Name: Prosta i skuteczna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych dorosłych komórek wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj prostą metodę izolacji makrofagów z pierwotnych kultur komórek wątroby szczura. Technika opiera się na perfuzji kolagenazowej, wstrząsaniu kolbami i selektywnym przyleganiu do naczyń plastikowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta została sfinansowana z grantu badawczego oraz dotacji z Projektu Nanotechnologii Żywności Ministerstwa Rolnictwa, Leśnictwa i Rybołówstwa Japonii.

1. Perfuzja wątroby
<ol>
 <li>Zpodaj dorosłemu samcowi szczura linii Sprague-Dawley (w wieku od 10 do 15 tygodni; masa ciała 150–20 g) znieczulenie poprzez doszpikowe wstrzyknięcie roztworu pentobarbalku sodu (50 mg pentobarbitalu sodu / kg masy ciała).</li>
 <li>Umieść zwierzę w stalowej kuwecie i spryskaj jego brzuch oraz klatkę piersiową 70% etanolem.</li>
 <li>Należy wykonać niewielkie nacięcie i odsunąć skórę. Następnie, za pomocą nożyczek, należy rozciąć jamę brzuszną wzdłuż wykonanego nacięcia.</li>
 <li>Potwierdź położenie żyły wrotnej, przełóż nitkę chirurgiczną pod żyłę wrotną i zawiąż ją luźnym węzłem.</li>
 <li>Zaciśnij dystalną część żyły głównej dolnej oraz żyły krezkowej, aby zapobiec cofaniu się krwi do wątroby. Otwórz jamę klatki piersiowej, przecinając przeponę nożyczkami, i odsłoń serce.</li>
 <li>Wprowadź plastikowy cewnik (o średnicy 2 mm) do żyły wrotnej i mocno zaciśnij nić wokół cewnika.</li>
 <li>Podłącz cewnik do systemu perfuzyjnego wypełnionego roztworem płuczącym (Ca2+-Mg2+wolny od wapnia i magnezu HBSS zawierający 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES i 4,2 mM NaHCO33 ; pH 7,2) uprzednio ogrzany do 37 °C.</li>
 <li>Rozpocząć perfuzję in situ z szybkością 10 ml/min. Jednocześnie należy naciąć ścianę prawego przedsionka. Perfuzję kontynuować przez 10 min.</li>
 <li>Zmień roztwór perfuzyjny na roztwór kolagenazy [HBSS zawierający 10 mM HEPES i 4,2 mM NaHCO3]3 uzupełnione kolagenazą typu I (0,05%) i inhibitorem trypsyny (50 μg/ml); pH 7,5], a następnie perfundować przez 10–20 min z przepływem 10 ml/min, aż wątroba lekko opuchnie i pojawi się oznaka rozpadu struktury wątroby pod błoną surowiczą.</li>
</ol>
2. Przygotowanie frakcji komórkowej wzbogaconej w hepatocyty parenchymalne
<ol>
 <li>Wyjąć i ostrożnie przenieść wątrobę do sterylnego zlewki zawierającej 25 ml roztworu kolagenazy. Rozdrobić na małe kawałki za pomocą nożyczek.</li>
 <li>Do otrzymanej zawiesiny komórkowej dodać 75 ml zimnego MEM. Po delikatnym pipetowaniu przefiltrować przez sitko komórkowe (10 μm), aby usunąć tkanki łączną oraz niestrawione fragmenty tkanek.</li>
 <li>Przenieść filtrat do probówek stożkowych o pojemności 50 ml i odwirować przy 50 x g przez 1 min w temperaturze 4°C (bez hamowania).</li>
 <li>Ostrożnie odlać supernatant. Resuspender osad w zimnym MEM.</li>
 <li>Powtórzyć kroki 2.4) trzykrotnie.</li>
</ol>
3. Mieszana pierwotna hodowla komórek wątroby
<ol>
 <li>Komórki uzyskane w punkcie 2.5) zawiesić w pożywce wzrostowej DMEM zawierającej 10% inaktywowanej ciepłem FCS, uzupełnionej o 10 μM β-merkaptoetanolu, 10 μg/ml insuliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10 U/ml penicyliny, a następnie zasiać do od pięciu do dziesięciu flasks do hodowli tkanek (powierzchnia: 75 cm2) z gęstością 6.7 x 104 komórek / cm2 (5 x 106 komórek / flask / 12-15 ml pożywki).</li>
 <li>Inkubować flasks z hodowlą w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2- 95% powietrza.</li>
 <li>Wymieniać pożywkę wzrostową co 2 do 3 dni.</li>
</ol>
4. Selektywna izolacja makrofagów
<ol>
 <li>Po 12 dniach hodowli makrofagi proliferują na arkuszu komórkowym. Komórki te są zawieszane poprzez wzajemne potrząsanie kolb kultur z częstotliwością 80 - 120 ruchów na minutę przez 30 min w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Przenieś pożywkę hodowlaną do plastikowych naczyń o średnicy 10 mm, które nie są przeznaczone do hodowli tkanek. Połącz pożywkę z dwóch kolb T75 w jednym naczyniu plastikowym. Uzupełnij kolby hodowlane pożywką wzrostową i zwróć je do inkubatora.</li>
 <li>Inkubuj naczynia plastikowe przez 30 min w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2- 95% powietrza. Podczas tego procesu inkubacji makrofagi łatwo przywierają do naczyń plastikowych nieprzeznaczonych do hodowli tkanek, podczas gdy inne zanieczyszczające komórki tego nie robią.</li>
 <li>Odsuń pożywkę i delikatnie wypłucz naczynie plastikowe za pomocą PBS. Powtórz ten krok trzykrotnie.</li>
 <li>Dodaj 1 ml roztworu TrypLE Express do naczynia i inkubuj przez 10 min w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2- 95% powietrza.</li>
 <li>Dodaj 9 ml pożywki wzrostowej. Delikatnie zeskrob przywierające makrofagi za pomocą skrobaka do komórek.</li>
 <li>Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml i wiruj przy 180 x g przez 5 min w temperaturze 25°C (z włączonym hamulcem).</li>
 <li>Odlej supernatant i dodaj 1 ml pożywki wzrostowej. Rozdziel komórki na pojedyncze poprzez energiczne pipetowanie. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
 <li>Kroki izolacji można powtarzać z tymi samymi kolbami hodowlanymi w odstępach dwu- lub trzymilodniowych przez ponad dwa tygodnie.</li>
 <li>Izolowane makrofagi można hodować w pożywce wzrostowej opisanej w punkcie 3.1.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Przykład mieszanej hodowli pierwotnej dorosłych komórek wątroby szczura przedstawiono na rysunku 2. Hepatocyty miąższowe w ciągu kilku dni hodowli tracą morfologię komórek nabłonkowych, degenerują się lub przekształcają w komórki fibroblastopodobne. Następnie, około 6. do 12. dnia, na warstwie komórek fibroblastopodobnych gwałtownie proliferują jasne w kontraście fazowym, okrągłe komórki makrofagopodobne. Poprzez wstrząsanie kolb hodowlanych makrofagi są łatwo zawieszone w medium hodowlanym, a późniejszy przenies i inkubacja w naczyniach plastikowych prowadzą do selektywnej adhezji makrofagów (rysunek 3). Komórki makrofagopodobne można zebrać już w 8. dniu, a ich liczba osiąga poziom maksymalny między 12. a 14. dniem. Ponad 106 komórki mogą być wielokrotnie zbierane z kolby hodowlanej T75 w odstępach od 2 do 3 dni przez ponad dwa tygodnie, co pozwala na uzyskanie całkowitego plonu komórek z jednej kolby na poziomie 107 na kolbę hodowlaną T75 (Rysunek 3). Czystość wyizolowanych makrofagów wynosiła od 95 do 9%, co oceniono za pomocą cytometrii przepływowej lub immunocytochemii z wykorzystaniem przeciwciał specyficznych dla makrofagów szczura, takich jak ED-1 (Rysunek 4), ED-3, OX-41 (Rysunek 4) oraz Iba19Wyizolowane komórki wykazują typowe cechy makrofagów, takie jak aktywna fagocytoza kulek polistyrenowych (Rysunek 5), odpowiedź proliferacyjna na rekombinowany GM-CSF, sekrecja cytokin zapalnych i przeciwzapalnych po stymulacji LPS oraz tworzenie wielojądrzastych komórek olbrzymich.9. 


<img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig1.jpg" alt="Schemat procesu perfuzji wątroby; hodowla makrofagów wątrobowych, trawienie kolagenazą, adhezja komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat selektywnej izolacji i oczyszczania komórek macrophage-like z mieszanej hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura.

<img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig2.jpg" alt="Wzrost komórek w czasie; obrazy mikroskopowe z dni 1, 6, 12, 19; badanie z zakresu biologii." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2. Kultura pierwotna komórek wątroby szczura i proliferacja komórek podobnych do makrofagów. Strzałka wskazuje wielojądrową komórkę olbrzymią. Pasek skali = 100 μmPrzedruk z Journal of Immunological Methods, Vol. 360, 47-5 (2010) 9 za zgodą wydawnictwa Elsevier.

<img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig3.jpg" alt="Analiza wzrostu hodowli komórkowych; obrazy mikroskopowe i wykres przedstawiają wydajność komórkową w czasie w kolbie typu T-flask." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3. Selektywna izolacja komórek przypominających makrofagi metodą wstrząsania i adhezji. Komórki zawieszono w pożywce hodowlanej poprzez wstrząsanie kolb, następnie przeniesiono do plastikowych naczyń nieratedowanych do hodowli tkankowej i inkubowano w 37 °CJuż 10 minut po wysianiu komórki macofagopodobne przytwierdziły się do powierzchni naczynia, podczas gdy pozostałe zanieczyszczające komórki fibroblastyczne pozostały w zawiesinie. Po przemyciu roztworem PBS uzyskano wysoce oczyszczoną populację makrofagów. Komórki te nabyły typowej morfologii makrofagów po 40 minutach hodowli, a często obserwowano komórki w fazie mitozy (strzałki). Przedstawiono późniejsze zmiany w liczbie komórek odzyskanych z kolb w różnych okresach hodowli. Wartości stanowią średnią±SD z trzech do pięciu kolb. Eksperymenty powtórzono trzykrotnie, a dane oznaczono różnymi symbolami. Pasek skali =100 μmPrzedrukowano z Journal of Immunological Methods, t. 360, s. 47-5 (2010)9 za zgodą wydawnictwa Elsevier.

<img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig4.jpg" alt="Rozkład komórkowy na obrazach mikroskopowych; CD68 (ED1), CD172a (OX41); analiza immunoznakowania." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4. Barwienie immunocytochemiczne komórek przypominających makrofagi z użyciem przeciwciał monoklonalnych przeciwko makrofagom szczura.

<img src="/files/ftp_upload/2757/2757fig5.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna: komórki z jądrami barwionymi DAPI (niebieski) i kuleczkami FITC (zielony)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Fagocytoza mikrokulek znakowanych FITC przez komórki macrofagopodobne.

<ol><li>Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+as+a+lymphoid+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The liver as a lymphoid organ.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 147-163 (2009).</li>
<li>Roberts, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Kupffer+cell+in+mediating+hepatic+toxicity+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of the Kupffer cell in mediating hepatic toxicity and carcinogenesis.</a> Toxicol. Sci. 96, 2-15 (2007).</li>
<li>Gao, B., Jeong, W. I., Tian, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver%3A+An+organ+with+predominant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver: An organ with predominant innate immunity.</a> Hepatology. 47, 729-736 (2008).</li>
<li>Janousek, J., Strmen, E., Gervais, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+Kupffer+cells+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of murine Kupffer cells by centrifugal elutriation.</a> J. Immunol. Methods. 164, 109-117 (1993).</li>
<li>Olynyk, J. K., Clarke, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+primary+culture+of+rat+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Isolation and primary culture of rat Kupffer cells.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 13, 842-845 (1998).</li>
<li>Heuff, G., Meyer, S., Beelen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rat+and+human+Kupffer+cells+by+a+modified+enzymatic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of rat and human Kupffer cells by a modified enzymatic assay.</a> J. Immunol. Methods. 174, 61-65 (1994).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Yoshioka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+expression+of+cytokine+mRNAs+by+lipopolysaccharide+in+bovine+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Primary culture and expression of cytokine mRNAs by lipopolysaccharide in bovine Kupffer cells.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 58, 155-163 (1997).</li>
<li>Kitani, H., Takenouchi, T., Sato, M., Yoshioka, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isolation+method+for+macrophage-like+cells+from+mixed+primary+cultures+of+adult+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel isolation method for macrophage-like cells from mixed primary cultures of adult rat liver cells.</a> J. Immunol. Methods. 360, 47-55 (2010).</li>
<li>Gorrell, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%3A+the+hepatocyte+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis: the hepatocyte revisited.</a> Hepatology. 46, 1659-1661 (2007).</li>
</ol>

Wszystkie zwierzęta były utrzymywane i operowane w zwierzęciu National Institute of Animal Health, zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez Komisję ds. doświadczeń na zwierzętach danej instytucji.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy prostą i wydajną metodę pozyskiwania makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłego szczura. Nasza metoda opiera się najpierw na nowej aktywności proliferacyjnej makrofagów w mieszanej kulturze komórek wątroby szczura, a następnie na późniejszej izolacji i oczyszczaniu tych komórek na podstawie ich cech biologicznych właściwych dla makrofagów9. Możliwe jest, że makrofagi proliferujące w mieszanej kulturze pierwotnej komórek wątroby dorosłego osobnika pochodziły z komórek Kupffera lub komórek pokrewnych, które zanieczyściły frakcję hepatocytów miąższowych. Makrofagi mogły zareagować na specyficzne zmiany środowiskowe wywołane transformacją hepatocytów miąższowych10 oraz innych komórek fibroblastycznych w mieszanych kulturach pierwotnych.
Podsumowując, nasza metoda zapewnia izolację komórek macrofagopodobnych w wystarczającej liczbie i czystości z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura bez konieczności użycia zaawansowanego sprzętu i specjalistycznych umiejętności technicznych. Ponadto procedurę izolacji można powtarzać w tej samej kolbie hodowlanej przez ponad dwa tygodnie. Metoda ta może mieć zastosowanie również w przypadku innych gatunków ssaków.

<table><tbody><tr><td>Roztwór pentobarbitalu sodu</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>Wstrzykiwanie Somnopentylu</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenoglikolotetraoctowy (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenaza</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>032-10534</td><td>Stopień dysocjacji komórek&lt;br/&gt; (Wymagana kontrola partii)</td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9128</td><td></td></tr><tr><td>Eagle&amp;rsquo;podłoże minimalne niezbędne (MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-4655</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;modyfikowane pożywka Eagle'a&amp;rsquo;pożywka (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-6459</td><td>Typ z wysoką zawartością glukozy</td></tr><tr><td>płytkowa surowica cielęca (FCS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>Inaktywowany termicznie w 56&amp;#x00B0;C przez 30 min.&lt;br/&gt; (Wymagana kontrola partii)</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; wolny</td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-7522</td><td>Roztwór stokowy: 100 mM w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-5500</td><td>Roztwór stokowy: 10 mg/ml w 0,1N HCl</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td>Rozmiar oczek: 100 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych</td><td>Sumitomo Bakelite Co., Ltd.</td><td>MS-21250</td><td>Powierzchnia: 75 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Plastikowe szalki nieprzystosowane do hodowli tkankowej</td><td>BD Biosciences</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>Skrobacz do komórek</td><td>Corning</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką poziomą</td><td>TAITEC</td><td>NR-1</td><td></td></tr></tbody></table>

prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Komórki Kupffera są rezydentnymi makrofagami specyficznymi dla wątroby i odgrywają istotną rolę w funkcjach fizjologicznych i patologicznych tego organu1-3. Chociaż metody izolacji makrofagów wątrobowych zostały dobrze opisane4-6, większość z nich wymaga zaawansowanego sprzętu, takiego jak elutriator wirówkowy, oraz specjalistycznych umiejętności technicznych. W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodę uzyskiwania makrofagów wątrobowych w wystarczającej liczbie i czystości z mieszanych pierwotnych kultur komórek wątroby dorosłego szczura, co zostanie schematycznie przedstawione na Rysunku 1.
Po dysocjacji komórek wątroby metodą dwuetapowej perfuzji7,8, przygotowuje się frakcję składającą się głównie z hepatocytów miąższowych, które wysiewa się do kolbek hodowlanych T75 z pożywką składającą się z DMEM i 10% FCS. Hepatocyty miąższowe tracą morfologię komórek nabłonkowych w ciągu kilku dni hodowli, degenerują się lub przekształcają w komórki fibroblastopodobne (Rycina 2). W miarę trwania hodowli, około 6. dnia, na warstwie komórek fibroblastycznych zaczynają namnażać się jasne w kontraście fazowym, okrągłe komórki makrofagopodobne (Rycina 2). Wzrost komórek makrofagopodobnych trwa nadal i osiąga maksymalny poziom około 12. dnia, pokrywając warstwę komórek na powierzchni kolby. Poprzez wstrząsanie kolb hodowlanych makrofagi łatwo przechodzą w zawiesinę w pożywce hodowlanej. Następujący po tym transfer i krótka inkubacja w naczyniach plastikowych prowadzą do selektywnej adhezji makrofagów (Rycina 3), podczas gdy pozostałe komórki zanieczyszczające pozostają w zawiesinie. Po kilkukrotnym przemyciu PBS-em zbiera się przytwierdzone makrofagi. Ponad 106 komórek można zebrać wielokrotnie z tej samej kolby hodowlanej T75 w odstępach dwu- lub trzydniowych przez ponad dwa tygodnie (Rycina 3). Czystość wyizolowanych makrofagów wynosiła od 95 do 99%, co oceniono za pomocą cytometrii przepływowej lub immunocytochemii z zastosowaniem przeciwciał specyficznych dla makrofagów szczura (Rycina 4). Wyizolowane komórki wykazują aktywną fagocytozę kulek polistyrenowych (Rycina 5), odpowiedź proliferacyjną na rekombinowany GM-CSF, wydzielanie cytokin zapalnych/przecwzapalnych po stymulacji LPS oraz tworzenie wielojądrowych komórek olbrzymich9.
Podsumowując, przedstawiamy prostą i wydajną metodę pozyskiwania makrofagów wątrobowych w wystarczającej liczbie i czystości, bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności. Metoda ta może znaleźć zastosowanie u innych gatunków ssaków.

Opisano nową metodę pozyskiwania makrofagów z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje proliferację makrofagów w hodowli, a następnie wstrząsanie kolb z kulturą i oczyszczanie poprzez selektywną adhezję do plastikowych naczyń. Technika ta pozwala na wydajne pozyskanie makrofagów wątrobowych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności.

Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

Komórki Kupffera są swoistymi dla wątroby rezydentnymi makrofagami i odgrywają ważną rolę w funkcjach fizjologicznych i patologicznych wątroby1-3. Chociaż ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest uzyskanie wielu kultur makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby szczura bez konieczności stosowania złożonego sprzętu lub specjalistycznych umiejętności. Osiąga się to najpierw poprzez dysocjację komórek wątroby dorosłego szczura za pomocą perfuzji kolagenazą, a następnie poprzez izolację parenchymalnej frakcji hepatocytów. Następnie komórki inkubuje się w kolbach do hodowli tkankowej T 75 z pożywką wzrostową w celu ustanowienia mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby.Następnie, po 10 do 12 dniach hodowli, kolby hodowlane są wstrząsane, aby ułatwić przeniesienie makrofagów do naczyń plastikowych, z których są one następnie zbierane poprzez selektywną adhezję po krótkim okresie inkubacji. W końcu, ponad 10 z sześciu komórek może być wielokrotnie zbieranych z tych samych kolb do hodowli tkanek T 75 w odstępach dwu- lub trzydniowych przez ponad dwa tygodnie. Metody izolacji makrofagów wątrobowych zostały dobrze opisane.Większość wcześniejszych metod wymaga jednak zaawansowanego sprzętu, takiego jak wirówka do gradientów gęstości, oraz wysokich umiejętności technicznych. Przedstawiamy tutaj prostą i nowatorską metodę pozyskiwania makrofagów wątrobowych w wystarczającej liczbie i czystości z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłego osobnika, która nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani zaawansowanych umiejętności laboratoryjnych. Sekcja zwierząt, perfuzja wątroby oraz przygotowanie cytokin zostaną zaprezentowane przez dr. Norco, dr. Yamanakę i dr. Miko Yoshioka z Narodowego Instytutu Zdrowia Zwierząt.Następnie dr Taketo Takeno z National Institute of Agro Biological Sciences zaprezentuje izolację i oczyszczanie makrofagów wątrobowych z hodowli. Zacznijmy zatem. W ramach przygotowań do perfuzji wątroby szczura należy uprzednio podgrzać jedną butelkę roztworu płuczącego oraz jedną butelkę roztworu kolagenazy.Następnie, po potwierdzeniu sedacji za pomocą uszczypnięcia skóry, umieść znieczulonego dorosłego samca szczura w stalowej kuwecie i spryskaj jego brzuch oraz klatkę piersiową 70%etanolem. Następnie wykonaj niewielkie nacięcie w środkowej części brzucha za pomocą nożyczek sekcyjnych i odsunie skórę. Potem otwórz jamę brzuszną nożyczkami i potwierdź położenie żyły wrotnej.Następnie przeprowadź nić chirurgiczną pod żyłą wrotną i luźno ją zaciśnij. Potem zaklempluj dystalną część żyły głównej dolnej oraz żyłę krezkową za pomocą kleszczyków typu mosquito, aby zapobiec cofaniu się krwi do wątroby. Otwórz jamę klatki piersiowej, przecinając przeponę nożyczkami, i odsłoń serce; po wykonaniu małego nacięcia w żyle wrotnej za pomocą nożyczek okulistycznych, wprowadź do żyły plastikowy cewnik o średnicy 2 mm i mocno zaciśnij nić wokół cewnika.Napełnij system perfuzyjny uprzednio podgrzanym roztworem piorącym, a następnie podłącz go do cewnika. Rozpocznij perfuzję w C two z szybkością 10 milliliters per minute. Jednocześnie wykonaj nacięcie w ścianie prawego przedsionka za pomocą nożyczek rozczepnych.Kontynuuj perfuzję przez 10 minut, następnie zmień roztwór perfuzyjny na roztwór kolagenazy i perfunduj przez 10 do 20 minut. Z prędkością 10 ml/min napełnij sterylny zlew 25 ml roztworem kolagenazy. Następnie wyjmij i ostrożnie umieść perfundowaną wątrobę w zlewie.Rozdrobnij wątrobę nożyczkami na małe kawałki. Do otrzymanej zawiesiny komórkowej dodaj 75 mililitrów zimnego MEM. Po delikatnym pipetowaniu przefiltruj zawiesinę przez sito komórkowe o oczkach 100 mikrometrów.Aby usunąć tkankę łączną z niestrawionych fragmentów tkanki, należy zebrać filtrat do probówek stożkowych o pojemności 50 ml. Przenieś filtrat do probówek stożkowych o pojemności 50 ml i przemyj komórki czterokrotnie, odwirując je najpierw z prędkością 50 G przez jedną minutę w temperaturze 4 °C. Po zatrzymaniu wirowania ostrożnie odlej supernatant, a następnie resuspenduj osad w zimnym MEM i odwiruj komórki ponownie po ostatnim przemyciu.Resuspender komórki wątroby w medium wzrostowym. Następnie wysiać komórki do od pięciu do 10 flasks do hodowli tkankowej T 75 przy gęstości 6,7 × 10⁴ komórek na centymetr kwadratowy. Umieścić flasks z kulturą w inkubatorze i wymieniać medium wzrostowe co dwa do trzech dni.Po jednym dniu hodowli hepatocyty miąższowe rozprzestrzeniają się na powierzchni kolby i wykazują typową wieloboczna morfologię przypominającą kamień kopalowy z jednym lub dwoma okrągłymi jądrami. W ciągu kilku dni hodowli hepatocyty miąższowe tracą morfologię komórek nabłonkowych i przekształcają się w bardziej spłaszczone komórki fibroblastyczne. Około szóstego dnia, w kontraście fazowym, zaczynają proliferować na warstwie komórek fibroblastycznych jasne, okrągłe komórki przypominające makrofagi. Wzrost komórek przypominających makrofagi osiąga maksymalny poziom około 12. dnia.Liczba komórek podobnych do makrofagów spada około 19. dnia, gdy włóknista warstwa komórkowa zaczyna ulegać degeneracji. Dlatego około 7. do 10. dnia hodowli zawieszamy makrofagi, które namnożyły się na warstwie komórkowej, w pożywce hodowlanej poprzez wzajemne wstrząsanie kolb hodowlanych przez 30 minut po resuspensji makrofagów. Każdej z 100 milimetrowych plastikowych płytek nieprzeznaczonych do hodowli tkanek przelewamy pożywkę z dwóch kolb T 75.Ponownie napełnij kolby hodowlane pożywką wzrostową i umieść je w inkubatorze. Inkubuj naczynia plastikowe przez 30 minut po okresie inkubacji, a następnie przemyj naczynia trzykrotnie, odsysając pożywkę i delikatnie płucząc naczynie plastikowe PBS, jak pokazano tutaj; już po 10 minutach od wysiania komórki macrofagopodobne przywierają do powierzchni naczynia, podczas gdy pozostałe zanieczyszczające komórki fibroblastyczne pozostają w zawiesinie. Po płukaniu PBS uzyskuje się wysoką czystość populacji makrofagów.Jak widać na tej rycinie, komórki zyskują typową morfologię makrofagów po 40 minutach hodowli, a często obserwuje się komórki w stanie mitozy, co wskazują strzałki. Aby zebrać tę nową, wysoko oczyszczoną populację makrofagów, należy dodać jeden mililitr roztworu trip LE Express do przemytych komórek i umieścić naczynia z powrotem w inkubatorze na kolejne 10 minut. Po tym czasie inkubacji należy dodać dziewięć mililitrów pożywki wzrostowej, a następnie delikatnie zebrać przytwierdzone makrofagi za pomocą skrobaka do komórek, przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, odwirować i usunąć nadsącz.Dodać jeden mililitr pożywki wzrostowej, rozbić resuspenderowane agregaty komórkowe na pojedyncze komórki poprzez intensywne pipetowanie, a następnie określić liczbę komórek za pomocą hemocytometru, jak pokazano na tym wykresie; z kolby hodowlanej T 75 można wielokrotnie pobrać ponad 10⁶ komórek w odstępach dwu- lub trzydniowych przez ponad dwa tygodnie, co pozwala na uzyskanie całkowitej liczby komórek rzędu 10⁷ na kolbę hodowlaną T 75. Jak pokazano na tych obrazach, izolowane komórki poddano barwieniu immunologicznemu z użyciem przeciwciał monoklonalnych przeciwko antygenom makrofagów szczura, takim jak CD 68 lub ED 1 oraz CD 172a lub OX 41. Komórki te wykazywały właściwości funkcjonalne makrofagów, takie jak aktywna fagocytoza mikrokulek znakowanych FITC.W niniejszym filmie przedstawiliśmy prostą i wydajną metodę pozyskiwania makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych dorosłych komórek wątroby czerwonej. Nasza procedura nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani zaawansowanych umiejętności, a jednocześnie pozwala na uzyskanie wystarczającej liczby czystych makrofagów, które można wielokrotnie pobierać z tej samej kultury. Metodę tę można zastosować również u innych gatunków ssaków.Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w przyszłych eksperymentach. Pozdrawiamy.

a-simple-efficient-method-to-isolate-macrophages-from-mixed-primary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prosty i efektywny sposób izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Urazom wątroby towarzyszy ekspansja komórek progenitorowych, które reprezentują niejednorodną populację komórek. Nowatorska klasyfikacja tego przedziału komórkowego pozwala na rozróżnienie wielu podzbiorów. Opisana tutaj metoda ilustruje analizę cytometrii przepływowej i izolację różnych podzbiorów o wysokiej czystości, które można wykorzystać do dalszych testów.

Izolacja i wzbogacenie podzbiorów progenitorów wątroby zidentyfikowanych za pomocą nowej kombinacji markerów powierzchniowych

Tutaj pokazujemy enzymatyczne podejście do izolacji pierwotnych hepatocytów od dorosłych myszy i opisujemy kwantyfikację odpowiedzi zapalnej za pomocą ELISA i PCR w czasie rzeczywistym.

Indukcja odpowiedzi zapalnej w pierwotnych kulturach hepatocytów od myszy

Ten protokół pozwala badaczowi na wyizolowanie i scharakteryzowanie makrofagów rezydujących w tkankach w różnych charakterystycznych tkankach objętych stanem zapalnym, pobranych z modeli zaburzeń metabolicznych wywołanych dietą.

Izolacja, charakterystyka i oczyszczanie makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością

Przedstawiamy protokół uzyskiwania sygnatur proteomicznych ludzkich makrofagów i stosowania go do określania wpływu środowiska o niskiej zawartości tlenu na polaryzację makrofagów.

Analiza proteomiczna polaryzacji ludzkich makrofagów w środowisku o niskiej zawartości tlenu

Ten protokół jest wydajną, opłacalną i solidną metodą izolowania pierwotnego mikrogleju od żywej, dorosłej, ludzkiej tkanki mózgowej. Wyizolowany pierwotny mikroglej ludzki może służyć jako narzędzie do badania procesów komórkowych w homeostazie i chorobie.

Pozyskiwanie ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Poznaj prostą metodę izolacji makrofagów z pierwotnych kultur komórek wątroby szczura. Technika opiera się na perfuzji kolagenazowej, wstrząsaniu kolbami i selektywnym przyleganiu do naczyń plastikowych.

Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

Przeglądaj więcej filmów