Porównanie powinowactwa białek wiążących GTPazę przy użyciu testów konkurencji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest porównanie względnych powinowactw białkowych partnerów wiążących dla białek GTPazy z rodziny Row w ściśle kontrolowanych warunkach ładowania nukleotydów. Osiąga się to poprzez uprzednie oczyszczenie domniemanych konkurencyjnych partnerów wiążących, z których każdy jest znakowany tym samym tagiem, na przykład zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Drugim krokiem jest oczyszczenie interesującej nas GTPazy.

Na przykład, należy przeprowadzić reakcję RAC 1 i załadować odpowiedni nukleotyd, aby uzyskać pożądany stan sygnalizacji GTPase. Następnie GTPase załadowany nukleotydem inkubuje się ze stałą ilością jednego konkurenta wiązania i rosnącymi ilościami drugiego konkurenta wiązania w celu uzyskania krzywej miareczkowania wiązania. Ostatnim krokiem jest rozdzielenie białek związanych z unieruchomioną GTPase za pomocą western blot i odszukiwanie na membranie znacznika GFP, który jest wspólny dla obu partnerów wiązania.

Ostatecznie analiza Western blot jest wykorzystywana do określenia względnych stężeń, przy których podobne ilości każdego partnera wiążącego z etykietą GFP są wychwytywane przez GTPazę. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ko-precypitacja, jest fakt, że właściwości wiązania białek GTPazy są determinowane przez związany w komórce nukleotyd. Związany nukleotyd jest labilny, co utrudnia interpretację danych dotyczących wiązania białek.

Procedurę tę należy rozpocząć od oczyszczania białka G tpa z tagiem GST oraz ekspresji białek wiążących gtpa, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Kolby z transfektowanymi komórkami należy przepłukać solą fosforanową (PBS), a następnie odstawić kolbę na pięć minut do spłynięcia płynu. Po odessaniu wolnego płynu, komórki należy zdrapać do probówki do mikrowirówki w 500 µL buforu lizującego, a następnie mieszać komórki w celu ich lizy poprzez odwracanie probówki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.

Podczas etapu przemywania lizatu, ziarna GFP trap należy przemyć trzykrotnie dwiema porcjami po 40 µL świeżego buforu do lizy. Po każdym przemywaniu ziarna należy osadzić przez wirowanie przy 2 700 ×g przez dwie minuty. Po zakończeniu lizy, lizaty należy sklarować poprzez wirowanie przy 21 000 ×g przez 10 minut.

Przenieś oczyszczony lizat każdego z białek konkurencyjnych na oddzielne, przemyte kulki GFP trap. Pozostaw białka fuzyjne GFP do związania na dwie godziny, mieszając przez odwracanie w temperaturze 4°C. Przemyj załadowane kulki GFP trap dwukrotnie w buforze do lizy i dwukrotnie w buforze do konkurencji.

Bufor wiążący osadza kuleczki przy 2 700 ×g przez dwie minuty pomiędzy kolejnymi etapami przemywania. Eluuj białka fuzyjne GFP, dodając 40 µL 0,2 M glicyny i pipetując w górę i w dół przez 30 sekund; następnie natychmiast osadź kuleczki przy 21 000 ×g przez 60 sekund i przelej ciecz do nowej probówki wirówkowej zawierającej 4 µL 1 M Tris-HCl. Wykonaj ten krok szybko, aby ograniczyć uszkodzenia oczyszczonego białka. Przeanalizuj 1 µL każdego oczyszczonego białka metodą western blot, używając przeciwciała anty-GFP w celu określenia względnej wydajności z wykorzystaniem ilościowego systemu blottingowego zgodnie z protokołem producenta.

Wyrównaj molowe stężenie białka poprzez dodanie buforu wiązania konkurencyjnego. Pobierz 90 µL przygotowanych kulek GST rack one i przemyj je trzykrotnie buforem do ładowania nukleotydów, używając magnetycznego separatora cząstek w celu wytrącenia kulek na każdym etapie. Odsącz bufor z kulek i dodaj 100 µL buforu do ładowania nukleotydów, w zależności od tego, czy wymagane jest ładowanie GDP, GTP czy brak nukleotydów.

W celu przeprowadzenia eksperymentu konkurencyjnego, do 60 µL kulek GST rack one w kontrolach ładowania nukleotydów należy dodać 12 µL 100 mM GDP, 12 µL 10 mM GTP gamma S lub nie dodawać nukleotydu. Pozostałe kulki należy podzielić na trzy alikwoty po 10 µL, a do każdej probówki dodać 2 µL 100 mM GDP, 2 µL 10 mM GTP gamma S lub nie dodawać nukleotydu. Mieszaniny z kulkami należy inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 °C przy jednoczesnym mieszaniu.

W celu przeprowadzenia wiązania konkurencyjnego należy ustabilizować rak związany z nukleotydami poprzez dodanie chlorku magnezu w stężeniu 1 M do mieszanin eksperymentalnych i kontrolnych. Przygotować sześć probówek do wirówki, z których każda powinna zawierać 200 µL buforu do wiązania konkurencyjnego.

Każda probówka powinna zawierać również 10 µL racka z załadowanymi nukleotydami, jeden koralik oraz pięć µL racka. Jako stałe białko wiążące do każdej probówki należy dodać białko wiążące A, a jako zmienne białko wiążące dodać 0, 1, 2, 0,55, 10 lub 20 µL białka wiążącego B. Objętości te zakładają w przybliżeniu równe stężenia roztworów zapasowych stałego i zmiennego białka wiążącego i mogą wymagać korekty.

Dopełnić całkowitą objętość mieszaniny wiążącej do 235 µL poprzez dodanie buforu do wiązania konkurencyjnego. Następnie przygotować probówkę do mikrocentryfugi zawierającą 200 µL buforu konkurencyjnego, 10 µL eksperymentalnego nukleotydu załadowanego na rack 1, kulki oraz 10 µL białka A z racku 1. Następnie przygotować probówki kontrolne z GDP, GTPγS oraz bez nukleotydów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Inkubować probówki przez dwie godziny, mieszając przez odwracanie, a następnie pozostawić w temperaturze 4 °C po inkubacji. Przemyć kuleczki trzykrotnie buforem do wiązania konkurencyjnego. Na konieceluować związane białka w 20 µL redukującego buforu do próbek.

Ilościowy western blotting znacznika GFP oczyszczonego białka GFP RCC two oraz GFP Corona in one C.Propeller domain wykazuje, że białko w górnym prążku, GFP RCC two, jest 1,4 raza bardziej obfite niż białko w dolnym prążku i powinno zostać rozcieńczone w celu uzyskania molowego stosunku jeden do jednego dla eksperymentu konkurencji. Eksperyment kontrolny wykazuje, że status załadowania nukleotydów rack one determinuje specyficzność wiązania poprzez miareczkowanie zwiększających się objętości GFP RCC two przeciwko stałej objętości ekimolarny GFP Corona in one C propeller domain i przeprowadzenie blottingu. Białka wiążące się z rack one pozwalają na wizualizację względnej zmiany ilości związanego białka; naniesienie intensywności prążków GFP dla obu konkurentów na tym samym wykresie i zidentyfikowanie punktu przecięcia linii pozwala określić objętość zmiennego białka wiążącego w stanie równowagi.

Należy jednak zachować ostrożność, aby kwestie takie jak oddziaływania między konkurentami lub nadmiar przynęty gtpa nie zakłóciły przebiegu eksperymentu. Wzrost ilości jednego konkurenta bez jednoczesnego spadku ilości drugiego, jak pokazano tutaj, wskazuje na problem podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o sprawdzeniu, czy między obfitością konkurujących partnerów wiążących zachodzi relacja odwrotna.

Istnieje szereg problemów, które mogą zniekształcić wyniki i które można rozwiązać, o ile zostaną one zidentyfikowane podczas analizy danych.