Name: Porównanie powinowactwa białek wiążących GTPazę przy użyciu testów konkurencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj metodę porównywania powinowactwa białek wiążących GTPazę Rac1 przy kontrolowanym ładowaniu nukleotydów. Protokół obejmuje oczyszczanie białek znakowanych GFP i analizę Western blot.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Wellcome Trust 088419 dla MDB.

1. Oczyszczanie GTPazy oznaczonej GST
<ol>
	<li>Hodowla szczepu E. coli, takiego jak BL21 przekształconego za pomocą pGEX-Rac1 O/N w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 220 obr./min, w 500 ml pożywki autoindukcyjnej (25 mM Na2HPO4, 25 mM KH2PO4, 50 mM NH4Cl, 5 mM Na2SO4, 2 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0,5% glicerol, 0,05% glukozy, 0,2% laktozy, 5 g tryptonu, 2,5 g ekstraktu drożdżowego, 100 μg/ml ampicyliny).</li>
	<li>Zebrać bakterie przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g, 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad bakteryjny w 20 ml odczynnika do ekstrakcji białek, 1x inhibitora proteazy i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej z inwersją.</li>
	<li>Klarować lizat przez odwirowanie w stężeniu 40 000 x g przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 2 ml kulek magnetycznych glutationu, przemytych solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS: 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl).</li>
	<li>Inkubować przez 2 godziny, mieszając przez odwrócenie w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj kulki naładowane białkiem cztery razy za pomocą 10 ml PBS, używając magnetycznego sortownika cząstek, aby wytrącić kulki na każdym etapie.</li>
	<li>Zawiesić kulki białkowe w 2 ml PBS i przechowywać w temperaturze -80 °C w 100 μl porcji, aż będą potrzebne.</li>
</ol>
2. Ekspresja białek wiążących GTPazę
<ol>
	<li>Dzień przed eksperymentem, transfekcyjne plazmidy kodujące wersje każdego białka wiążącego GTPazę znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w oddzielnej kolbie o długości 75cm2 z HEK293T w następujący sposób. W celu walidacji obciążenia nukleotydami, transfekcję TrioD1 znakowaną GFP należy umieścić w trzeciej kolbie o długości75 cm2 z HEK293T.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć polietylenoaminę do 1 mg/ml w 100 μl sterylnego 150 mM NaCl.</li>
		<li>Dodać 27 μl rozcieńczonego polietylenu do 223 μl zredukowanej pożywki surowicy.</li>
		<li>Dodać 12 μg plazmidowego DNA do 250 μl zredukowanej pożywki surowicy.</li>
		<li>Inkubować każdą probówkę przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Połącz mieszaniny polietylenoaminy i DNA w jednej probówce i wiruj przez 2 minuty.</li>
		<li>Inkubować przez 15-20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastąp pożywkę wzrostową (zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, bez antybiotyków) na 90% zlewającą się HEK293T 5 ml świeżej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Dodać połączoną mieszaninę polietylenu i DNA do kolby i inkubować O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oczyszczanie białek wiążących GTPazę
<ol>
	<li>Przepłukać kolby z transfekowanymi komórkami w PBS i opróżnić kolbę przez 5 minut, zasysając wolny płyn.</li>
	<li>Zeskrob komórki z 500 μl buforu do lizy (50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 1% Nonidet P-40, 1x inhibitor proteazy) do probówki do mikrofuge.</li>
	<li>Lizować komórki przez mieszanie przez odwrócenie w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
	<li>Podczas lizy umyć dwie partie kulek GFP-Trap o pojemności 40 μl trzykrotnie świeżym buforem do lizy, kulkami osadowymi w ilości 2 700 x g przez 2 minuty między myciami.</li>
	<li>Klarować lizaty przez odwirowanie przy 21 000 x g przez 10 min.</li>
	<li>Przenieść oczyszczony lizat każdego z konkurencyjnych białek do oddzielnych przemytych kulek pułapki GFP i pozwolić białkom fuzyjnym GFP związać się przez 2 godziny, mieszając przez odwrócenie w temperaturze 4 °C. Lizat z komórek GFP-TrioD1 należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Załadowane kulki GFP-Trap umyć dwukrotnie w 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM NaCl, 0,7% (w/v) Nonidet P-40 i dwukrotnie w 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2, kulkach sedymentacyjnych przy 2 700 x g przez 2 minuty między praniami.</li>
	<li>Elute białka fuzyjne GFP poprzez dodanie 40 μl 0,2 M glicyny (pH 2,5) i pipetowanie w górę iw dół przez 30 sekund. Natychmiast zderzyć osad przy 21 000 x g przez 60 s i przenieść ciecz do nowej probówki do mikrofuzy zawierającej 4 μl 1 M Tris-HCl (pH 10,4). Zrób to szybko, aby ograniczyć uszkodzenia oczyszczonego białka.</li>
	<li>Przeanalizować 1 μl każdego oczyszczonego białka za pomocą Western blot i sondować przeciwciałem anty-GFP, aby ustalić względną wydajność za pomocą ilościowego systemu blottingu zgodnie z protokołem producenta. Alternatywnie, można określić stężenia białek za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA), ale wprowadza to błędy, jeśli białka nie reagują z testem w identyczny sposób lub występują białka zanieczyszczające.</li>
	<li>Wyrównać stężenie białka molowego przez dodanie 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2.</li>
</ol>
4. Obciążenie nukleotydowe GTPazy
<ol>
	<li>Rozmrozić jedną porcję koralików magnetycznych GST-Rac1 przygotowanych w kroku 1.</li>
	<li>Weź 90 μl kulek GST-Rac1 i przemyj trzykrotnie 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA, używając magnetycznego sortera cząstek, aby wytrącić kulki na każdym etapie.</li>
	<li>Odessać bufor z kulek i dodać 100 μl 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 25 mM NaCl, 0,1 mM DTT, 4 mM EDTA.</li>
	<li>W zależności od tego, czy w eksperymencie konkursowym wymagane jest obciążenie GDP, GTP czy brak nukleotydów, dodaj 12 μl 100 mM GDP, 12 μl 10 mM 5'-[γ-tio]trifosforanu guanozyny (GTPγS) lub bez nukleotydu do 60 μl kulek GST-Rac1.</li>
	<li>W przypadku kontroli obciążenia nukleotydami podziel pozostałe kulki na trzy podwielokrotności 10 μl i dodaj 2 μl 100 mM GDP, 2 μl 10 mM GTPγS lub bez nukleotydu do każdej probówki.</li>
	<li>Inkubować mieszanki kulkowe przez 30 minut w temperaturze 30 °C z mieszaniem.</li>
	<li>Ustabilizować Rac1 związany z nukleotydami przez dodanie 1 M MgCl2: 3 μl do mieszaniny doświadczalnej (krok 4.4), 0,5 μl do każdej z mieszanin kontrolnych (krok 4.5).</li>
</ol>
5. Wiążące zawody.
<ol>
	<li>Ustaw 6 probówek do mikrofuge, z których każda zawiera: 
	200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 
	10 μl eksperymentalnych kulek Rac1 załadowanych nukleotydami (od kroku 4.7) 
	5 μl białka wiążącego Rac1 A (stałe białko wiążące)</li>
	<li>Do każdej probówki dodać 0, 1, 2,5, 5, 10 lub 20 μl białka B wiążącego Rac1 (białko o zmiennym wiązaniu). Objętości te zakładają w przybliżeniu równe stężenia stałych i zmiennych białek wiążących i mogą wymagać dostosowania.
	<ol>
		<li>Dostosuj objętości białek wiążących A i B, jeśli występują duże różnice w powinowactwie wiązania dwóch białek i powinno to być określone empirycznie za pomocą powtórzeń doświadczalnych. Uzupełnić całkowitą objętość mieszaniny wiążącej do 235 μl przez dodanie 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainstaluj probówkę do mikrofuge zawierającą: 
	200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 
	10 μl eksperymentalnych kulek Rac1 załadowanych nukleotydami (od kroku 4.7) 
	10 μl białka A wiążącego Rac1 (białko o stałym pasie)</li>
	<li>Ustaw probówki kontrolne GDP, GTPγS i bez nukleotydów: 
	200 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2 
	10 μl kontrolnych kulek Rac1 załadowanych w kroku 4.5 z GDP, GTPγS lub bez nukleotydu i ustabilizowanych w kroku 4.7. 
	180 μl lizatu HEK293T GFP-TrioD1, przygotowanego jak w kroku 3.6 
	4 μl 1 M MgCl2</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 2 godziny, mieszając przez odwrócenie w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj koraliki trzykrotnie 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM MgCl2.</li>
	<li>Elute białka związane w 20 μl redukującego buforu próbki (50 mM Tris-HCl (pH 7), 5% SDS, 20% glicerol, 0,02 mg/ml błękitu bromofenolowego, 5% β-merkaptoetanolu).</li>
</ol>
6. Analiza konkurencji
<ol>
	<li>Rozpuść 10 μl związanego białka (krok 5.6) za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i Western blot.</li>
	<li>Inkubować błonę w temperaturze 4 °C O/N w przeciwciałie anty-GFP rozcieńczonym 1/1000 w buforze blokującym rozcieńczonym do 1x w PBS, 0,1% Tween-20, aby wykryć oba znakowane białka wiążące GTPazę.</li>
	<li>Umyj membranę trzy razy przez 10 minut za pomocą PBS, 0,1% Tween-20.</li>
	<li>Inkubować błonę przez 30 minut w RT w sprzężonym z DyLight 800 drugorzędowym przeciwciałie anty-króliczym, rozcieńczonym 1/10 000 w buforze blokującym rozcieńczonym do 1x w PBS, 0,1% Tween-20.</li>
	<li>Umyj membranę trzy razy przez 10 minut za pomocą PBS, 0,1% Tween-20.</li>
	<li>Zeskanuj membranę za pomocą systemu obrazowania w podczerwieni, korzystając z oprogramowania do pomiaru intensywności pasma zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Wykreślić intensywność pasma każdego białka w stosunku do objętości zmiennego konkurenta (białka B).</li>
	<li>Podzielić objętość zmiennego konkurenta w punkcie, w którym linie się przecinają, przez objętość stałego konkurenta (białko A, 5 μl), aby określić stosunek konkurenta, przy którym osiągana jest równowaga.</li>
	<li>W celu walidacji stanu obciążenia nukleotydami, błony sondy dla kinazy 1 aktywowanej p21 (PAK1) (efektor) i GFP-TrioD1 (GEF), jak opisano w krokach 6.1-6.6.</li>
</ol>

<ol><li>Burridge, K., Rho Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+Rac+take+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">and Rac take center stage.</a> Cell. 116 (2), 167-179 (2004).</li>
<li>Raftopoulou, M., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+Rho+GTPases+lead+the+way%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration: Rho GTPases lead the way.</a> Dev Biol. 265 (1), 23-32 (2004).</li>
<li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GEF+means+go%3A+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (2), 167-180 (2005).</li>
<li>Worthylake, D. K., Rossman, K. L., Crystal Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure+of+Rac1+in+complex+with+the+guanine+nucleotide+exchange+region+of+Tiam1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">structure of Rac1 in complex with the guanine nucleotide exchange region of Tiam1.</a> Nature. 408 (6813), 682-688 (2000).</li>
<li>Scheffzek, K., Ahmadian, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTPase+activating+proteins%3A+structural+and+functional+insights+18+years+after+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">GTPase activating proteins: structural and functional insights 18 years after discovery.</a> Cell Mol Life Sci. 62 (24), 3014-3038 (2005).</li>
<li>Del Pozo,, A, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+GTP-Rac+localized+effector+interactions+through+dissociation+of+Rho-GDI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI.</a> Nat Cell Biol. 4 (3), 232-239 (2002).</li>
<li>Williamson, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin-1C+and+RCC2+guide+mesenchymal+migration+by+trafficking+Rac1+and+controlling+GEF+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Coronin-1C and RCC2 guide mesenchymal migration by trafficking Rac1 and controlling GEF exposure.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4292-4307 (2014).</li>
<li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo J. 19 (9), 2008-2014 (2000).</li>
<li>Van Rijssel, J., Hoogenboezem, M., Wester, L., Hordijk, P. L., Van Buul, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+DH-PH+domain+of+Trio+induces+cell+spreading+and+migration+by+regulating+lamellipodia+dynamics+in+a+Rac1-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">The N-terminal DH-PH domain of Trio induces cell spreading and migration by regulating lamellipodia dynamics in a Rac1-dependent fashion.</a> PLoS. 7 (1), e29912(2012).</li>
<li>Self, A. J., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intrinsic+nucleotide+exchange+and+GTP+hydrolysis+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurement of intrinsic nucleotide exchange and GTP hydrolysis rates.</a> Methods Enzymol. 256, 67-76 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje metodę porównywania względnego powinowactwa par małych białek wiążących GTPazę. Kluczowymi etapami są przygotowanie oczyszczonych białek wiążących GTPazę i ładowanie GTPazy nukleotydami. Zastosowanie białek wiążących GTPazę z tym samym znacznikiem GFP pozwala na dokładne określenie stężeń, przy których wiążą się podobne ilości każdego konkurenta. Zastosowanie rekombinowanej GTPazy obciążonej nukleotydami umożliwia zbadanie właściwości wiązania GTPazy w określonych warunkach aktywności. Ten etap jest również najbardziej wrażliwy, ponieważ nukleotydy będą zarówno hydrolizować, jak i odłączać się od GTPazy, jeśli warunki magnezu nie są precyzyjnie utrzymane.
W komórce duża liczba białek wiążących GTPazę w połączeniu z szybkim obrotem nukleotydów utrudnia interpretację takich szlaków. Prostota tej metody, polegająca na porównywaniu tylko par białek wiążących i stosowaniu starannie kontrolowanych warunków ładowania nukleotydów, pozwala na wyjaśnienie szlaków sygnałowych. Jednak największa siła protokołu jest jednocześnie największą słabością, ponieważ jest nim uproszczenie sytuacji in vivo . Testy konkurencji mogą być wykorzystane do zbudowania solidnej hipotezy, ale powinna ona być następnie przetestowana na komórkach za pomocą eksperymentów knockdown.
Istnieją trzy cechy, które należy wziąć pod uwagę przy wyborze białek wiążących GTPazę znakowanych GFP, które mają być użyte w eksperymencie. Po pierwsze, białka fuzyjne muszą ulegać prawidłowej ekspresji w komórkach ssaków, takich jak HEK293T, ponieważ testy konkurencji wymagają rozsądnej ilości białka. Po drugie, musi istnieć możliwość oczyszczenia rekombinowanego białka bez znaczącej degradacji, a w przypadku gdy nie jest to możliwe, należy rozważyć klonowanie fragmentu wiążącego GTPazę. Po trzecie, dwa białka wiążące GTPazę muszą rozdzielić się od siebie na SDS-PAGE, aby umożliwić analizę w sekcji 6.
Istnieje kilka potencjalnych zastrzeżeń do eksperymentu, które należy wziąć pod uwagę i ewentualnie rozwiązać:
Możliwa denaturacja oczyszczonych białek wiążących GTPazę podczas etapu elucji kwasowej lub przeszkoda steryczna przez znacznik GFP. W naszych rękach nie stanowiły one problemu, ale muszą zostać przetestowane. Oczyszczone białka można badać w testach funkcjonalnych 10. Obecnie istnieją komercyjne zestawy do testowania aktywności GEF lub GAP bez konieczności stosowania nukleotydów znakowanych izotopowo. Białka sekwestracyjne, ze swojej natury, chronią GTPazy przed aktywnością GEF lub GAP, więc mogą być stosowane jako inhibitory konkurencyjne w komercyjnych testach GEF lub GAP, tak jak zrobiliśmy to w naszej ostatniej publikacji 7. Istotną cechą białek, które transportują GTPazę, jest zdolność do wiązania GTPazy, co można łatwo przetestować w teście ściąganym. Alternatywnym podejściem do badania integralności białka, które ma zastosowanie do wszystkich białek wiążących, jest miareczkowanie białka eluowanego z kulek pułapki GFP glicyną z tym samym białkiem usuniętym z kulek pułapki GFP przez rozszczepienie enzymatyczne. Eksperyment byłby analizowany poprzez sondowanie zarówno białka znakowanego GFP, jak i rozszczepionego przeciwciałem przeciwko samemu białku. Jeśli białko nie jest uszkodzone przez elucję, równowaga powinna być osiągnięta w stosunku 1:1. Podejście to wskazywałoby również, czy sama obecność znacznika GFP upośledza właściwości wiązania białka kandydującego, chociaż wymaga to wytworzenia konstruktu z enzymatycznym miejscem rozszczepienia między znacznikiem a białkiem wiążącym. Niezależnie od tego, czy białko jest zagrożone przez znacznik, czy przez etap elucji, problem można rozwiązać, modyfikując protokół w celu zastosowania alternatywnej metody oczyszczania. Zamiast GFP, białka wiążące mogą być znakowane His, oczyszczane za pomocą Ni-NTA i analizowane przy użyciu przeciwciała przeciwko znacznikowi His. Ważną cechą jest to, że oba białka wiążące muszą mieć wspólny znacznik, chociaż w razie potrzeby do białka można dodać dwa znaczniki, jeden do oczyszczania, a drugi do wykrywania.
Protokół został zaprojektowany do badania konkurencji między interakcjami z domenami przełącznika I/II. Chociaż większość interakcji GTPazy jest zapośredniczona przez ten motyw, istnieją pewne wyjątki, w szczególności interakcje GDI, które wiążą się z ogonem prenylowym, a także zasłaniają domeny przełączania. Zasadniczo protokół można dostosować do stosowania GTPazy oczyszczonej z komórek ssaków, tak aby GTPaza była prenylowana, jednak obecność wielu miejsc wiązania lub efekty allosteryczne komplikują interpretację danych wiążących konkurencję. Dalsze problemy związane z taką modyfikacją polegają na tym, że GDI oczyszczają się z komórek ssaków za pomocą GTPazy, co pogarsza czystość wyizolowanych białek, a hydrofobowy charakter grup prenylowych oznacza, że prenylowane GTPazy są związane z GDI lub błoną lipidową i takie czynniki musiałyby być brane pod uwagę w eksperymencie.
Ilość GST-Rac1 używana w teście. Stałe białko wiążące GTPazę musi mieć większe stężenie niż Rac1, w przeciwnym razie po dodaniu konkurenta po prostu zwiąże się z wolnym Rac1. Będzie natychmiast oczywiste, czy tak się stało, ponieważ wiązanie konkurenta, bez utraty stałego białka, zostanie wykryte w taki sam sposób, jak wtedy, gdy dwa konkurujące białka wiążą się ze sobą, jak pokazano na rysunku 3B. Jako dodatkową kontrolę (Krok 5.3) należy włączyć reakcję wiązania zawierającą dwukrotnie większą ilość białka wiążącego o stałym poziomie i brak białka wiążącego o zmiennej wartości (Krok 5.3). Jeśli Rac1 w eksperymencie miareczkowania jest nasycony, podwojenie ilości stałego białka wiążącego nie będzie miało wpływu na wyjście. Objętości sugerowane w protokole powinny być odpowiednie, ale ilość Rac1 można łatwo zmniejszyć. Jeśli zaobserwuje się wiązanie konkurenta bez utraty stałego partnera wiążącego, należy spróbować zmniejszyć ilość Rac1 przed próbą mapowania miejsc wiązania, aby uniknąć tworzenia się kompleksu trójskładnikowego.
Niespecyficzne oddziaływanie białek wiążących GTPazę z GST lub kulką, a także specyficznie z Rac1. Problem ten objawiałby się szczątkowym wiązaniem stałego białka wiążącego GTPazę, nawet jeśli zmienne białko wiążące GTPazę osiągnęło plateau przy wysokim stężeniu. Identyfikacja tego problemu będzie wspomagana przez przeprowadzenie wzajemnych eksperymentów, w których stałe i zmienne białka wiążące GTPazę są zamieniane. Eksperymenty wzajemne również znacznie poprawią dokładność oszacowania punktu równowagi, dlatego zawsze powinny być uwzględniane. W przypadku wiązania niespecyficznego, względne stężenia, przy których osiągana jest równowaga, można nadal obliczyć, porównując intensywność pasma między maksimami i minimami dla każdego białka lub mierząc zakres niespecyficznego wiązania przy użyciu kulek GST jako przynęty, a nie GST-Rac1.
W celu uzupełnienia testu konkurencji opisanego w niniejszym protokole należy zastosować testy pull-down wykorzystujące różne warunki obciążenia nukleotydami. Określenie preferencji nukleotydowych partnerów jest ważne zarówno dla zrozumienia wydarzeń związanych z konkurencją, jak i zrozumienia szlaku sygnałowego, w który zaangażowane jest białko wiążące GTPazę. Na rysunku 2B analizujemy wiązanie białek z ustaloną preferencją dla GTPazy załadowanej GTP lub wolnej od nukleotydów jako sposobu walidacji obciążenia nukleotydów. Rozsądne jest jednak zbadanie wpływu obciążenia nukleotydami na każdego z konkurentów. Jeśli hipotetyczni konkurenci wykazują różne preferencje, konkurencja będzie miała mniejszy wkład w szlak sygnałowy, a obrót nukleotydów prawdopodobnie będzie mechanizmem kierującym wymianą białek wiążących.

Cytoszkielet aktynowy, który decyduje o kształcie, polarności i właściwościach migracyjnych komórek ssaków, jest regulowany przez rodzinę Rho małych GTPaz. GTPazy z rodziny Rho obejmują RhoA, który stymuluje skurcz cytoszkieletu, Rac1, który stymuluje rozgałęzianie się aktyny i wypukłość błony, oraz Cdc42, który ma podobny wpływ na polimeryzację aktyny do Rac1 i powoduje powstawanie filopodiów 1,2. Aktywność sygnalizacyjna GTPazy jest określana przez wiązanie nukleotydu, który kontroluje kurczenie się i rozluźnianie pętli przełącznika I i przełącznika II, które pośredniczą w interakcjach białko-białko zarówno z regulatorami, jak i efektorami. GTPazy związane z 5'-trifosforanem guanozyny (GTP) aktywują dalsze efektory, podczas gdy forma związana z 5'-difosforanem guanozyny (GDP) jest nieaktywna. W komórce cykle hydrolizy GTP i wymiany nukleotydów umożliwiają szybką wymianę sygnałów GTPazy, które są niezbędne do dynamiki cytoszkieletu. Obrót nukleotydów jest regulowany przez trzy mechanizmy. Czynniki wymiany nukleotydów guaniny (GEF) stabilizują wolną od nukleotydów GTPazę, katalizując wymianę GDP na GTP, a tym samym stymulując aktywność sygnalizacyjną GTPazy 3,4. Białka aktywujące GTPazę (GAP) katalizują hydrolizę GTP do GDP, hamując w ten sposób aktywność sygnalizacyjną GTPazy 5. Cząsteczki sekwestrujące, takie jak regulator kondensacji chromatyny 2 (RCC2) i inhibitory dysocjacji nukleotydów guaninowych (GDI), zasłaniają pętle przełączające, aw przypadku GDI usuwają GTPazę z błony poprzez interakcję z ogonem prenylu 6,7. Każda z trzech klas cząsteczek regulatorowych oddziałuje z pętlami przełączającymi, podobnie jak efektory i niektóre regulatory transportu, takie jak koronina-1C 7. Celem tego protokołu jest pomiar konkurencji o miejsce wiązania przełącznika I/II między domniemanymi regulatorami a dalszymi cząsteczkami sygnałowymi. Należy zauważyć, że testy konkurencji testują wiązanie ze wspólnym miejscem wiązania, tak że protokół ten nie nadaje się do testowania interakcji z innymi miejscami, takich jak wiązanie GDI z ogonem prenylu.
Subtelność różnic w konformacji między formami aktywnymi i nieaktywnymi, w połączeniu z labilną naturą związanego nukleotydu, utrudniła badanie zdarzeń związanych z wiązaniem GTPazy. Rola związanego nukleotydu oznacza, że konwencjonalne testy wiązania, takie jak immunoprecypitacja lub powierzchniowy rezonans plazmonowy, nie nadają się do badań, ponieważ nukleotydu nie można kontrolować. Przeszkoda ta jest spotęgowana przez nakładanie się miejsc wiązania GEF, GAP, efektorów, cząsteczek sekwestrujących i cząsteczek transportujących, co utrudnia interpretację danych wiążących dla pojedynczej interakcji w kontekście konkurencji, która wystąpi w komórce. Immunoprecypitacja, w szczególności, jest zagrożona przez konkurencję między partnerami wiążącymi, ponieważ w pewnych warunkach komórkowych jeden partner wiążący może zostać zidentyfikowany kosztem wszystkich innych, podczas gdy w innych warunkach inny partner może dominować. Dynamiczna natura sygnalizacji GTPazy jest niezbędna do funkcjonowania GTPazy i musi być brana pod uwagę podczas analizy relacji między oddziaływaniami wiążącymi różnych regulatorów. Rzeczywiście, niedawno opisaliśmy ścieżkę, która w dużej mierze opierała się na konkurencyjnym wiązaniu. Zidentyfikowaliśmy koroninę-1C jako cząsteczkę transportową, która wiąże się z pętlami przełączającymi GDP-Rac1 7. Na obszarach o niskiej aktywności GEF dominowałby nielegalny handel, usuwając Rac1 z tych regionów. Jednakże, gdy Rac1 jest dostarczany do regionów komórki, w których aktywność GEF jest wysoka, GEF konkuruje z koroniną-1C, tym samym zarówno aktywując Rac1, jak i zapobiegając usuwaniu Rac1 z tego obszaru za pośrednictwem koroniny-1C. Model idzie dalej, ponieważ działanie GEF powoduje wymianę PKB na GTP, przesuwając równowagę jeszcze bardziej od koroniny-1C. W związku z tym aktywność Rac1 można wyjaśnić wyłącznie w kategoriach konkurencji i względnego pokrewieństwa.
W tym protokole opisujemy metodę porównywania względnych powinowactw różnych partnerów wiążących dla małych GTPaz, używając Rac1 jako przykładu. Stosując podejście oparte na oczyszczonym białku, możliwe jest złożenie łańcucha zdarzeń sygnalizacyjnych przez porównanie par w eksperymencie, w którym związany nukleotyd może być ściśle kontrolowany.

<table><tbody><tr><td>Bugbuster</td><td>Novagen</td><td>70584-3</td><td></td></tr><tr><td>COMPLETE inhibitor proteazy</td><td>Roche</td><td>05 056 489 001</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne glutationu</td><td>Pierce</td><td>88821</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenina, rozgałęziona, średnia Mw ~25,000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>OPIMEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bull Bull</td><td>Serum Life Technologies</td><td>10270-1-6</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>GFP-Trap_A</td><td>Chromotec</td><td>gta-20</td><td></td></tr><tr><td>GDP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7127</td><td>Wysoce niestabilny. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 natychmiast po rekonstrukcji</td></tr><tr><td>GTP&gamma; S</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8634</td><td>Wysoce niestabilny. Porcję i przechowywać w temperaturze -80 natychmiast po ponownym roztworzeniu</td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6429</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFP</td><td>Żywe kolory</td><td>632592</td><td>Stosować w rozcieńczeniu 1/1000</td></tr><tr><td>DyLight 800 sprzężone kozie przeciwciało anty-królicze</td><td>Fisher Scientific</td><td>10733944</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PAK1</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2602S</td><td>Użyj przy rozcieńczeniu 1/1000</td></tr><tr><td>System obrazowania w podczerwieni Odyssey SA</td><td>Li-cor</td><td>9260-11PC</td><td></td></tr></tbody></table>

porównanie powinowactwa białek wiążących gtpazę przy użyciu testów konkurencji

Comparing the Affinity of GTPase-binding Proteins using Competition Assays

W tym protokole demonstrujemy metodę porównywania konkurencji między białkami wiążącymi GTPazę. Takie podejście jest ważne dla określenia zdolności wiązania GTPaz z dwóch powodów: fakt, że wszystkie interakcje obejmują tę samą powierzchnię GTPaz oznacza, że zdarzenia wiązania muszą być rozpatrywane w kontekście konkurentów, a fakt, że związany nukleotyd musi być również kontrolowany, oznacza, że konwencjonalne podejścia, takie jak immunoprecypitacja, są nieodpowiednie dla biochemii GTPazy. Test opiera się na użyciu oczyszczonych białek. Oczyszczony Rac1 unieruchomiony na kulkach jest używany jako białko przynęty i może być załadowany GDP, niehydrolizowaną wersją GTP lub pozostawioną wolną od nukleotydów, dzięki czemu można kontrolować etap sygnalizacji, który ma być badany. Białka wiążące, które mają być badane, są oczyszczane z komórek ssaków, aby umożliwić prawidłowe fałdowanie, za pomocą znacznika GFP. Zastosowanie tego samego znacznika na obu białkach jest ważne, ponieważ nie tylko umożliwia szybkie oczyszczanie i elucję, ale także umożliwia wykrycie obu konkurentów z tym samym przeciwciałem podczas elucji. Oznacza to, że można dokładnie określić względne ilości dwóch związanych białek.

Niniejszy protokół służy do obliczania względnych powinowactw partnerów wiążących dla Rac1, bez konieczności znajomości dokładnego stężenia konkurentów (Rysunek 1). Oznaczanie stężenia białka wprowadza błędy i nie jest wymagane w przypadku analizy konkurencji między cząsteczkami w ścieżce sygnalizacyjnej. Ważne jest jednak, aby oba konkurenty miały takie samo stężenie molowe w roztworach stokowych, co pozwala na obliczenie prostych proporcji podczas dodawania różnych objętości do testu. 40 µl kulek GFP-Trap ma pojemność wiązania ~300 pmol, zatem konfluente kolby 75 cm2 z komórkami o wysokiej ekspresji nasycą kulki, w efekcie czego preparaty dwóch różnych białek wiążących będą zbliżone przed korektą (Rysunek 2A). Jeśli jedno z białek wykazuje słabą ekspresję, problem ten można rozwiązać poprzez oczyszczenie tego białka z większej liczby kolb z komórkami.
Wiązanie większości efektorów i regulatorów GTPaz zależy od stanu załadowania nukleotydu w GTPazie będącej przynętą, dlatego ważne jest sprawdzenie, czy załadowanie przebiegło pomyślnie. Załadowanie można zweryfikować poprzez wytrącanie znanych białek wiążących z lizatów komórkowych. Białka efektorowe, takie jak PAK1, wiążą się z GTP-Rac1 i mogą być łatwo wytrącane z lizatów oraz wykrywane za pomocą metody Western blotting 8 (Ryc. 2B). GEF wiążą się preferencyjnie z GTPazą pozbawioną nukleotydu, aby ustabilizować stan przejściowy. Ponieważ GEF występują w niskim stężeniu, są zazwyczaj nieaktywne i często słabo widoczne w analizie blot, lepiej jest nadekspresować GEF lub fragment GEF w celu przetestowania GTPazy pozbawionej nukleotydu. Często stosujemy pierwszą domenę homologii Dbl białka Trio, ekspresowaną jako fuzja z GFP (GFP-TrioD1 9) (Ryc. 2B), jednak każdy GEF będzie odpowiedni. Białka wiążące się z GTPazą załadowaną GDP są rzadsze. Niedawno zgłosiliśmy RCC2 jako jedno z takich białek 7, a załadowanie GDP można również potwierdzić po prostu brakiem wiązania zarówno z GEF, jak i z efektorem.
Wynikiem eksperymentu będzie western blot przedstawiający dwa partnery wiążące z etykietą GFP, związane z GTPazą. Dzięki zastosowaniu jednego przeciwciała do wykrywania obu białek można określić stężenia, przy których wiążą się podobne ilości obu konkurentów, a tym samym wywnioskować ich względne powinowactwa. W tym przykładzie zaprezentowano konkurencję między domeną śmigłową białka transportującego Rac1, koroniną-1C (białko wiążące Rac1 A), a białkiem sekwestrującym Rac1, RCC2 (białko wiążące Rac1 B) (Rysunek 3A). Stosując stałą objętość domeny śmigłowej koroniny-1C (5 µl) i dodając zwiększające się objętości RCC2, z blotu GFP można zauważyć, że stan równowagi zostaje osiągnięty przy 1,25-2,5 µl RCC2 (gwiazdka), co dowodzi, że RCC2 wykazuje silniejsze powinowactwo do Rac1 niż koronina-1C. Poprzez pomiar intensywności prążków za pomocą ilościowego western blottingu i wykreślenie średnich wartości dla każdego konkurenta, punkt równowagi można dokładnie obliczyć, identyfikując objętości, przy których krzywe się przecinają (Rysunek 3B).
Jedną z możliwych przeszkód w pomyślnym przeprowadzeniu testu konkurencji jest sytuacja, w której partnerzy wiążący wiążą się ze sobą nawzajem, a nie tylko z Rac1. Na Ryc. 3A+B demonstrujemy konkurencję między RCC2 a domeną śmigłową koroniny-1C, a nie pełnowymiarową koroniną-1C. Powodem zastosowania skróconej koroniny jest fakt, że koronina-1C wiąże również RCC2 poprzez domenę ogona. Podczas miareczkowania pełnowymiarowej koroniny-1C przeciwko RCC2 wykrywane jest wiązanie obu białek z powodu tworzenia kompleksu trójskładnikowego, a nie konkurencji (Ryc. 3C). Jeśli zachodzi konkurencja, wiązanie jednego białka będzie wzrastać, podczas gdy drugiego będzie maleć, a całkowita ilość związanej fuzji z GFP pozostanie stała. W przypadkach, gdy tworzy się kompleks trójskładnikowy, konieczne jest skrócenie jednego z białek wiążących GTPazę, aby konkurenci przestali ze sobą oddziaływać.
<img alt="Schemat oczyszczania białek; GFP-Trap, ładowanie nukleotydów, miareczkowanie, Western blot, kompleks Rac1." src="/files/ftp_upload/53254/53254fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przebieg pracy. Schematyczna reprezentacja etapów pracy w celu określenia powinowactwa białek wiążących GTPazy z wykorzystaniem testów konkurencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53254/53254fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza Western blot oddziaływań białek GFP; wyniki eksperymentu pokazujące dane dotyczące intensywności wiązania." src="/files/ftp_upload/53254/53254fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Walidacja oczyszczonych białek. (A) Oczyszczone białka wiążące Rac1 z tagiem GFP przeanalizowane metodą Western blot z użyciem przeciwciał anty-GFP w celu określenia względnej wydajności obu białek. Tego rodzaju wyrównanie podczas eksperymentu pozwala na dostosowanie stężeń obu białek tak, aby były one zgodne w eksperymencie wiązania. (B) GST-Rac1 załadowany z GDP, GTPγS lub bez nukleotydu inkubowano z lizatem z komórek HEK293T ekspresyjnych dla GFP-TrioD1, a białka wiążące wykryto poprzez analizę endogennego PAK1 lub nadekspresyjnego GFP-TrioD1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53254/53254fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wiązania białek znakowanych GFP; immunoblot, wykres; badanie interakcji GFP-RCC2, GFP-Coro1C." src="/files/ftp_upload/53254/53254fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Analiza Western blot względnego wiązania białek. Przykładowe wyniki testów wiązania konkurencyjnego. (A) Rac1 obciążony GDP zmieszano z 5 µl domeny propeller GFP-koroniny-1C i miareczkowano zwiększającymi się objętościami GFP-RCC2. Dzięki zastosowaniu Western blottingu w celu detekcji białek związanych z GFP uniknięto problemów z różnicami w detekcji dwóch białek, a sygnał GFP odzwierciedla stosunek molowy między dwoma białkami fuzyjnymi. Gwiazdki wskazują stosunki konkurencji po obu stronach punktu równowagi. (B) Intensywności prążków związanych białek fuzyjnych GFP z trzech niezależnych eksperymentów zmierzono za pomocą ilościowego Western blottingu przy użyciu przeciwciał wtórnych sprzężonych z fluorophorem, a średnie wartości naniesiono na wykres w celu obliczenia ilości RCC2 potrzebnej do osiągnięcia równowagi. (C) Przykładowy wynik eksperymentu, w którym białka wiążące Rac1 wiążą się ze sobą i tworzą kompleks trójskładnikowy zamiast konkurować. Rac1 obciążony GDP zmieszano z 5 µl GFP-RCC2 i miareczkowano zwiększającymi się objętościami pełnowymiarowej GFP-koroniny-1C. Wzrost ilości związanej GFP-koroniny-1C bez utraty związanej GFP-RCC2 wskazuje na tworzenie kompleksu trójskładnikowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53254/53254fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół porównuje względne pokrewieństwo partnerów wiążących dla GTPaz rodziny Rho, w tym Rac1. In vivo białka wiążące Rac1 konkurują o pojedynczy interfejs wiążący, którego konformacja jest podyktowana przez związany nukleotyd. Nukleotyd jest zarówno ważny, jak i trudny do kontrolowania eksperymentalnie ze względu na wysoką szybkość hydrolizy.

Porównanie powinowactwa białek wiążących GTPazę przy użyciu testów konkurencji

In this protocol we demonstrate a method for comparing the competition between GTPase-binding proteins. Such an approach is important for determining the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest porównanie względnych powinowactw białkowych partnerów wiążących dla białek GTPazy z rodziny Row w ściśle kontrolowanych warunkach ładowania nukleotydów. Osiąga się to poprzez uprzednie oczyszczenie domniemanych konkurencyjnych partnerów wiążących, z których każdy jest znakowany tym samym tagiem, na przykład zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Drugim krokiem jest oczyszczenie interesującej nas GTPazy.Na przykład, należy przeprowadzić reakcję RAC 1 i załadować odpowiedni nukleotyd, aby uzyskać pożądany stan sygnalizacji GTPase. Następnie GTPase załadowany nukleotydem inkubuje się ze stałą ilością jednego konkurenta wiązania i rosnącymi ilościami drugiego konkurenta wiązania w celu uzyskania krzywej miareczkowania wiązania. Ostatnim krokiem jest rozdzielenie białek związanych z unieruchomioną GTPase za pomocą western blot i odszukiwanie na membranie znacznika GFP, który jest wspólny dla obu partnerów wiązania.Ostatecznie analiza Western blot jest wykorzystywana do określenia względnych stężeń, przy których podobne ilości każdego partnera wiążącego z etykietą GFP są wychwytywane przez GTPazę. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ko-precypitacja, jest fakt, że właściwości wiązania białek GTPazy są determinowane przez związany w komórce nukleotyd. Związany nukleotyd jest labilny, co utrudnia interpretację danych dotyczących wiązania białek.Procedurę tę należy rozpocząć od oczyszczania białka G tpa z tagiem GST oraz ekspresji białek wiążących gtpa, zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Kolby z transfektowanymi komórkami należy przepłukać solą fosforanową (PBS), a następnie odstawić kolbę na pięć minut do spłynięcia płynu. Po odessaniu wolnego płynu, komórki należy zdrapać do probówki do mikrowirówki w 500 µL buforu lizującego, a następnie mieszać komórki w celu ich lizy poprzez odwracanie probówki w temperaturze 4 °C przez 30 minut.Podczas etapu przemywania lizatu, ziarna GFP trap należy przemyć trzykrotnie dwiema porcjami po 40 µL świeżego buforu do lizy. Po każdym przemywaniu ziarna należy osadzić przez wirowanie przy 2 700 ×g przez dwie minuty. Po zakończeniu lizy, lizaty należy sklarować poprzez wirowanie przy 21 000 ×g przez 10 minut.Przenieś oczyszczony lizat każdego z białek konkurencyjnych na oddzielne, przemyte kulki GFP trap. Pozostaw białka fuzyjne GFP do związania na dwie godziny, mieszając przez odwracanie w temperaturze 4°C. Przemyj załadowane kulki GFP trap dwukrotnie w buforze do lizy i dwukrotnie w buforze do konkurencji.Bufor wiążący osadza kuleczki przy 2 700 ×g przez dwie minuty pomiędzy kolejnymi etapami przemywania. Eluuj białka fuzyjne GFP, dodając 40 µL 0,2 M glicyny i pipetując w górę i w dół przez 30 sekund; następnie natychmiast osadź kuleczki przy 21 000 ×g przez 60 sekund i przelej ciecz do nowej probówki wirówkowej zawierającej 4 µL 1 M Tris-HCl. Wykonaj ten krok szybko, aby ograniczyć uszkodzenia oczyszczonego białka. Przeanalizuj 1 µL każdego oczyszczonego białka metodą western blot, używając przeciwciała anty-GFP w celu określenia względnej wydajności z wykorzystaniem ilościowego systemu blottingowego zgodnie z protokołem producenta.Wyrównaj molowe stężenie białka poprzez dodanie buforu wiązania konkurencyjnego. Pobierz 90 µL przygotowanych kulek GST rack one i przemyj je trzykrotnie buforem do ładowania nukleotydów, używając magnetycznego separatora cząstek w celu wytrącenia kulek na każdym etapie. Odsącz bufor z kulek i dodaj 100 µL buforu do ładowania nukleotydów, w zależności od tego, czy wymagane jest ładowanie GDP, GTP czy brak nukleotydów.W celu przeprowadzenia eksperymentu konkurencyjnego, do 60 µL kulek GST rack one w kontrolach ładowania nukleotydów należy dodać 12 µL 100 mM GDP, 12 µL 10 mM GTP gamma S lub nie dodawać nukleotydu. Pozostałe kulki należy podzielić na trzy alikwoty po 10 µL, a do każdej probówki dodać 2 µL 100 mM GDP, 2 µL 10 mM GTP gamma S lub nie dodawać nukleotydu. Mieszaniny z kulkami należy inkubować przez 30 minut w temperaturze 30 °C przy jednoczesnym mieszaniu.W celu przeprowadzenia wiązania konkurencyjnego należy ustabilizować rak związany z nukleotydami poprzez dodanie chlorku magnezu w stężeniu 1 M do mieszanin eksperymentalnych i kontrolnych. Przygotować sześć probówek do wirówki, z których każda powinna zawierać 200 µL buforu do wiązania konkurencyjnego.Każda probówka powinna zawierać również 10 µL racka z załadowanymi nukleotydami, jeden koralik oraz pięć µL racka. Jako stałe białko wiążące do każdej probówki należy dodać białko wiążące A, a jako zmienne białko wiążące dodać 0, 1, 2, 0,55, 10 lub 20 µL białka wiążącego B. Objętości te zakładają w przybliżeniu równe stężenia roztworów zapasowych stałego i zmiennego białka wiążącego i mogą wymagać korekty.Dopełnić całkowitą objętość mieszaniny wiążącej do 235 µL poprzez dodanie buforu do wiązania konkurencyjnego. Następnie przygotować probówkę do mikrocentryfugi zawierającą 200 µL buforu konkurencyjnego, 10 µL eksperymentalnego nukleotydu załadowanego na rack 1, kulki oraz 10 µL białka A z racku 1. Następnie przygotować probówki kontrolne z GDP, GTPγS oraz bez nukleotydów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Inkubować probówki przez dwie godziny, mieszając przez odwracanie, a następnie pozostawić w temperaturze 4 °C po inkubacji. Przemyć kuleczki trzykrotnie buforem do wiązania konkurencyjnego. Na konieceluować związane białka w 20 µL redukującego buforu do próbek.Ilościowy western blotting znacznika GFP oczyszczonego białka GFP RCC two oraz GFP Corona in one C.Propeller domain wykazuje, że białko w górnym prążku, GFP RCC two, jest 1,4 raza bardziej obfite niż białko w dolnym prążku i powinno zostać rozcieńczone w celu uzyskania molowego stosunku jeden do jednego dla eksperymentu konkurencji. Eksperyment kontrolny wykazuje, że status załadowania nukleotydów rack one determinuje specyficzność wiązania poprzez miareczkowanie zwiększających się objętości GFP RCC two przeciwko stałej objętości ekimolarny GFP Corona in one C propeller domain i przeprowadzenie blottingu. Białka wiążące się z rack one pozwalają na wizualizację względnej zmiany ilości związanego białka; naniesienie intensywności prążków GFP dla obu konkurentów na tym samym wykresie i zidentyfikowanie punktu przecięcia linii pozwala określić objętość zmiennego białka wiążącego w stanie równowagi.Należy jednak zachować ostrożność, aby kwestie takie jak oddziaływania między konkurentami lub nadmiar przynęty gtpa nie zakłóciły przebiegu eksperymentu. Wzrost ilości jednego konkurenta bez jednoczesnego spadku ilości drugiego, jak pokazano tutaj, wskazuje na problem podczas wykonywania tej procedury. Ważne jest, aby pamiętać o sprawdzeniu, czy między obfitością konkurujących partnerów wiążących zachodzi relacja odwrotna.Istnieje szereg problemów, które mogą zniekształcić wyniki i które można rozwiązać, o ile zostaną one zidentyfikowane podczas analizy danych.

comparing-affinity-gtpase-binding-proteins-using-competition

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda przedstawiona w niniejszej publikacji opisuje test służący do monitorowania aktywacji specyficznych dla RhoA czynników wymiany GDP/GTP (GEFs) w hodowlach komórkowych, z wykorzystaniem zmutowanego białka fuzyjnego RhoA GST, które wykazuje wysokie powinowactwo do aktywowanych GEFs. Białka GEFs są wytrącane z lizatów komórkowych, wykrywane za pomocą techniki Western blotting i ilościowo oznaczane metodą densytometrii.

Wytrącanie powinowactwa aktywnych czynników GEF białka Rho z wykorzystaniem białka Rho z mutacją z tagiem GST (GST-RhoA(G17A)) z lizatów komórek nabłonkowych

Ten film demonstruje test konkursowy do badania partnerów białkowych wiążących GTPazę. Wykorzystując białko GTPazy związane z nukleotydami unieruchomione na kulkach magnetycznych, można badać konkurencyjne wiązanie między dwoma oddziałującymi partnerami białkowymi dla tego samego miejsca wiązania na GTPazie w celu oceny powinowactwa wiązania partnerów białkowych.

Test wiązania konkurencji w celu zbadania konkurujących partnerów białkowych wiążących GTPazę

Różnicowa fluorymetria skaningowa jest powszechnie stosowaną metodą badania bibliotek małych cząsteczek pod kątem interakcji z białkami. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę rozszerzenia tych analiz w celu oszacowania stałej dysocjacji między małą cząsteczką a jej białkiem partnera.

Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Fosforylacja białek jest główną cechą tego, jak komórki interpretują i reagują na informacje w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół badań przesiewowych wykorzystujący kinazy oczyszczone z komórek ssaków w celu szybkiej identyfikacji kinaz, które fosforylują substrat (substraty) będący przedmiotem zainteresowania.

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Wiązanie trifosforanu guanozyny (GTP) jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR). Protokół ten opisuje, jak farmakologicznie scharakteryzować specyficzne interakcje GPCR-ligand poprzez monitorowanie wiązania znakowanego radioaktywnie analogu GTP, [35S]guanozyno-5'-O-(3-tio)trifosforanu ([35S]GTPγS), w odpowiedzi na interesujący ligand.

Pomiar sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G poprzez znakowane radioaktywnie wiązanie GTP

Ten protokół opisuje metodę testowania zdolności białka do współosadzania z nitkowatą aktyną (F-aktyną) i, jeśli zaobserwowano wiązanie, do pomiaru powinowactwa interakcji.

Pomiar wiązania białek z F-aktyną przez kosedymentację

Tutaj opisujemy protokół do badania prenylacji i obciążenia guanozyno-5'-trifosforanu (GTP) GTPazy Rho. Protokół ten składa się z dwóch szczegółowych metod, a mianowicie frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentu sprzężonego z GTPazą. Protokół może być używany do pomiaru prenylacji i obciążenia GTP różnych innych małych GTPaz.

Wykrywanie prenylacji małej GTPazy i wiązania GTP za pomocą frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentowego sprzężonego z GTPazą

Test ATPazy sprzężony z dinukleotydem nikotynamidoadeninowym (NADH) został dostosowany do półwysokoprzepustowych badań przesiewowych małocząsteczkowych inhibitorów miozyny. Ten test kinetyczny jest przeprowadzany w 384-dołkowym formacie mikropłytki, przy całkowitej objętości reakcji wynoszącej zaledwie 20 μl na dołek. Platforma powinna mieć zastosowanie do praktycznie każdego enzymu wytwarzającego ADP.

Adaptacja półwysokoprzepustowa testu ATPazy sprzężonej z NADH do badań przesiewowych inhibitorów małocząsteczkowych

Biorąc pod uwagę, że GPCR są atrakcyjnymi celami dla leków, badania przesiewowe ligandów GPCR są niezbędne do identyfikacji związków ołowiowych i badań nad desierotyzacją. W ramach tych wysiłków opisujemy PRESTO-Tango, platformę zasobów typu open source wykorzystywaną do jednoczesnego profilowania przejściowej rekrutacji β-arrestin2 przy około 300 GPCR przy użyciu testu reporterowego opartego na TEV.

Równoległe przesłuchanie rekrutacji β-Arrestin2 do badań przesiewowych ligandów w skali GPCR przy użyciu testu PRESTO-Tango

Różnicowe promieniste działanie kapilarne testu ligandowego (DRaCALA) może być wykorzystane do identyfikacji małych białek wiążących ligand organizmu za pomocą biblioteki ORFeome.

Identyfikacja białek wiążących małe ligandy za pomocą zróżnicowanego promieniowego działania kapilarnego testu ligandowego (DRaCALA)

Protokół ten opisuje wykorzystanie biosensorów opartych na BRET do pomiaru aktywacji białka G w czasie rzeczywistym w żywych komórkach HEK293 po stymulacji ligandów sprzężonych z białkiem G. Tutaj receptor β2-adrenergiczny oraz receptor kannabinoidowy typu 1 służą jako przykłady do wykazania efektywności czujników dla kilku podtypów białek G oraz w różnych GPCR.

Biosensory białka G oparte na BRET do pomiaru aktywności receptorów sprzężonych z białkiem G w komórkach żywych

Poznaj metodę porównywania powinowactwa białek wiążących GTPazę Rac1 przy kontrolowanym ładowaniu nukleotydów. Protokół obejmuje oczyszczanie białek znakowanych GFP i analizę Western blot.

Porównanie powinowactwa białek wiążących GTPazę przy użyciu testów konkurencji

Przeglądaj więcej filmów