Oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej w celu wyizolowania dwóch oddziałujących białek

Aby wykryć i wyizolować parę specyficznych białek oddziałujących za pomocą oczyszczania powinowactwa do komplementacji dwucząsteczkowej, dodaj parę mieszaniny plazmidów i środka transfekcji bimolekularnej do soczewki fluorescencyjnej do płytki hodowlanej zawierającej komórki ssaków.

Jeden plazmid koduje jedno oddziałujące białko - białko przynęty - połączone z reporterowym fragmentem białka fluorescencyjnego. Drugi plazmid koduje inne białko wiążące - białko ofiary - połączone z komplementarnym fragmentem białka fluorescencyjnego.

Inkubować. Środek transfekcyjny ułatwia wychwyt komórkowy plazmidu. Pomyślnie transfekowane komórki wykazują ekspresję białek zlokalizowanych w błonie komórkowej.

Interakcje białek przynęta-ofiara zbliżają do siebie fragmenty białek fluorescencyjnych. Powoduje to fuzję i ponowne fałdowanie fragmentów, tworząc funkcjonalne białko fluorescencyjne, którego fluorescencję można uwidocznić pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Zastąp pożywkę niejonowym buforem do lizy zawierającym detergent, aby rozerwać błony komórkowe, uwalniając białka fuzyjne. Zbierz lizat komórkowy w probówce. Wirówka.

Przenieść supernatant zawierający białko fuzyjne do świeżej probówki. Dodaj