Oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej w celu wyizolowania dwóch oddziałujących białek

Aby wykryć i wyizolować parę specyficznych białek oddziałujących za pomocą oczyszczania powinowactwa do komplementacji dwucząsteczkowej, dodaj parę mieszaniny plazmidów i środka transfekcji bimolekularnej do soczewki fluorescencyjnej do płytki hodowlanej zawierającej komórki ssaków.

Jeden plazmid koduje jedno oddziałujące białko - białko przynęty - połączone z reporterowym fragmentem białka fluorescencyjnego. Drugi plazmid koduje inne białko wiążące - białko ofiary - połączone z komplementarnym fragmentem białka fluorescencyjnego.

Inkubować. Środek transfekcyjny ułatwia wychwyt komórkowy plazmidu. Pomyślnie transfekowane komórki wykazują ekspresję białek zlokalizowanych w błonie komórkowej.

Interakcje białek przynęta-ofiara zbliżają do siebie fragmenty białek fluorescencyjnych. Powoduje to fuzję i ponowne fałdowanie fragmentów, tworząc funkcjonalne białko fluorescencyjne, którego fluorescencję można uwidocznić pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Zastąp pożywkę niejonowym buforem do lizy zawierającym detergent, aby rozerwać błony komórkowe, uwalniając białka fuzyjne. Zbierz lizat komórkowy w probówce. Wirówka.

Przenieść supernatant zawierający białko fuzyjne do świeżej probówki. Dodaj kulki agarozy sprzężone z przeciwciałem jednodomenowym ukierunkowanym na białko fluorescencyjne, nanobody, które rozpoznaje i wiąże się z trójwymiarowym epitopem na złożonym białku fluorescencyjnym.

wirówka. Zawiesić kulki agarozy związane z białkiem fuzyjnym w buforze. Podgrzej, aby oddzielić białka fuzyjne od kulek agarozy. Wykonaj SDS-PAGE w celu oddzielenia pojedynczych białek, a następnie Western blot z przeciwciałami specyficznymi dla fluorescencyjnych fragmentów białka.

Wykrywane są tylko oddziałujące białka oznaczone fragmentami fluorescencyjnymi, co potwierdza ich izolację.

Najpierw wysiewaj HEK293T komórki w 10-centymetrowych szalkach zawierających 10 mililitrów DMEM. Następnie rozcieńczyć 2,5 mikrograma każdego wektora komplementacji fluorescencji dwucząsteczkowej w 500 mikrolitrach buforu transfekcyjnego.

Dodaj 10 mikrolitrów odczynnika do transfekcji i wiruj mieszaninę przez 10 sekund. Następnie krótko odwirować próbki i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie dodaj kroplami mieszaninę transfekcji DNA do naczynia. Następnie inkubować próbki przez 8 do 24 godzin.

Przygotuj bufor do lizy komórek i uzupełniony bufor do lizy komórek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dwukrotnie umyj komórki lodowatym PBS. Odessać PBS i dodać 1 mililitr lodowatego buforu do lizy komórek.

Następnie umieść naczynie na lodzie i inkubuj przez pięć minut. Następnie użyj skrobaka do komórek, aby usunąć komórki i przenieść je do schłodzonej probówki mikrowirówkowej. Odwiruj probówkę pod ciśnieniem 18 000 razy większym od grawitacji przez pięć minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby usunąć resztki komórkowe. Następnie przenieść klarowny sklarowany sklarowany sklarent do świeżej probówki do mikrowirówki.

Umyj odpowiednią ilość kulek agarozy w 1 mililitrze PBS. Następnie odwiruj kulki pod 300-krotnością grawitacji i ostrożnie usuń supernatant. Następnie dodaj 20 mikrolitrów kulek agarozy do każdej próbki i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez dwie godziny z rotacją od końca do końca.

Odwiruj kulki pod 300-krotnością grawitacji i trzykrotnie umyj je w buforze do lizy komórek. Następnie ponownie zawiesić umyte kulki w 50 mikrolitrach rozcieńczonego buforu do próbki. Na koniec podgrzej próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut.