190-3391</td><td></td></tr><tr><td>Skaner laserowy</td><td>Roche</td><td>MS200</td><td></td></tr><tr><td>NimbleScan 2.6</td><td>Roche Mapa sygnału Nimblegen</td><td>5225035001</td><td></td></tr><tr><td>1.9</td><td>Roche Nimblegen</td><td>Mapa sygnałów1.9</td><td></td></tr></tbody></table>

oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów medicago truncatula

An Array-based Comparative Genomic Hybridization Platform for Efficient Detection of Copy Number Variations in Fast Neutron-induced Medicago truncatula Mutants

Mutanty są nieocenionymi zasobami genetycznymi do badań nad funkcjami genów. Do generowania kolekcji mutantów można wykorzystać trzy rodzaje mutagenów, w tym biologiczne, takie jak T-DNA lub transpozon, chemiczne, takie jak metanosulfonian etylu (EMS), lub fizyczne, takie jak promieniowanie jonizacyjne. Rodzaj obserwowanej mutacji różni się w zależności od zastosowanego mutagenu. W przypadku mutantów wywołanych promieniowaniem jonizacyjnym mutacje obejmują delecję, duplikację lub rearanżację. Podczas gdy T-DNA lub mutageneza oparta na transpozonach jest ograniczona do gatunków, które są podatne na transformację, mutageneza chemiczna lub fizyczna może być stosowana do szerokiego zakresu gatunków. Jednak charakterystyka mutacji pochodzących z mutagenezy chemicznej lub fizycznej tradycyjnie opiera się na podejściu do klonowania opartym na mapach, które jest pracochłonne i czasochłonne. Tutaj pokazujemy, że platforma porównawczej hybrydyzacji genomowej (aCGH) oparta na macierzy genomu o dużej gęstości może być zastosowana do skutecznego wykrywania i charakteryzowania zmian liczby kopii (CNV) w mutantach pochodzących z mutagenezy bombardowania szybkimi neutronami (FNB) w Medicago truncatula, gatunku roślin strączkowych. Analiza sekwencji całego genomu pokazuje, że u M. truncatula znajduje się ponad 50 000 genów lub modeli genów. Obecnie mutanty indukowane przez FNB u M. truncatula pochodzą z ponad 150 000 linii M1, co stanowi nieocenione zasoby genetyczne do funkcjonalnych badań genów w genomie. Opisana tutaj platforma aCGH jest skutecznym narzędziem do charakteryzowania mutantów indukowanych przez FNB u M. truncatula.

Rysunek 2 przedstawia rozkład znormalizowanych stosunków log2 sygnałów mutanta w stosunku do sygnałów WT w całym genomie. Analiza danych CGH ujawniła delecję o wielkości około 2 kb na chromosomie 4, która obejmuje cały gen SUNN3 oraz kilka innych adnotowanych genów u mutanta FN6191 (Rysunek 2, Rysunek 3). Potencjalny region delecji był pokryty przez 73 kole...

Ten protokół dostarcza kroków eksperymentalnych i informacji o odczynnikach, sprzęcie i narzędziach analitycznych dla badaczy, którzy są zainteresowani przeprowadzeniem analizy porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) na bazie całego genomu zmian liczby kopii u roślin.

Oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów Medicago truncatula

Mutants are invaluable genetic resources for gene function studies. To generate mutant collections, three types of mutagens can be utilized, including ...

Ogólnym celem tego opartego na macierzy porównawczego protokołu hybrydyzacji genomowej jest szybka identyfikacja zmian liczby kopii w mutantach indukowanych szybkim bombardowaniem neutronami rośliny strączkowej Medicago truncatula. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii roślin strączkowych. Na przykład ułatwienie identyfikacji empatogenów w niskim miejscu zaangażowanych w regulację rozwoju guzków w roślinach strączkowych.Główną zaletą tej techniki jest to, że cieszy się ona najwyższą renomą i jest czuła w wykrywaniu zmian liczby kopii, takich jak mutacje delecyjne w mutantach bombardowania neutronami rośliny strączkowej Medicago truncatula. Tę procedurę zademonstruję ja i Hongcheng Wang, lekarz gospodarz z Laboratorium Genetycznego. Szybko zamroź jeden gram młodej tkanki liściowej pobranej z pojedynczych roślin w ciekłym azocie.Następnie za pomocą moździerza i tłuczka zmielić zamrożoną tkankę liści na drobny proszek w ciekłym azocie. Ekstrahuj próbki genomowego DNA typu dzikiego i zmutowanego z drobnego proszku za pomocą zestawu do izolacji DNA. Użyj probówek wirówkowych o pojemności 500 mikrolitrów, aby rozcieńczyć po jednym mikrogramie każdego dzikiego typu i zmutowanego genomowego DNA podwójnie destylowaną wodą do końcowej objętości 20 mikrolitrów.Następnie dodaj pięć mikrolitrów losowego startera do probówek wirówkowych. Szybko zawiruj probówki, a po szybkim odwirowaniu umieść je w termocyklerze na 10 minut, aby zdenaturować próbki DNA w temperaturze 98 stopni Celsjusza. Po 10 minutach wyjmij probówki z termocyklera i natychmiast umieść je w lodowatej wodzie na pięć minut.Następnie przygotuj dwie mieszanki do znakowania i dodaj 25 mikrolitrów mieszanki do znakowania jako jeden i dwa odpowiednio do probówek DNA typu dzikiego i zmutowanego. Odpipetować DNA i etykietę wymieszać trzy razy, a następnie krótko obrócić probówki. Po wirowaniu inkubuj probówki w termocyklerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby dezaktywować egzoenzym Klenowa.Następnie dodaj 430 mikrolitrów buforu One X TE i wymieszaj zawartość w każdej probówce. Następnie krótko obróć probówki i przenieś roztwór z probówek do kolumn oczyszczających z dwiema mililitrowymi probówkami zbiorczymi. Odwirować kolumny oczyszczające przy 14 000 razy G przez 10 minut i odrzucić przepływ.Dodać 480 mikrolitrów buforu One X TE do każdej kolumny i ponownie odwirować przy 14 000 razy G przez 10 minut. Odrzuć przepływ. Przenieść każdy z DNA znakowanych typu dzikiego i zmutowanego z dna kolumny do nowych probówek wirówkowych.Po zmierzeniu objętości każdego ze znakowanych DNA za pomocą pipety, dostosuj końcową objętość do 80 mikrolitrów za pomocą buforu One X TE, a następnie zmierz stężenie znakowanych DNA w spektrofotometrze. Następnie wymieszaj równoważne objętości zmutowanych i dzikich DNA, aby zhybrydyzować sondy na chipie mikromacierzy w celu hybrydyzacji porównawczej. Doprowadź końcową objętość do 160 mikrolitrów za pomocą buforu One X TE.Następnie przygotuj roztwór hybrydyzacyjny i odpipetuj go trzy razy, aby dobrze wymieszać trzy czynniki z mieszanym DNA. Po krótkim zawirowaniu probówek inkubuj je w termocyklerze w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 10 minut, a w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Pamiętaj, aby ustawić temperaturę na 67 stopni Celsjusza, aby rozgrzać piekarnik do hybrydyzacji na cztery godziny przed hybrydyzacją.Następnie należy umieścić szkiełko uszczelniające na podstawie komory hybrydyzacyjnej i załadować na nią 490 mikrolitrów roztworu hybrydyzacyjnego po 20 minutach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termocyklerze. Aby utworzyć komorę hybrydyzacyjną, przykryj suwak uszczelki chipem mikro macierzy genomu Medicago truncatula, a następnie przykryj komorę hybrydyzacyjną i bezpiecznie dokręć ją zaciskami. Zmontowaną komorę hybrydyzacyjną inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 67 stopni Celsjusza przez 40 do 48 godzin.W międzyczasie przygotuj dwa naczynia do mycia szkiełek z 250 mililitrami Washing Buffer One utrzymywanym w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj jedno naczynie do mycia szkiełka z buforem myjącym nr 2 utrzymywanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj jeden słoik do mycia szkiełek z 70 mililitrami acetonitrylu, a drugi słoik do mycia szkiełek z 70 mililitrami roztworu stabilizującego i ciągnącego.Umieść oba słoiki do mycia szkiełek w dygestorium o temperaturze pokojowej. Po inkubacji wyjmij komorę hybrydyzacyjną z pieca do hybrydyzacji i poluzuj zaciski komory, aby otworzyć pokrywę. Następnie wyjmij chip mikroukładu ze szkiełka uszczelki i umieść je na naczyniu do mycia szkiełek z Wash Buffer One.Odizoluj układ mikromacierzy od szkiełka pokrywy. Następnie przenieś chip mikromacierzy do drugiego naczynia do mycia szkiełek za pomocą Wash Buffer One. Za pomocą mieszadła delikatnie mieszaj roztwór na magnetycznej płytce mieszającej w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Umieść chip mikro macierzy na naczyniu do mycia szkiełek ze wstępnie podgrzanym buforem myjącym dwa, a następnie mieszaj mieszadłem, aby myć roztwór w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Wyjmij chip mikromacierzy i umieść go w słoiku do mycia szkiełek zawierającym acetonitryl w okapie wyciągowym w celu mycia przez 30 sekund. Przenieś chip mikromacierzy do słoika do mycia szkiełek z roztworem stabilizującym i suszącym i myj ponownie, przez 30 sekund.Ostrożnie usuń wiór i susz przez minutę w dygestorium. Zeskanuj układ mikromacierzy za pomocą skanera w rozdzielczości dwóch mikrometrów. Oprogramowanie do mapowania sygnałów wykorzystano jako interfejs do analizy rozkładu znormalizowanych stosunków logarytmu dwa sygnałów zmutowanych i dzikich w ośmiu chromosomach.W przypadku przypuszczalnych delecji uwzględnia się wartość stosunku logarytmu dwa równą lub mniejszą niż minus dwa punkty pięć, odchylenie standardowe. Analiza segmentacyjna oprogramowania wykazała szacowany region delecji 22 kilozasad na chromosomie czwartym pokazanym na wykresie. Analiza granic delecji otoczonych sondami mikromacierzowymi wykazała zmniejszony średni znormalizowany stosunek logarytmu dwóch.Wykres pokazuje również sześć innych genów z adnotacjami, w tym gen son obejmujący usunięty region. Gen Son jest odpowiedzialny za kontrolowanie guzków w Metecago truncatula. Następnie, amplifikacja PCR wykonana w celu potwierdzenia granic delecji pokazuje produkt o wartości jednego punktu i pięciu kilozasad amplifikowany z mutanta FN6191, ale nie w typie dzikim.Sekwencjonowanie DNA zostało wykonane, aby pokazać połączenie delecyjne w mutancie FN6191 pokazanym na czarnej strzałce. Przeprowadzono również sekwencjonowanie, które potwierdziło lokalizację granic usuwania. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu 72 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Aby uzyskać wysokiej jakości dane, należy pamiętać o utrzymaniu niskiego stężenia ozonu w pomieszczeniu, w którym wykonywany jest zabieg. Po tej procedurze można wykonać inne pomiary, takie jak reakcje łańcuchowe polimerazy sekwencjonowania całego genomu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zmiany rozmiaru i liczby kopii w genomie. Wydarzenie i walidacja tej techniki utorowały naukowcom drogę do zbadania zmienności liczby kopii, którą wywołują w przypadku mutantów i naturalnych wariantów u gatunków roślin, które nie są podatne na mutagenezę insercyjną, takich jak Garden P. Nie zapominaj, że praca z acetonitrylem, roztworem stabilizującym i suszącym może być niezwykle niebezpieczna.Środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych, unikanie bezpośredniego kontaktu ze środkami i ostrożność, są absolutnie niezbędne.

an-array-based-comparative-genomic-hybridization-platform-for

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejsze wideo jest demonstracją techniczną protokołu hybrydyzacji dla zestawu CGH z płytkami o gęstym pokryciu całego genomu (whole genome tiling path array CGH), który pozwala na przeskanowanie całego ludzkiego genomu przy użyciu zaledwie 25-100 ng DNA, które można wyizolować z różnych źródeł, w tym z archiwalnego materiału utrwalonego w formalinie.

Demonstracja techniczna porównawczej hybrydyzacji genomowej całego genomu z wykorzystaniem macierzy (array CGH)

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Ten protokół opisuje szybką i mało materiałochłonną procedurę integracji transgenicznych układów pozachromosomalnych z genomem Caenorhabditis elegans za pomocą promieniowania ultrafioletowego (UV). Co więcej, protokół ten jest szczególnie odpowiedni dla linii transgenicznych, które przesyłają macierze pozachromosomalne z dużą szybkością.

Szybki protokół integracji macierzy pozachromosomalnych o wysokiej szybkości transmisji z genomem C. elegans

Tablica CGH do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych zastąpiła analizę kariotypów w pasmach G. W artykule opisano technologię i jej zastosowanie w laboratorium usług diagnostycznych.

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) do wykrywania wariantów liczby kopii genomowych

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

W tym artykule prezentujemy protokół, który jest opisany jako analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRM) oparta na docelowych lokalnych zmianach w genomach (TILLING). Metoda ta wykorzystuje zmiany fluorescencji podczas topnienia dupleksu DNA i nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych zarówno insercji/delecji (Indel), jak i substytucji pojedynczej zasady (SBS).

Identyfikacja mutacji poprzez topnienie w wysokiej rozdzielczości w populacji ryżu uprawianej metodą TILLING

Protokół przedstawia ogólne procedury laboratoryjne wymagane w preimplantacyjnych testach genetycznych na aneuploidię na platformie sekwencjonowania nowej generacji opartej na półprzewodnikach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe etapy amplifikacji całego genomu, selekcji fragmentów DNA, budowy biblioteki, przygotowania szablonów i przepływu roboczego sekwencjonowania z reprezentatywnymi wynikami.

Preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku aneuploidii na półprzewodnikowej platformie sekwencjonowania nowej generacji

Poznaj metodę CGH do wykrywania zmian liczby kopii u mutantów Medicago truncatula indukowanych prędkimi neutronami. Ta technika umożliwia badanie genetyki rośin strączkowych i rozwoju brodawek korzeniowych.

Oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów Medicago truncatula (Wideo) | JoVE Journal

Oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów Medicago truncatula

Przeglądaj więcej filmów