Prosta i skuteczna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych dorosłych komórek wątroby

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie wielu kultur makrofagów z mieszanych pierwotnych kultur komórek wątroby szczura bez konieczności stosowania skomplikowanego sprzętu lub umiejętności. Osiąga się to najpierw poprzez dysocjację dorosłych komórek wątroby szczura przez perfuzję kolagenazy, a następnie izolację frakcji komórek miąższu hepatocytów. Następnie komórki inkubuje się w T 75, kolbach do hodowli tkankowych z pożywką wzrostową w celu utworzenia mieszanych pierwotnych kultur komórek wątroby.

Następnie, po 10 do 12 dniach hodowli, kolby hodowlane są wstrząsane, aby ułatwić przeniesienie makrofagów do plastikowych naczyń, z których są one następnie zbierane przez selektywną adhezję po krótkim okresie inkubacji. Wreszcie, więcej niż 10 z sześciu komórek można wielokrotnie pobierać z tych samych kolb do hodowli tkankowych T 75 w odstępach dwu- lub trzydniowych przez ponad dwa tygodnie. Metody izolacji makrofagów wątrobowych zostały dobrze opisane.

Jednak większość poprzednich metod wymaga wyrafinowanego sprzętu, takiego jak ilustrator odśrodkowy i wyrafinowane umiejętności techniczne. Tutaj przedstawiamy proste i nowatorskie metody uzyskiwania makrofagów wątrobowych w wystarczającej liczbie i czystości z mieszanych kultur pierwotnych dorosłych komórek wątroby owiniętych, które nie wymagają specjalnego sprzętu ani zaawansowanych umiejętności laboratoryjnych. Sekcja zwierząt, perfuzja wątroby i przygotowanie cytów zostaną zademonstrowane przez doktorów Norco, Yamanaka i Miko yoshioka z Narodowego Instytutu Zdrowia Zwierząt.

Następnie izolacja i oczyszczanie makrofagów wątrobowych z zagrożeń kulturowych zostanie pokazane przez dr Taketo Takeno z National Institute of Agro Biological Sciences. Więc zacznijmy. Aby przygotować się do obfitości wątroby szczura, zacznij od podgrzania jednej butelki roztworu myjącego i jednej butelki roztworu kolagenazy.

Następnie, po potwierdzeniu sedacji przez uszczypnięcie skóry, umieść znieczulonego dorosłego samca szczura na patelni ze stali nierdzewnej i spryskaj jego brzuch i klatkę piersiową 70% etanolem. Następnie wykonaj małe nacięcie na środku brzucha nożyczkami preparacyjnymi i oderwij skórę. Następnie otwórz brzuch nożyczkami i potwierdź położenie żyły wrotnej.

Następnie przełóż nić chirurgiczną pod żyłą wrotną i luźno dokręć nić. Następnie zaciśnij dystalną część dolnej żyły głównej i krezki za pomocą zacisku na komary, aby zapobiec refluksowi krwi do wątroby. Otwórz klatkę piersiową, przecinając przeponę nożyczkami i odsłaniając serce po wykonaniu małego nacięcia w żyle wrotnej nożyczkami okulistycznymi, włóż dwumilimetrowy plastikowy cewnik do żyły i mocno zaciśnij nić wokół cewnika.

Załaduj system perfuzyjny wstępnie ciepłym roztworem myjącym, a następnie podłącz go do cewnika. Rozpocznij perfuzję w C dwa z szybkością 10 mililitrów na minutę. W tym samym czasie wykonaj nacięcie w prawej ścianie atrium za pomocą nożyczek preparacyjnych.

Kontynuuj profuzję przez 10 minut, a następnie zamień roztwór profuzji na roztwór kolagenazy i perfuzuj przez 10 do 20 minut. Z szybkością 10 mililitrów na minutę napełnij sterylną zlewkę 25 mililitrami roztworu kolagenazy. Następnie wyjąć i ostrożnie umieścić wątrobę perfuzyjną w zlewce.

Zmiel wątrobę na małe kawałki nożyczkami. Dodaj 75 mililitrów zimnego MEM do powstałej zawiesiny komórek. Po delikatnym pipetowaniu przefiltrować zawiesinę przez sitko o średnicy 100 mikrometrów.

Aby usunąć tkankę łączną z niestrawionych fragmentów tkanki, należy zebrać filtrat do 50-mililitrowych stożkowych probówek. Przenieść filtrat do stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów i umyć komórki czterokrotnie, najpierw obracając komórki w temperaturze 50 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odłamaniu ostrożnie wyrzuć supernatant, a następnie ponownie zawieś osad w zimnym MEM i ponownie odwiruj komórki po ostatnim praniu.

Ponownie zawiesić komórki wątroby w pożywce wzrostowej. Teraz zasiej komórki w kolbach do hodowli tkankowych od pięciu do 10 T 75 o gęstości 6,7 razy 10 do czwartej komórki na centymetr kwadratowy. Umieść kolby hodowlane w inkubatorze i wymieniaj pożywkę co dwa do trzech dni.

Po jednym dniu hodowli hepatocyty miąższowe rozprzestrzeniają się na powierzchni kolby i wykazują typową wielokątną morfologię kopalową przypominającą kamienie z jednym lub dwoma okrągłymi jądrami. W ciągu kilku dni hodowli hepatocyty miąższowe tracą morfologię komórek nabłonkowych i przekształcają się w bardziej spłaszczone komórki fibroblastyczne Około szóstego dnia kontrast fazowy, jasne okrągłe komórki przypominające makrofagi zaczynają się namnażać na arkuszu komórek fibroblastycznych. Wzrost komórek podobnych do makrofagów osiąga maksymalny poziom około 12 dnia.

Liczba komórek podobnych do makrofagów spada około 19 dnia, kiedy arkusz komórek fibroblastycznych zaczyna się degenerować. Tak więc po około siedmiu do 10 dniach hodowli zawieszamy makrofagi, które namnażają się na arkuszu komórkowym, do pożywki hodowlanej poprzez wzajemne potrząsanie kolbami hodowlanymi przez 30 minut po ponownym zawieszeniu makrofagów. Odtwórz każdą ze 100-milimetrowych plastikowych naczyń bez hodowli tkankowych z pożywką z dwóch kolb T 75.

Napełnij kolby hodowlane pożywką wzrostową i włóż je z powrotem do inkubatora. Inkubować plastikowe naczynia przez 30 minut po okresie inkubacji, umyć naczynia trzy razy, zasysając pożywkę i delikatnie spłukując plastikowe naczynie PBS, jak widać tutaj, już po 10 minutach od posiania komórek podobnych do makrofagów przyczepionych do powierzchni naczynia, podczas gdy inne zanieczyszczające komórki fibroblastyczne pozostają zawieszone. Po płukaniu PBS uzyskuje się wysoce oczyszczoną populację makrofagów.

Jak widać na tym rysunku, komórki uzyskują typową morfologię makrofagów po 40 minutach hodowli, a komórki mitotyczne są często obserwowane, jak wskazują strzałki. Aby zebrać tę nową, wysoce oczyszczoną populację makrofagów w jednym mililitrze roztworu LE Express do umytych komórek i umieścić szalki z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 10 minut. Po tym okresie inkubacji dodać dziewięć mililitrów pożywki wzrostowej, a następnie delikatnie zeskrobać dołączone makrofagi za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do 15-mililitrowej stożkowej wirówki probówkowej i wyrzucić supernatant.

Dodać jeden mililitr pożywki wzrostowej, rozdzielić zawieszone grudki komórek na pojedyncze komórki przez energiczne pipetowanie, wyliczyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru, jak pokazano na tym wykresie, więcej niż 10 z sześciu komórek można pobrać z kolby hodowlanej T 75 wielokrotnie w odstępach dwudniowych przez ponad dwa tygodnie, umożliwiając całkowitą wydajność komórek od 10 do siedmiu na kolbę hodowlaną T 75. Jak pokazano na tych obrazach, wyizolowane komórki są wybarwione immunologicznie przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko antygenom makrofagów szczurów, takim jak CD 68 lub ED one i CD 1 72 A lub OX 41. Komórki te posiadały funkcjonalne właściwości makrofagów, takie jak aktywna fagocytoza mikrogranulek znakowanych FITC.

W tym filmie przedstawiliśmy prostą i skuteczną metodę pozyskiwania makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych dorosłych czerwonych komórek wątroby. Nasza procedura nie wymaga skomplikowanego sprzętu ani umiejętności, ale zapewnia wystarczającą liczbę czystych makrofagów, które można wielokrotnie zbierać z tej samej kultury mosiądzu. Metodę tę można zastosować do innych gatunków ssaków.

Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w przyszłych eksperymentach. Dziękuję.