Porównanie powinowactwa białek wiążących GTPazę przy użyciu testów konkurencji

Ogólnym celem tej procedury jest porównanie względnego powinowactwa partnerów wiążących białka dla ACE GT P z rodziny Row w ściśle kontrolowanych warunkach obciążenia nukleotydami. Osiąga się to poprzez najpierw oczyszczenie potencjalnych konkurencyjnych partnerów wiążących, z których każdy jest oznaczony tym samym znacznikiem, na przykład zielonym białkiem fluorescencyjnym lub GFP. Drugim krokiem jest oczyszczenie GTPA, które nas interesuje.

Na przykład RAC jeden i załaduj odpowiednim nukleotydem, aby osiągnąć pożądany stan sygnalizacyjny GTPA. Następnie gtpa załadowany nukleotydami jest inkubowany ze stałą ilością jednego konkurenta wiążącego i rosnącą ilością drugiego konkurenta wiążącego w celu uzyskania krzywej wiązania miareczkowania. Ostatnim krokiem jest rozpuszczenie białek związanych z unieruchomionym pasem GT za pomocą western blot i zbadanie błony pod kątem znacznika GFP, który jest współdzielony przez dwóch partnerów wiążących.

Ostatecznie Western blot służy do identyfikacji względnych stężeń, w których podobne ilości każdego partnera wiążącego znakowanego GFP są wychwytywane przez GTPazę. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak współstrącanie, jest to, że właściwości wiązania białek GTPA są podyktowane przez związany nukleotyd w komórce. Związany nukleotyd jest labilny, co utrudnia interpretację danych dotyczących wiązania białek.

Rozpocznij tę procedurę od oczyszczenia G tpa oznaczonego GST i ekspresji białek wiążących gtpa, jak opisano w protokole tekstowym. RIN umieszcza kolby z transfekowanymi komórkami w buforze fosforanowym, soli fizjologicznej lub PBS i odsącza kolbę przez pięć minut. Zasysanie wolnego płynu, a następnie zeskrobanie komórek w 500 mikrolitrach buforu do lizy do probówki z mikrofuge, wymieszanie komórek do lizy przez inwersję w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut.

Podczas lizy przemyć dwie partie po 40 mikrolitrów kulek pułapki GFP trzykrotnie świeżym osadem buforu do lizy. Kulki po 2 700 razy G przez dwie minuty między praniami. Po lizie rozbarwić lizaty przez odwirowanie w temperaturze 21 000 razy G przez 10 minut.

Przenieść oczyszczony lizat każdego z konkurencyjnych białek do oddzielnych przemytych kulek pułapki GFP. Pozwól białkom fuzyjnym GFP związać się przez dwie godziny, mieszając przez odwrócenie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Załadowane kulki pułapki GFP umyć dwukrotnie w buforze do lizy i dwukrotnie podczas konkurencji.

Wiązanie kulek sedymentacyjnych buforu 2 700 razy G przez dwie minuty między praniami. Elute białka fuzyjne GFP, dodając 40 mikrolitrów 0,2 molowej glicyny i pipetując w górę iw dół przez 30 sekund, natychmiast osadź kulki w 21 000 razy G przez 60 sekund i przenieś ciecz do nowej probówki fuge zawierającej cztery mikrolitry jednego molowego tris HCL, wykonaj ten krok szybko, aby ograniczyć uszkodzenie oczyszczonego białka. Przeanalizować jeden mikrolitr każdego oczyszczonego białka za pomocą western blot i sondować przeciwciałem anty GFP, aby ustalić względną wydajność za pomocą ilościowego systemu blottingu zgodnie z protokołem producenta.

Wyrównaj stężenie białka molowego poprzez dodanie buforu wiążącego konkurencję. Weź 90 mikrolitrów przygotowanego stojaka GST na jeden koralik i umyj trzykrotnie buforem ładującym nukleotydy za pomocą magnetycznego sortera cząstek, aby wytrącić kulki na każdym kroku. Odessać bufor z kulek i dodać 100 mikrolitrów buforu ładującego nukleotydy w zależności od tego, czy wymagane jest ładowanie nukleotydów G-D-P-G-T-P, czy nie.

W eksperymencie konkursowym dodaj 12 mikrolitrów 100 milimolowych GDP, 12 mikrolitrów 10 milimolowych GTP gamma S lub brak nukleotydu do 60 mikrolitrów GST stojaka jeden koralik do kontroli obciążenia nukleotydów. Podziel pozostałe kulki na trzy 10-mikrolitrowe kwaty i dodaj dwa mikrolitry 100 milimolowych GDP, dwa mikrolitry 10-milimolowego GTP gamma S lub bez nukleotydu do każdej probówki. Inkubować mieszanki kulek przez 30 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza z mieszaniem.

Ustabilizuj stojak związany z nukleotydami, jeden przez dodanie jednego molowego chlorku magnezu do mieszanki eksperymentalnej i mieszanin kontrolnych Aby wykonać wiązanie konkurencji. Ustaw sześć mikro probówek fuge. Każdy zawiera 200 mikrolitrów buforu wiążącego konkurencję.

Każda probówka powinna również zawierać 10 mikrolitrów stojaka załadowanego nukleotydami, jeden koraliki i pięć mikrolitrów stojaka. Jedno białko wiążące A jako stałe białko wiążące do każdej probówki dodaj 0, 1, 2, 0,55, 10 lub 20 mikrolitrów jednego białka wiążącego B jako zmienne białko wiążące. Objętości te zakładają w przybliżeniu równe stężenia stałych i zmiennych białek wiążących i mogą wymagać dostosowania.

Uzupełnić całkowitą objętość mieszaniny wiążącej do 235 mikrolitrów przez dodanie konkurencyjnego buforu wiążącego. Następnie ustaw mikro rurkę fuge zawierającą 200 mikrolitrów bufora konkurencji. 10 mikrolitrów eksperymentalnego stojaka załadowanego nukleotydami, jeden koralik i 10 mikrolitrów stojaka na jedno białko wiążące A. Następnie ustaw probówki G-D-P-G-T-P gamma S i bez nukleotydów, jak opisano w protokole tekstowym.

Inkubować probówki przez dwie godziny, mieszając przez odwrócenie w temperaturze czterech stopni Celsjusza po inkubacji. Umyj koraliki trzykrotnie za pomocą konkurencyjnego bufora do bindowania. Na koniec wymyj związane białka w 20 mikrolitrach redukującego buforu próbki.

Ilościowe western blot znacznika GFP oczyszczonego GFP RCC dwa i GFP Corona w jednej domenie C.Propeller ujawnia, że białko w górnym paśmie, GFP RCC dwa jest 1,4 razy obfitsze niż dolne pasmo i powinno zostać rozcieńczone, aby osiągnąć stosunek molowy jeden do jednego w eksperymencie konkurencyjnym. Eksperyment kontrolny pokazuje, że stan obciążenia nukleotydami pierwszego stojaka dyktuje specyficzność wiązania, miareczkując rosnące objętości GFP RCC two w stosunku do ustalonej objętości równomolowej korony GFP w jednej domenie śmigła C i blottingu. Białka, które wiążą się z stojakiem pierwszym, umożliwiają wizualizację względnej zmiany związanego białka, wykreślając intensywności pasma GFP dla obu konkurentów na tym samym wykresie i identyfikując punkt, w którym przecinają się linie, co pozwala na zidentyfikowanie objętości zmiennego białka wiążącego w równowadze.

Należy jednak zadbać o to, aby kwestie takie jak interakcja między konkurentami lub nadmiar gtpa przynęty nie zagrażały eksperymentowi. Wzrost jednego konkurenta bez utraty drugiego, jak pokazano tutaj, wskazuje na problem podczas próby tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać, aby sprawdzić, czy istnieje wzajemny związek między obfitością konkurujących ze sobą partnerów wiążących.

Istnieje wiele problemów, które mogą zniekształcić wyniki i/lub można je rozwiązać, o ile zostaną zidentyfikowane przez sprawdzenie danych.