Mikroczipy krzemowe do manipulowania interakcją komórka-komórka

Cześć, nazywam się Elliot Hu.Jestem doktorem habilitowanym w laboratorium Tii w Massachusetts Institute of Technology. Dzisiaj zamierzamy przygotować hodowle komórkowe na krzemowych mikro chipach mechanicznych. Urządzenia wyglądają jak małe grzebienie, które łączą się ze sobą i pozwalają nam precyzyjnie manipulować interakcjami między dwiema różnymi populacjami komórek.

Dzisiaj będziemy badać interakcję między hepatocytami wątroby a podporowymi komórkami zrębu. W szczególności trzy komórki fibroblastów T trzy są hodowane na górnej powierzchni grzebieni, dzięki czemu przesuwając palce grzebienia, można przesuwać komórki i zmieniać ich układ przestrzenny. Każde urządzenie jest podzielone na dwie części, które łączą się ze sobą w dwóch możliwych konfiguracjach.

Pierwszy z nich sprawia, że dwie populacje komórek stykają się ze sobą. Drugi nieznacznie oddziela dwie populacje, aby komórki nie mogły się stykać. W tym przypadku interakcje kontaktowe są zapobieżone, ale interakcje poprzez wydzielane czynniki są zachowane.

Zacznijmy od rozmowy o tym, jak obchodzić się z częściami za pomocą pęsety. Lubię używać zarówno większej pęsety teflonowej, jak i mniejszej pęsety metalowej z okrągłą końcówką. Za pomocą większej pęsety możesz podnosić części na krawędziach w ten sposób, przy większych częściach za pomocą ramion, musisz uważać, aby nie złamać ramion, ponieważ są one bardzo delikatne.

Więc chcesz je podnieść z tyłu części w ten sposób. Za pomocą metalowej pęsety możesz sięgnąć do otworu i bezpośrednio podnieść wióry. Większe części zmieszczą się w ścianie płytki 12-dołkowej, podczas gdy mniejsze części zmieszczą się w płytce 24-dołkowej lub można je sparować z większą częścią.

W płytce 12-dołkowej zwykle używam metalowej pęsety. Kiedy dotykam części w płytach, aby zatrzasnąć dwie części razem, zwykle najpierw wkładam większą część do studni i popycham ją całkowicie na bok. Następnie biorę bezpłatną naprawę i kładę ją po drugiej stronie studni i ściskam je razem, biorąc dwie pęsety po jednej do każdego otworu.

Więc teraz mogę po prostu zablokować części razem, albo w konfiguracji szczeliny, albo w konfiguracji styku. Jeśli chcę rozebrać części, lubię pociągnąć części do konfiguracji szczeliny, a następnie pociągnąć pionowo Aby wyjąć część. Teraz urządzenia są wykonane z krzemu, więc muszą być pokryte, aby umożliwić prawidłowe przyleganie komórek.

Prawdopodobnie otrzymasz urządzenia już pokryte polistyrenem i poddane obróbce plazmowej, więc zakładamy, że to jest nasz punkt wyjścia. Przede wszystkim użyjemy kolagenu do pokrycia powierzchni, do której przyczepią się hepatocyty. Umieścimy grzebienie hepatocytów w kolagenie o objętości 50 mikrogramów na promil, jednym roztworze i inkubujemy w temperaturze 37 C przez 45 minut.

Z kolei grzebienie fibroblastowe nie musimy pokrywać. Po inkubacji odsysamy roztwór kolagenu i myjemy oraz podlewamy. Teraz zamierzamy połączyć ES w kontakcie z uzupełniającymi częściami, aby utworzyć płaską powierzchnię do wysiewu komórek.

Najpierw napełnimy kilka studni 70% etanolem. Włożę parę do każdej studzienki, a następnie zamknę je razem. Po połączeniu ze sobą chcemy przyjrzeć się częściom pod mikroskopem, aby upewnić się, że są współpłaszczyznowe.

Od czasu do czasu części mogą się ze sobą zablokować niewspółosiowo. Na mikroskopie zobaczysz, że znajdują się na dwóch różnych płaszczyznach ogniskowych. W takim przypadku po prostu oddziel części i dociśnij je z powrotem do siebie Po sprawdzeniu, czy wyrównanie jest prawidłowe, pozostawiamy części na chwilę w etanolu do sterylizacji.

Często się spieszę, więc po prostu moczu przez 10 minut. Po sterylizacji musimy spłukać. Etanol dokładnie zassać i przemyć w wodzie, następnie zassać i ponownie umyć w wodzie, a na koniec zassać wodę i zastąpić pożywką hodowlaną.

Teraz przenieśmy komórki nasienne na urządzenia. Zazwyczaj zawieszamy komórki w stężeniu 500 000 komórek na mililitr i pipetujemy jedną mililitrową zawiesinę na każdą parę grzebieni za pomocą płytki 12-dołkowej. Wysialiśmy więc fibroblasty w ilości 500 000 komórek na mililitr w dwóch studzienkach.

Podobnie, pobraliśmy zawiesinę 500 000 hepatocytów na studzienkę i wysialiśmy je w pozostałych dwóch studzienkach. Teraz, przed inkubacją, dokładnie wstrząsniemy komórkami, aby upewnić się, że są równomiernie rozłożone. Lubię potrząsnąć trzy razy w pionie, trzy razy w poziomie, a potem powtórzyć to trzy razy.

Po wstrząśnięciu umieścimy go w inkubatorze i pozostawimy komórki na 15 minut, po czym ponownie je wstrząśniemy. Po potrząsaniu co 15 minut przez godzinę, odsysamy zawiesinę komórek i bawimy się nową zawiesiną komórek. Będziemy to powtarzać, aż uzyskamy zlewającą się warstwę komórek.

Zazwyczaj w przypadku fibroblastów zajmuje jedno lub dwa miejsca. A w przypadku hepatocytów może to zająć od dwóch do czterech miejsc. Aby uzyskać zlewającą się monowarstwę, komórki są osadzone w dość dużej gęstości, drżenie zapewnia równomierne rozłożenie komórek.

Po pierwszym osadzeniu tworzy się rzadka warstwa komórek. Zauważ, że komórki przyczepiają się tylko do palców, które zostały pokryte polistyrenem i kolagenem. Po wysianiu świeżych komórek i inkubacji przez kolejną godzinę, ponownie z potrząsaniem co 15 minut, warstwa komórkowa staje się gęstsza.

Po trzecim wysiewie mamy dobrą gęstość komórek, a teraz możemy zatrzymać się po tym, jak komórki zostaną wysiane na plastrach. Chcemy manipulować komórkami w pożądanej konfiguracji eksperymentalnej. Urządzenia są teraz oddzielane od ich uzupełniających się części i inkubowane przez 24 godziny.

Po 24 godzinach komórki rozprzestrzeniły się, tworząc zlewającą się monowarstwę na powierzchni grzebieni. Teraz chcemy stworzyć wspólną kulturę. Grzebień hepatocytów i grzebień fibroblastów są teraz przenoszone do tej samej studzienki i blokowane razem w pożądanej konfiguracji początkowej.

W razie potrzeby. Po pewnym czasie możesz zmienić konfigurację. Na przykład możemy przejść do konfiguracji szczeliny po 18 godzinach, części są umieszczane w tym samym, dobrze dociskane do siebie, aż do osiągnięcia konfiguracji szczeliny, a następnie wpychane z powrotem w kontakt do konfiguracji szczeliny.

A teraz zamierzamy usunąć jeden grzebień. To, co teraz zrobimy, to przejdziemy przez proces zdejmowania starej powłoki z polistyrenu, czyszczenia wiórów, a następnie nałożenia nowej powłoki polistyrenowej i przygotowania jej do hodowli komórkowej. Ponownie, usuwając starą powłokę polistyrenową i nakładając nową warstwę, zapewniamy, że żadna część historii poprzedniego eksperymentu nie będzie kolidować z nowym eksperymentem.

Więc po zakończeniu eksperymentu pierwszą rzeczą, którą chcesz zrobić, to wybielić komórki, a następnie spłukać grzebienie i wodę. Dlatego zanim włożysz frytki do palca, upewnij się, że są całkowicie suche. Więc tutaj mamy kilka grzebieni, które właśnie zostawiłem do wyschnięcia na chwilę na powietrzu i sprawdzenia, czy są całkowicie suche.

A więc teraz weźmiemy trochę palców u nóg i włożymy go do tego szklanego głośnika. Użyjemy tutaj szklanej pipety, aby jej nie rozpuścić. Halloween rozpuszcza plastik, więc nie możemy użyć typowej pipety do styropianu.

Dobra, to w zasadzie tyle. A teraz po prostu weźmiemy kilka tych części, umieścimy je w palcach, a ja włączę shaker, aby zamieszał i przykryjemy go folią aluminiową, aby toluen nie parował. Tak więc po dwóch godzinach toluen powinien rozpuścić większość polistyrenu na grzebieniach, a my możemy je po prostu wyciągnąć i wysuszyć grzebienie na powietrzu.

Po spłukaniu na Halloween części powinny być stosunkowo wolne od polistyrenu i powinny być stosunkowo czyste. Potrzebujemy jednak, aby części były wyjątkowo czyste, aby nowa warstwa polistyrenu miała dobrą przyczepność, jeśli nie są one wyjątkowo czyste. Poli ty ma tendencję do odklejania się w środku eksperymentu, gdy komórki zaczynają go ciągnąć.

Więc to, co teraz zrobimy, to oczyszczenie kwasem piranii. Włożyłem części do szklanego głośnika i zamierzamy to podgrzać. Więc położymy się na gorącym talerzu.

A tutaj mamy kwas siarkowy i nadtlenek wodoru. Najpierw wleję kwas siarkowy, a tutaj upewnij się, że wszystkie wióry są zanurzone pod płynem. Czasami mają tendencję do unoszenia się na wodzie.

A także teraz, gdy pracujemy z dość chemikaliami, upewnij się, że nosisz odpowiedni sprzęt ochronny. Tu. Mam na sobie rękawiczki nitrylowe. Teraz wlejemy nadtlenek wodoru do kwasu i po prostu uważaj, ponieważ jest to reakcja egzotermiczna.

Widać więc, że trochę pali w reakcji, ale chcemy dodać trochę energii do systemu, aby był jeszcze bardziej reaktywny. Więc teraz podgrzejemy go do 120 stopni Celsjusza około 20 teraz, więc możesz mieć pewność, że wszelkie pozostałości twojej hodowli komórkowej zostaną całkowicie usunięte z twoich chipsów. Więc w tym momencie chcesz po prostu pozwolić, aby reakcja przebiegała w pełnym biegu, aż cały nadtlenek wodoru zostanie zużyty.

I w tym momencie mieszanina przestanie bulgotać. Tak więc reakcja trwa około pół godziny, aby przebiegać. A kiedy przestaniesz widzieć bąbelki, możesz po prostu wyłączyć płytę grzejną i pozwolić jej ostygnąć.

I zamierzamy przenieść je do wody o krzywej BAK. I po raz kolejny upewnij się, że używasz tutaj pęsety teflonowej, a nie metalowej, i możesz je po prostu podnieść, przenieść. Więc teraz po prostu opłuczemy go pod stałym strumieniem DDH dwa O.I zwykle biorę go prosto z Meine i zostawimy go włączonego przez co najmniej 10 minut tutaj.

A robiąc to, zmyjemy wszystkie ślady kwasu po zmieleniu pod strumieniem wody przez 10 minut. Kwas powinien zostać ponownie usunięty z wiórów, a my zamierzamy po prostu przechowywać je pod wodą do czasu, gdy będziemy gotowi do pokrycia polistyrenu o masie cząsteczkowej 45 000 polistyrenu, który otrzymaliśmy od Sigmy. I zamierzamy zważyć tutaj niewielką jego ilość.

Mamy 400 miligramów i zamierzamy rozpuścić go w toluenie w ilości 100 miligramów na mililitr. Tak więc toluen musi być obsługiwany w masce. Inną rzeczą jest to, że ponieważ zamierzamy użyć toluenu do rozpuszczenia polistyrenu, chcemy mieć pewność, że nie używamy żadnej odzieży laboratoryjnej wykonanej z polistyrenu.

Więc tutaj używamy pipety polipropylenowej, stożkowej i szklanej. Więc ponieważ mam 400 miligramów polistyrenu, zamierzam dodać cztery mililitry palcowania, a teraz będziemy go wirować przez pół godziny, aż polistyrin się rozpuści. Więc teraz po prostu będziemy wirować rurką z najniższą prędkością przez około 20 minut do pół godziny.

Zamierzam więc przymocować rurkę do wirów. Nie muszę go tam trzymać przez cały czas. Po 20 do 30 minutach styropian powinien się rozpuścić i jesteśmy gotowi do jego powlekania.

Teraz zamierzamy pokryć styropian powłoką wirową w naszym zakładzie. Nasz koder spinowy znajduje się w pomieszczeniu czystym. I tak tutaj musimy nosić czapkę, gogle, fartuch, botki i rękawiczki, ale to może nie być to samo w twoim obiekcie.

Zanim użyjemy tego uchwytu, chcę go zabezpieczyć przed styropianem. Więc przykryjemy go folią aluminiową i chcemy, aby było to jak najbardziej płaskie do powierzchni, aby chip mógł przylegać równo do powierzchni. Zamierzamy zrobić mały otwór w samym środku, abyśmy mogli utrzymać próżnię na chipie.

Koder wirowania jest ustawiony na 2, 400 obr./min i 30 sekund. Teraz możemy wziąć jeden z naszych chipsów, umieścić go tak, aby środek wióra zakrywał otwór, a ja najpierw wyłączę próżnię, gdy założę polistyren, włączę odkurzacz, a następnie zacznę wirować. Tak więc w przypadku mniejszych części możemy odłożyć tylko mniej niż 10 kropli.

A w przypadku większych części potrzeba nieco ponad 10 kropli polistyrenu. Będziemy kręcić nim przez 30 sekund z prędkością 2 400 obr./min. Teraz weźmiemy wióry pokryte polistyrenem i włożymy je do piekarnika w temperaturze 120 stopni C. To powyżej punktu przejścia szkła polistyrenu.

Tak więc powierzchnia zostanie ponownie rozlana, aby ją trochę wygładzić, a także zagęści i utwardzi plastik. Więc zwykle zostawiam go w piekarniku na noc. Prawdopodobnie ukończenie procesu zajmie co najmniej kilka godzin.

Tak więc po całonocnym pieczeniu frytki są gotowe do obróbki plazmowej. Teraz wystawimy polistyren na działanie plazmy tlenowej, która zmieni energię powierzchniową tak, że białka i komórki będą się do niego lepiej przyklejać. Więc po prostu załadujemy chipy do komory plazmowej i przepompujemy je do próżni

Dobrym ustawieniem do użycia jest 200 mil, wypróżnia i 200 watów mocy przez minutę pod przepływem tlenu. Teraz, gdy system jest już przepompowany, wprowadzimy tlen. Okej, teraz możemy włączyć zasilanie RF, uderzyć w plazmę na jedną minutę.

Więc kiedy plazma pracuje, faktycznie świeci. Jest jak żarówka fluorescencyjna. Po jednej minucie ekspozycji plazmy zamierzamy przywrócić ciśnienie do atmosfery i możemy wyciągnąć części.

Teraz części są gotowe do powlekania białkiem i karmienia komórek. Celem przy projektowaniu tego urządzenia była możliwość manipulowania mikroarchitekturą tkanki w dynamiczny sposób. Tak więc mikroorganizacja tkanki w organizmie, szczególnie tam, gdzie komórki są umieszczone względem siebie, jest bardzo ważna w określaniu funkcji każdej konkretnej komórki w hodowli laboratoryjnej.

Do niedawna nie byliśmy w stanie wykonać dobrej roboty w odtworzeniu tego, ale w ciągu ostatnich pięciu lub 10 lat ludzie zaczęli być w stanie mikromodelować komórki na podłożu do hodowli tkankowej, umieszczając w ten sposób komórki dokładnie tam, gdzie chcemy je mieć na płytce do hodowli tkankowej. W ten sposób udało nam się odkryć kilka ważnych aspektów podstawowej biologii interakcji między komórkami w skali mikro. To, czego do tej pory nie byliśmy w stanie zrobić, to robić to dynamicznie.

Ma to na celu zmianę organizacji hodowli komórkowej w trakcie eksperymentu. Jest to ważne, ponieważ w organizmie tkanka nie jest w rzeczywistości statycznym środowiskiem. Mamy komórki, które poruszają się i reorganizują, szczególnie w procesie gojenia się ran lub rozwoju.

Ale nawet w normalnym narządzie w homeostazie jest wiele rzeczy, które się poruszają. Najtrudniejszym aspektem technicznym do nauczenia się jest to, jak fizycznie jeść części. Początkowo, gdy zaczynasz pracę z systemem, możesz być onieśmielony tym, jak delikatne są części lub jak małe są emocje, które musisz wywołać.

Myślę jednak, że jeśli tylko poćwiczysz z tym przez chwilę, nie powinieneś mieć zbyt wielu problemów. W niektórych miejscach, w których widzimy, że to urządzenie odgrywa rolę, na przykład w rozwoju embrionalnym, komórki będą miały kontakt z szeregiem różnych środowisk komórkowych, gdy komórki pączkują przez różne warstwy embrionalne. Wiadomo też, że interakcje z każdą z warstw, gdy stykają się one sekwencyjnie, popychają nas wszystkich dalej na określoną ścieżkę różnicowania.

Uważamy więc, że tego typu urządzenie może być dobre do próby odtworzenia tego typu zdarzenia w laboratorium. Jednym z aspektów mikroorganizacji, któremu szczególnie chcieliśmy się przyjrzeć, była różnica między komórkami komunikującymi się poprzez interakcje kontaktowe, w których błony komórkowe mogą stykać się ze sobą, a rozpuszczalnymi czynnikami, które są wydzielane do otaczających mediów, które dyfundują do komórki znajdującej się nieco dalej. I wiele razy, gdy komórki są w kokulturze i mają na siebie wpływ, nie jest jasne, czy są to interakcje kontaktowe, czy wydzielane czynniki, które odgrywają rolę.