Techniczna demonstracja porównawczej hybrydyzacji genomowej całego genomu

Poniższa krótka prezentacja to film przedstawiający protokół hybrydyzacji dla macierzy 27 K sub megabase. Ta tablica lub inteligentna tablica składa się z 26 946 indywidualnie sekwencjonowanych klonów wstecznych wydrukowanych na jednym slajdzie. Są one wyświetlane w dwóch egzemplarzach, co daje łącznie 54 000 elementów na slajd wydrukowanych w obszarze o wymiarach 18 na 54 milimetry.

Uzyskane dane są porównywalne z macierzami oligonucyklograficznymi o wysokiej gęstości bez konieczności interpretacji danych przez bioinformatyków. Jedną z głównych zalet korzystania z dużej matrycy wstawienniczej, takiej jak klony tylne, jest to, że pozwala ona na użycie zaledwie 100 nanogramów próbki DNA bez amplifikacji. Pozwala to na analizę różnych próbek, takich jak DNA z zamrożonych krwi, posortowanych komórek tkankowych i materiału FFPE.

Inteligentna matryca okazała się przydatna w warunkach klinicznych. W BC Cancer Agency analiza próbek wielu pacjentów jest łatwo dostosowana do przeciętnego tygodnia pracy. Do cytogenetyki.

Większość kroków używanych w tablicy CGH jest podobna do konwencjonalnego CGH lub ryby. Umożliwia szybkie wprowadzenie protokołu do uznanych laboratoriów. Jakość DNA ma największy wpływ na wyniki w matrycach.

Hybrydyzacja CGH, niska jakość lub zanieczyszczone DNA niekorzystnie wpłyną na włączenie PSI do produktu, powodując przyćmione obrazy lub szumy w danych. Spektrofotometr NanoDrop jest doskonałym narzędziem do oceny jakości DNA przed hybrydyzacją. Aby określić ilościowo zestaw DNA, NanoDrop do pomiaru kwasu nukleinowego i tryb do pomiaru ślepej próby DNA 50, NanoDrop z 1,5 mikrolitra tego samego roztworu, co próbka zawieszona.

W tym przypadku jest to Tris wodny. Wykazano, że EDTA ma potencjalny negatywny wpływ na włączenie PS D. Usuń pustą chusteczkę chusteczką Kim i dodaj 1,5 mikrolitra próbki odmierz i zapisz stężenie próbki.

Odczyt dwóch 60 na 2 80 w NanoDrop jest dobrym wskaźnikiem jakości DNA, gdzie stosunek 1,8 jest optymalny. Metoda podwójnego współczynnika: dwa 60 na dwa 80 i dwa 60 na dwa 30 zapewnia jeszcze lepszy sposób określania czystości próbek. NanoDrop wyświetla krzywą reprezentującą absorbancję w stosunku do długości fali.

Gładka krzywa bez pików wskazuje na dobrej jakości wycieranie DNA i czyszczenie NanoDrop wodą i chusteczką Kim lub, jeśli próbka jest ograniczona, pipetowanie próbki z cokołu. Protokół ten jest zoptymalizowany dla próbek o wielkości od 100 do 400 nanogramów. 200 nanogramów to ilość docelowa dla dobrej jakości DNA Do oznakowania próbki wymagane są następujące odczynniki i sprzęt.

Bufor SCI, trzy SCI, pięć losowych ER, 10 razy DNTP, mieszanie, odniesienie, sterylna woda, sterylna woda, 0,2 mikrolitra, sterylne probówki PCR, blok ciepła lodu w inkubatorze o temperaturze 100 stopni Celsjusza w temperaturze 45 stopni Celsjusza. Ustawić jedną probówkę reakcyjną dla referencyjnego DNA i jedną probówkę reakcyjną. W przypadku próbek DNA zostaną one oznaczone odpowiednio jako sci-fi i SCI.

W warunkach badawczych wolimy używać CY 3 do naszej próbki DNA, ponieważ jest ona bardziej odporna na degradację ozonu. Połącz swoje DNA, wodę i bufor kanałowy z próbką i powtórz dla referencyjnego DNA. W naszym laboratorium łączymy 10-krotny bufor z losowym Optimusem.

Aby utworzyć pięciokrotny roztwór, dodaj sterylną wodę do całkowitej objętości 17 mikrolitrów. Przenieś rurki do bloku grzewczego, denaturuj przez pięć minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza. Przenieś natychmiast na lód.

Dodaj cztery mikrolitry 10-krotnej mieszanki DNTP. Dodaj boczne oczy. Dodaj dwa mikrolitry DCTP znakowanego SCI do próbki DNA.

Dodaj dwa mikrolitry DCTP znakowanego scifi, aby odnieść się do DNA. Dodaj 2,5 mikrolitra kanału i wymieszaj. Roztwór można mieszać ręcznie lub wirować.

Krótko odwiruj roztwór na dno probówki szybkim impulsem w wirówce stołowej. Przełóż do piekarnika i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni. Czas hybrydyzacji w ciągu nocy można regulować w zakresie od 14 do 24 godzin bez negatywnego wpływu na proces etykietowania.

Aby dopasować harmonogram laboratoryjny za pomocą kolumny MicroCon YM 30, dodaj 100 mikrolitrów złapanego 1D NA do kolumny. Uważaj, aby nie dotknąć membrany złapaną końcówką pipety. Wiadomo, że różnice w poszczególnych partiach DNA występują nawet w przypadku zakupu od głównych dystrybutorów.

Zaleca się zakup i przetestowanie dużych partii przed użyciem. Na każdą próbkę hybrydyzacji będą teraz dwie probówki, jedna w kolorze niebieskim i jedna w kolorze czerwonym. Połączyć probówki dla każdej próbki i wymieszać przez pipetowanie.

Następnie przenieś cały roztwór do membrany MicroCon. Umieść kolumnę w dołączonej rurce MicroCon i wiruj z prędkością 13 000 G przez 10 minut. Kolumna MicroCon jest kolumną wykluczającą rozmiar i zatrzymuje DNA z wbudowanymi barwnikami bocznymi i umożliwia nieinkorporowanym barwnikom przemycie przez membranę.

Aby umyć wszelkie resztki nieinkorporowanych nukleotydów lub boku, dodaj 200 mikrolitrów sterylnej wody destylowanej do membrany. Wirować ponownie z prędkością 13 000 g przez 10 minut. Wyrzuć probówkę i dodaj 45 mikrolitrów roztworu hybrydyzacyjnego do górnej części kolumny koncentratora MicroCon.

Roztwór hybrydyzacyjny, którego używamy, to Dig Easy firmy Roche Scientific, do roztworu można również dodać pięć mikrolitrów współdzielonego nasienia śledzia. Tradycyjnie było to używane do blokowania niekonkurencyjnego wiązania z powierzchnią ślizgu. Pojawienie się nowych substancji wiążących pozwoliło na wyeliminowanie tego etapu.

Jednak czasami dodaje się go w celu zwiększenia lepkości roztworu hybrydyzacyjnego. Odwróć kolumnę MicroCon i umieść ją w nowej oznaczonej probówce. Wiruj probówkę o masie 3000 G przez trzy minuty.

Roztwór zgromadzi się na dnie nowej probówki. 1,5 mikrolitra roztworu zostanie użyte do ilościowego określenia inkorporacji SD. Ustaw wartość analizy mikromacierzy NanoDrop To na pustą.

NanoDrop z 1,5 mikrolitra kopania. Łatwy bufor hybrydyzacyjny. Zmierz ślepą próbę za pomocą NanoDrop.

Odczyt powinien wynosić zero. Usuń pustą chusteczkę chusteczką kim i dodaj 1.5 mikrolitra miarki próbki i zapisz włączenie próbki. NanoDrop poda ci stężenie mola PICA na mikrolitr zarówno w próbkach barwników S3, jak i sci-fi z wbudowanymi poniżej.

Należy uznać, że trzy ole na mikrolitr mają za mało czwórek fluorowych Aby kontynuować, NanoDrop wyświetli wykres absorbancji w funkcji długości fali. Dwa szczyty powinny być widoczne, po jednym dla każdego z bocznych oczu, wytrzyj i wyczyść NanoDrop wodą i chusteczką kim. Umieść szkiełko nakrywkowe na podgrzewaczu do szkiełek lub bloku grzewczym podgrzanym do 45 stopni Celsjusza, aby utrzymać temperaturę hybrydyzacji.

Umieść 42 mikrolitry roztworu sondy na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 milimetry na 60 milimetrów. Upewnij się, że w roztworze nie ma pęcherzyków powietrza. Szybką sztuczką na usunięcie uporczywej bańki jest wzięcie świeżego szkiełka nakrywkowego i przebicie bańki ostrym rogiem.

Dopasuj szkiełko do szkiełka nakrywkowego i roztworu sondy. Dolna krawędź szkiełka, umożliwiając kontakt z roztworem hybrydyzacyjnym. Kontynuuj obniżanie jednej krawędzi, aż szkiełko nakrywkowe przymocuje się do szkiełka z napięciem powierzchniowym.

Odwróć slajd. Umieść szkiełko w kasecie hybrydyzacyjnej, rozgrzej do 45 stopni Celsjusza i dodaj 10 mikrolitrów wody do dolnego rowka, aby kontrolować wilgotność. Ten krok należy ćwiczyć, ponieważ kopanie łatwo krystalizuje w niższych temperaturach i pozostawia tło na szkiełku.

Jest to szczególnie ważne, gdy roztwór znajduje się na szkiełku, ponieważ jest to bardzo cienka warstwa cieczy. W tym momencie zamknij kasetę i inkubuj przez 36 do 40 godzin w temperaturze 45 stopni Celsjusza. Wyjęcie szkiełka z kasety hybrydyzacyjnej ma kluczowe znaczenie.

Kopać, łatwo krystalizuje w temperaturze pokojowej. Szkiełko należy natychmiast zanurzyć, a szkiełko nakrywkowe usunąć w roztworze myjącym. Wszystkie roztwory do mycia powinny być przygotowane wcześniej i mieć pH siedem nieneutralnych pH, które mogą degradować boczne oczy.

Podgrzej roztwór myjący do 45 stopni Celsjusza. Dodaj około 60 mililitrów roztworu do płukania do słoika Copeland przed otwarciem komory hybrydyzacyjnej. Otwórz komorę.

Zdejmij szkiełko pęsetą i dodaj szkiełko do roztworu myjącego. Trzymając szkiełko nakrywkowe, odczekaj od 10 do 20 sekund i wyjmij szkiełko nakrywkowe pęsetą. Powinien był spaść ze zjeżdżalni.

Jest to ważny krok, ponieważ zapobiega krystalizacji bufora dig easy, a także zmniejsza potencjalne zarysowania szkiełka poprzez mechaniczne usunięcie szkiełka nakrywkowego. Umyj szkiełko trzykrotnie w roztworze myjącym. Jedna minuta z poruszeniem.

Opłucz szkiełko trzy razy. Po ostatnim praniu nie powinny być widoczne żadne resztki bąbelków z karty charakterystyki w roztworze myjącym. Pozostaw szkiełko w roztworze myjącym, aż będzie gotowe do wirowania.

Wirować w 50-mililitrowej probówce Falcon o stężeniu 700 G przez jedną minutę. Przed użyciem upewnij się, że rurka Falcon jest sucha. Natychmiast zeskanuj slajd, ponieważ intensywność sygnału będzie się zmniejszać z czasem.

W zależności od poziomu ozonu w otoczeniu każdy skaner jest inny, ale istnieje kilka wspólnych wskazówek, których należy przestrzegać. Do obrazowania slajdów. Poziomy ozonu w otoczeniu mają kluczowe znaczenie podczas procesu skanowania.

Matryca sci-fi jest wrażliwa na ozon i ulega szybkiej degradacji podczas długiego czasu skanowania. Wykazano, że pięć części na miliard ozonu wpływa na S pięć. Jest to równoznaczne z lekkim zanieczyszczeniem ruchu drogowego w pogodny dzień.

Mierniki ozonu są zalecane do rejestrowania poziomów ozonu w otoczeniu. Dla każdego kanału S3 i SCI pięć tworzony jest osobny obraz. Kanały można zrównoważyć, zmieniając ekspozycję, czas, wzbudzenie, wejście lub czułość przechwytywania skanera.

Obrazy te są teraz gotowe do analizy.