Name: Analiza mozaiki funkcji genów w pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy przy użyciu rekombinacji Cre opartej na wirusach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj metodę analizy funkcji genów w pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy przy użyciu rekombinacji Cre opartej na wirusach AAV. Technika umożliwia mozaikową inaktywację genów i analizę rozwoju obwodów nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest finansowana z grantu RO1 przyznanego przez NIH (NINDS).

1. Przygotowanie wirusów do iniekcji
<ol>
 <li>Wektory rAAV zakupiono od zalecanego dostawcy komercyjnego, jednak mogą być one również produkowane we własnym laboratorium (patrz dyskusja poniżej). Roztwór wirusa jest zazwyczaj przygotowywany o mianie ok. 1x1012 kopii genomu na mililitr (GC/ml) i może być stosowany w pełnym mianie do manipulacji dużą liczbą komórek. Alternatywnie można go rozcieńczyć, aby uzyskać pożądany poziom rzadkiego znakowania. Odpowiednie rozcieńczenie musi zostać określone przez użytkownika, jednak na początek zaleca się rozcieńczenie 1:10.</li>
 <li>Wirusy rozmrozić na lodzie bezpośrednio przed użyciem. Przenieść pożądany objętość wstępnego rozcieńczenia roztworu wirusa do małej (ok. 250μl) probówki PCR. Rozcieńczyć roztwór wirusa, dodając odpowiednią objętość sterylnego DPBS w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Rozcieńczony roztwór wirusa przechowywać na lodzie do momentu użycia.</li>
</ol>
UWAGA: wszelkie prace z wirusami powinny być prowadzone zgodnie z protokołem bezpieczeństwa biologicznego zatwierdzonym przez Twoją instytucję
2. Napełnianie strzykawki i montaż sprzętu
<ol>
 <li>Podłącz igłę do pobierania do szklanej strzykawki i wciągnij roztwór wirusa z probówki PCR, delikatnie odciągając tłok. Odciągaj tłok, aż w strzykawce pojawi się niewielki pęcherzyk powietrza; wskazuje to, że cały roztwór znajduje się w strzykawce i nie pozostał w igle do pobierania. Alternatywnie do roztworu można dodać niewielką ilość barwnika obojętnego, aby uczynić go widocznym. 
 UWAGA: Należy użyć małej probówki PCR, ponieważ igła do pobierania zazwyczaj nie jest wystarczająco długa, aby dotrzeć do dna większości innych probówek.</li>
 <li>Zdejmij igłę do pobierania i umieść strzykawkę w uchwycie strzykawki pompy strzykawkowej, zabezpieczając ją zaciskiem do strzykawki.</li>
 <li>Delikatnie wsuń jeden koniec przewodu łączącego do strzykawki, a drugi koniec do uchwytu igły. Wsuń igłę wstrzykującą do uchwytu igły. Końcówka igły wstrzykującej powinna bezpośrednio stykać się z końcem przewodu łączącego wewnątrz uchwytu igły.</li>
 <li>Powoli i ręcznie wciśnij tłok, aby przepchnąć roztwór przez przewód łączący. Przesuwaj tłok, aż na końcówce igły wstrzykującej pojawi się mała kropla roztworu.</li>
 <li>Ostrożnie ustaw tłok obok bloku napędowego i zabezpiecz go wspornikiem bloku napędowego.</li>
 <li>Ustaw parametry wstrzykiwania: szybkość wstrzykiwania powinna wynosić około 8μl/min (˜130nl/s); objętość wstrzykiwania zazwyczaj wynosi 1-2ul; wybierz odpowiednią średnicę strzykawki dla używanego rozmiaru strzykawki (wytyczne znajdują się w instrukcji obsługi pompy strzykawkowej).</li>
 <li>Ustaw płytkę grzewczą na ˜38°C i przykryj ją ręcznikiem papierowym lub inną cienką barierą, aby chronić młode szczury w fazie rekonwalescencji.</li>
</ol>
3. Procedura iniekcji i odzyskiwanie młodych
<ol>
 <li>Przygotuj myszy w wieku P0 lub P1 do iniekcji, poddając je anestezji zimnem zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC. Zwilż wodą kilka ręczników papierowych i połóż je na lodzie. Umieść odpowiednią liczbę myszy (4-5) na ręczniku papierowym (zachowując między nimi odstępy) i delikatnie złóż ręczniki tak, aby myszy były nimi przykryte. Połóż niewielką ilość kruszonego lodu na wierzchu ręczników papierowych i inkubuj myszy przez około 5 minut. Myszy mogą pozostawać na lodzie do 15 minut i zazwyczaj dobrze regenerują się po tym zabiegu.</li>
 <li>Gdy mysz zostanie odpowiednio znieczulona, umieść ją na bloku montażowym (stosujemy blok styropianowy, który zazwyczaj służy do przechowywania probówek 15ml) i ustaw ją tak, aby zapewnić najlepszy dostęp do miejsca iniekcji. W przypadku kory najłatwiej jest położyć zwierzę płasko na brzuchu, natomiast w przypadku móżdżku pomocne jest ustawienie głowy myszy nad krawędzią bloku, co zapewnia lepszy dostęp do tylnej części czaszki. Jeśli zajdzie taka potrzeba, mysz można przymocować plastrem.</li>
 <li>Jedną ręką unieruchom głowę myszy, podczas gdy drugą ręką ręcznie wprowadź igłę przez czaszkę w wyznaczonym miejscu. Pomocne jest mocne naciągnięcie skóry, aby zapobiec jej przesuwaniu się podczas iniekcji. W przypadku kory użyteczne jest wykonywanie iniekcji w odniesieniu do wyraźnego punktu orientacyjnego, takiego jak szew lambda czaszki, co ułatwi przyszłe iniekcje. Móżdżek jest widoczny przez czaszkę jako cienki pas tkanki położony bezpośrednio kuzałnie od kolcolca. Głębokość, na jaką należy wprowadzić igłę, różni się nieco w zależności od osobniczych różnic i szczepów; można ją ocenić za pomocą wcześniej wyznaczonych znaczników na igle, jednak w przypadku kory i móżdżku głębokość ˜0.5 - 1mm od powierzchni jest zazwyczaj odpowiednia. Głębokość wprowadzenia igły dla innych miejsc powinna zostać ustalona eksperymentalnie przez użytkownika końcowego. 
 UWAGA: Igła powinna łatwo przebić czaszkę; jeśli tak się nie dzieje, NIE naciskaj zbyt mocno, ponieważ może to zranić zwierzę. Zmień pozycję igły i spróbuj ponownie, robiąc to delikatnie.</li>
 <li>Wstrzyknij roztwór wirusa. Iniekcję rozpoczyna się poprzez naciśnięcie przycisku START na pompie lub naciśnięcie pedału nożnego, w zależności od modelu używanego wstrzykiwacza ciśnieniowego. W przypadku braku pedału nożnego zaleca się, aby kolega pomógł w naciśnięciu przycisku, co zminimalizuje zbędne ruchy rąk, które mogłyby wpłynąć na przebieg iniekcji.</li>
 <li>Po wstrzyknięciu wybranej objętości pozostaw igłę w miejscu przez kilka sekund, a następnie delikatnie ją wyjmij, wysuwając ją płynnym ruchem. Pamiętaj o unieruchomieniu głowy myszy, aby zminimalizować przypadkowe ruchy. Ponieważ sprzęt do iniekcji jest czyszczony i sterylizowany między eksperymentami za pomocą etanolu, a rana jest niewielka, stosowanie antyseptyków nie jest konieczne.</li>
 <li>Umieść mysz na przykrytej płycie grzewczej z temperaturą ustawioną na ˜38°C, aby ją ogrzać w celu regeneracji, zazwyczaj przez 5-10 minut. W tym czasie można kontynuować iniekcje u pozostałych myszy.</li>
 <li>Gdy wszystkie myszy dojdą do siebie (powinny być różowe i ruchliwe), weź porcję ściółki z klatki i delikatnie potrzyj nią myszy. Zwróć myszy do matki jako grupę.</li>
</ol>
UWAGA: Bardzo ważne jest upewnienie się, że szczenięta są ogrzane i miały kontakt z domową ściółką przed oddaniem ich matce, a także aby oddać je jako grupę. Niedopełnienie tego wymogu może doprowadzić do zranienia lub zabicia szczeniąt przez matkę.
4. Czyszczenie sprzętu
<ol>
 <li>Po zakończeniu iniekcji i oddaniu młodych szczurów do matki, należy oczyścić zestaw do iniekcji, całkowicie napełniając strzykawkę acetonem lub 70% etanolem. Przelej roztwór przez zestaw kilka razy, używając za każdym razem świeżego roztworu. Usunie to wszelkie pozostałości roztworu wirusa oraz osady. Aceton lub etanol następnie odparują. 
 UWAGA: Do czyszczenia zaleca się stosowanie acetonu, jednak jeśli zestaw zawiera elementy wrażliwe na aceton, takie jak kleje cyjanoakrylowe, w tych krokach należy użyć 70% etanolu.</li>
 <li>Zdezynfekuj obszar roboczy wybielaczem, a odpady zutylizuj w odpowiednim pojemniku na odpady biologiczne.</li>
</ol>
5. Analiza
<ol>
 <li>Uśmierć zwierzęta w pożądanym wieku, stosując metodę eutanazji zatwierdzoną przez IACUC. W celu ułatwienia późniejszej wizualizacji zainfekowanych neuronów, szczególnie u dorosłych zwierząt, zaleca się utrwalanie perfuzyjne.</li>
 <li>W celu wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego można zastosować standardowe procedury immunobarwienia. W skrócie: pływające skrawki o grubości 100 μm wykonane w wibrotomie poddaje się permeabilizacji w PBS+1% Triton X-100 i blokowaniu w PBS+1% Triton X-100+10% normalnego surowicy koziej. Skrawki inkubuje się w roztworze blokującym z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4°C, a następnie poddaje dodatkowemu przemywaniu i blokowaniu. Następnie skrawki inkubuje się w roztworze blokującym z przeciwciałami wtórnymi przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, dokładnie przemywa, osadza na szkiełkach i zakrywa szkiełkami podstawowymi, stosując medium montażowe typu anti-fade. Do wizualizacji znakowanych neuronów można również wykorzystać krioprzekroje, jednak może dojść do utraty fluorescencji endogennej.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki:
Prawidłowo przeprowadzona procedura wstrzykiwania doprowadzi do skutecznej infekcji neuronów w obrębie miejsca wstrzyknięcia, bez widocznych uszkodzeń tkanki ani innych negatywnych skutków dla zwierzęcia. Jak pokazano na Ryc. 1, rozprzestrzenianie się infekcji można zaobserwować u myszy z reporterem Cre (ROSA26R)12 po wstrzyknięciu rAAV8-Cre w różne miejsca anatomiczne. Wstrzyknięcia do konkretnych obszarów, takich jak kora mózgu i wzgórze górne, zazwyczaj generują infekcje lokalne z minimalnym rozprzestrzenianiem się do sąsiednich regionów (Ryc. 1A-B). Zastosowanie roztworu wirusa o wysokim mianie zwiększa prawdopodobieństwo infekcji obszarów sąsiednich, takich jak hipokamp (Ryc. 1A). Wstrzyknięcie roztworu wirusa o niskim mianie skutkuje rzadką infekcją, która zazwyczaj pozostaje w pobliżu miejsca wstrzyknięcia, co pokazano w przypadku wstrzyknięcia rAAV8-Cre do móżdżku w linii środkowej u myszy reporterowych ROSA26R (Ryc. 1C-D). Obserwowaliśmy rekombinację u myszy reporterowych ROSA26R w ciągu 2 dni po wstrzyknięciu rAAV8-Cre, co sugeruje, że infekcja, rekombinacja i ekspresja genów reporterowych mogą zachodzić stosunkowo szybko. Ponadto z powodzeniem zastosowaliśmy tę technikę do badania efektów delecji genu w locus innym niż ROSA przy użyciu warunkowego allelu floxed, a wyniki tych badań zostaną opublikowane w innym opracowaniu.
Liczba zainfekowanych komórek powinna korelować z mianem wstrzykniętego roztworu wirusa. Na przykład wstrzyknięcie do móżdżku mieszaniny roztworów o wysokim mianie dwóch wirusów rAAV8 wykazujących ekspresję różnych białek fluorescencyjnych prowadzi do zainfekowania wielu komórek Purkinjego, które są różnie znakowane (Ryc. 2A). Z kolei wstrzyknięcie roztworu wirusa o niskim mianie może skutkować rzadką infekcją, co ułatwia wizualizację pojedynczych komórek (Ryc. 2B). Neurony znakowane fluorescencyjnie można obserwować bezpośrednio w świeżo pociętej, żywej tkance (Ryc. 2B) lub poddać immunobarwieniu w celu wzmocnienia endogennych sygnałów fluorescencyjnych przed późniejszą akwizycją obrazów za pomocą szerokopolowej lub konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (Ryc. 2A, Ryc. 3A-C). Wreszcie, rAAV8 jest w stanie zainfekować różne typy neuronów w korze mózgu, zapewniając silne znakowanie drobnych wypustek (Ryc. 3A-C).
<img alt="Analiza histologiczna tkanki mózgu zarodkowego; obraz mikroskopowy; badanie różnicowania komórkowego." src="/files/ftp_upload/2823/2823fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Barwienie LacZ w mózgu myszy reporterowych ROSA26R, którym w dniu P0 wstrzyknięto rAAV8-Cre, wykazuje aktywność Cre oraz miejsce infekcji.
<ol type="A">
 <li>Widok strzałkowy szerokopolowy mózgu P14 ukazujący wstrzyknięcia wysokiego miana (1x1012 GC/ml) do kory oraz wzgórka górnego. Zastosowanie wirusa o wysokim mianie zwiększa prawdopodobieństwo zainfekowania obszarów sąsiadujących.</li>
 <li>Przekrój strzałkowy kory P14 po wstrzyknięciu wirusa o niższym mianie (1x1011 GC/ml) wykazuje infekcję lokalną z mniejszym rozprzestrzenieniem.</li>
 <li>Widok całego preparatu móżdżku P28 po wstrzyknięciu w linii środkowej roztworu wirusa o niskim mianie (1x109 GC/ml) pokazuje, że infekcja jest rzadka i zazwyczaj pozostaje w pobliżu miejsca wstrzyknięcia.</li>
 <li>Widok strzałkowy linii środkowej móżdżku z obrazu C). Należy zauważyć, że rAAV8 infekuje zazwyczaj tylko komórki Purkinjego.</li>
</ol>
<img alt="Obrazowanie mikroskopowe: neurony znakowane fluorescencyjnie, wizualizacja struktury neuronów, wynik eksperymentu." src="/files/ftp_upload/2823/2823fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Znakowanie móżdżku poprzez wstrzyknięcie wysokich i niskich mian rAAV8 wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych.
<ol type="A">
 <li>Przekrój strzałkowy móżdżku szczura w 21. dniu życia (P21) zainfekowanego mieszaniną dwóch wirusów wykazujących ekspresję EGFP (zielony) i DsRed (czerwony). Do zainfekowania dużej liczby komórek Purkinjego użyto mieszaniny wirusów o wysokim mianie.</li>
 <li>Komórka Purkinjego w żywym móżdżku szczura w 14. dniu życia (P14) po infekcji wirusowej o bardzo niskim mianie, obrazowana natychmiast po sekcji.</li>
</ol>
<img alt="Struktura neuronalna w mikroskopii fluorescencyjnej; czerwona fluorescencja podkreśla morfologię neuronów." src="/files/ftp_upload/2823/2823fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Markowanie kory mózgowej za pomocą rAAV8-DsRed. 
Przykłady różnorodności typów neuronów korowych w przekrojach koronarnych kory P21, która została zainfekowana rAAV8-DsRed w dniu P0.

<ol><li>Geschwind, D. H., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autism+spectrum+disorders%3A+developmental+disconnection+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes.</a> Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).</li>
<li>Giedd, J. N., Rapoport, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+MRI+of+pediatric+brain+development%3A+what+have+we+learned+and+where+are+we+going%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we going?</a> Neuron. 67, 728-734 (2010).</li>
<li>Chedotal, A., Richards, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+the+brain%3A+the+biology+of+neuronal+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Wiring the brain: the biology of neuronal guidance.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li>
<li>Shen, K., Cowan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+molecules+in+synapse+formation+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Guidance molecules in synapse formation and plasticity.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li>
<li>Chen, S. Y., Cheng, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+axon+guidance+molecules+in+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Functions of axon guidance molecules in synapse formation.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 471-478 (2009).</li>
<li>Guan, C., Ye, C., Yang, X., Gao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+current+large-scale+mouse+knockout+efforts%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A review of current large-scale mouse knockout efforts.</a> Genesis. 48, 73-85 (2010).</li>
<li>Tenenbaum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+AAV-mediated+gene+delivery+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Recombinant AAV-mediated gene delivery to the central nervous system.</a> J Gene Med. 6, 212-222 (2004).</li>
<li>Broekman, M. L., Comer, L. A., Hyman, B. T., Sena-Esteves, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vectors+serotyped+with+AAV8+capsid+are+more+efficient+than+AAV-1+or+-2+serotypes+for+widespread+gene+delivery+to+the+neonatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vectors serotyped with AAV8 capsid are more efficient than AAV-1 or -2 serotypes for widespread gene delivery to the neonatal mouse brain.</a> Neuroscience. 138, 501-510 (2006).</li>
<li>Pilpel, N., Landeck, N., Klugmann, M., Seeburg, P. H., Schwarz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J Neurosci Methods. 182, 55-63 (2009).</li>
<li>Szulc, J., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+expression+and+knockdown+using+lentivirus+vectors+encoding+shRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional gene expression and knockdown using lentivirus vectors encoding shRNA.</a> Methods Mol Biol. 434, 291-309 (2008).</li>
<li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-701 (1999).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-1340 (2010).</li>
<li>Tong, C., Li, P., Wu, N. L., Yan, Y., Ying, Q. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+p53+gene+knockout+rats+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of p53 gene knockout rats by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 467, 211-213 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda wstrzykiwania wirusa noworodkom stanowi prosty i szybki sposób generowania mozaik in vivo do badania postnatalnego rozwoju mózgu. Metoda ta wykorzystuje allele floxowane, które są obecnie dostępne, a także te, które powstają w ramach projektu High Throughput Gene Targeting6. W porównaniu z wykorzystaniem transgenicznej ekspresji Cre, metoda ta zapewnia szybki sposób testowania funkcji genów w różnych typach komórek, ponieważ myszy niosące allele floxowane mogą być wykorzysta...

<table><tbody><tr><td>rAAV8-Cre, -GFP, -DsRed,</td><td>Vector Biolabs</td><td>#7060, #7061, zamówienie specjalne</td><td>http://www.vectorbiolabs.com</td></tr><tr><td>Pompa Harvard Pump 11 Plus</td><td>Harvard Apparatus</td><td>#702208</td><td>(Bez portu pedału nożnego)</td></tr><tr><td>Zestaw do iniekcji do nabłonka barwnikowego siatkówki</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>RPE-KIT</td><td>Zawiera przewody łączące, igły do iniekcji (36G) oraz uchwyt do igieł</td></tr><tr><td>Strzykawka NanoFil, 100&amp;mu;l</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NANOFIL-100</td><td>Obejmuje wielorazową igłę do napełniania</td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-117</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko DsRed</td><td>Clontech Laboratories</td><td>632496</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzejny</td><td>VWR international</td><td>97042-610</td><td></td></tr><tr><td>Mysz ROSA26R</td><td>Jackson Laboratory</td><td>003309</td><td></td></tr></tbody></table>

mozaikowa analiza funkcji genów w postnatalnym rozwoju mózgu myszy z wykorzystaniem rekombinacji cre opartej na wirusach

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Prawidłowe funkcjonowanie mózgu zależy nie tylko od rozwoju embrionalnego, podczas którego powstają główne szlaki neuronalne, ale także od rozwoju ponatalnego, w trakcie którego obwody neuronalne dojrzewają i ulegają doprecyzowaniu. Zaburzenia regulacji na tym etapie mogą prowadzić do schorzeń neurologicznych i psychiatrycznych, takich jak autyzm i schizofrenia1,2. Wiele genów przebadano w mózgu prenatalnym, wykazując ich kluczowe znaczenie dla wielu procesów rozwojowych3-5. Jednak ich funkcja w mózgu ponatalnym pozostaje w dużej mierze nieznana, częściowo dlatego, że ich delecja u myszy często prowadzi do letalności podczas rozwoju noworodkowego, a częściowo dlatego, że ich niezbędność we wczesnym rozwoju utrudnia analizy ponatalne. Aby pokonać te przeszkody, u myszy generowane są obecnie allele floxowane tych genów 6. W połączeniu z allelami transgenicznymi wykazującymi ekspresję rekombinazy Cre w konkretnych typach komórek, można uzyskać delecję warunkową w celu zbadania funkcji genów w mózgu ponatalnym. Metoda ta wymaga jednak dodatkowych alleli i więcej czasu (3-6 miesięcy) na wygenerowanie myszy o odpowiednich genotypach, co ogranicza możliwość rozszerzenia analizy genetycznej mózgu myszy na dużą skalę.
W niniejszej pracy demonstrujemy komplementarne podejście wykorzystujące ekspresję Cre za pomocą wirusów, aby szybko i systematycznie badać te allele z flankującymi sekwencjami loxP w rozwoju mózgu po urodzeniu. Poprzez wstrzykiwanie do mózgu noworodka rekombinowanych wirusów adeno-zależnych (rAAVs)7,8 kodujących Cre, jesteśmy w stanie usunąć interesujący nas gen w różnych obszarach mózgu. Kontrolując miano wirusa i współwyrażając marker białka fluorescencyjnego, możemy jednocześnie uzyskać mozaikową inaktywację genów oraz rzadkie znakowanie neuronów. Metoda ta pozwala ominąć wymogi związane z koniecznością obecności wielu genów we wczesnym rozwoju i umożliwia badanie ich autonomicznej funkcji komórkowej w wielu krytycznych procesach rozwoju mózgu po urodzeniu, w tym wzrostu aksonów i dendrytów, ich rozgałęziania i mozaikowania, a także tworzenia i doprecyzowania synaps. Metoda ta była z sukcesem stosowana w naszym laboratorium (wyniki nieopublikowane) oraz w innych jednostkach8,9, a jej zastosowanie można rozszerzyć na inne wirusy, takie jak lentiwirusy 9, a także na ekspresję shRNA lub białek dominująco aktywnych 10. Ponadto, dzięki połączeniu tej techniki z elektrofizjologią oraz niedawno opracowanymi narzędziami obrazowania optycznego 11, metoda ta stanowi nową strategię badania wpływu ścieżek genetycznych na rozwój i funkcjonowanie obwodów neuronalnych u myszy i szczurów.

Opisano metodę in vivo służącą do badania funkcji genów w mózgu po urodzeniu. Rekombinowane AAV wykazujące ekspresję Cre i/lub białka fluorescencyjnego są wstrzykiwane do mózgu noworodka myszy. Uzyskano mozaikową inaktywację genów oraz rzadkie znakowanie neuronów, co umożliwia szybką analizę funkcji genów w procesach kluczowych dla rozwoju obwodów neuronalnych.

Mozaikowa analiza funkcji genów w postnatalnym rozwoju mózgu myszy z wykorzystaniem rekombinacji Cre opartej na wirusach

Prawidłowe funkcjonowanie mózgu zależy nie tylko od rozwoju embrionalnego, podczas którego powstają główne szlaki neuronalne, ale również od rozwoju pozłodowego, kiedy...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest manipulacja funkcją genów w okresie postnatalnym rozwoju mózgu. Osiąga się to poprzez wybór i przygotowanie odpowiednich wirusów, ich nabranie do strzykawki oraz przygotowanie sprzętu do iniekcji. Następnie wirus jest wstrzykiwany do mózgów noworodków myszy, a ostatnim krokiem jest uśmiercenie zwierząt i obrazowanie wstrzykniętych obszarów.W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące różnicowe znakowanie komórek kontrolnych i knockoutowych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak sposób genetycznej regulacji okresu rozwoju ponatalnego. Do iniekcji można zastosować komercyjnie dostępny roztwór wirusa adeno-zależnego o pełnym mianie, zazwyczaj 10¹² kopii genomu na ml, aby zmanipulować dużą liczbę komórek.Jeśli pożądane jest rzadkie oznakowanie, należy zacząć od rozcieńczenia 1:10. Po rozmrożeniu wirusa na lodzie, natychmiast przenieść objętość do wstępnego rozcieńczenia do sterylnej probówki PCR o pojemności 250 µL. Rozcieńczenie należy przechowywać na lodzie.Przygotuj pompę wtryskową, wybierając odpowiednią strzykawkę i podłączając ją do igły do załadunku. Następnie ostrożnie pobierz roztwór wirusa, aż w strzykawce pojawi się bardzo mały pęcherzyk powietrza; aby ułatwić ten etap, można zastosować obojętny barwnik do załadunku. Teraz zamocuj strzykawkę w pompie za pomocą uchwytu.Następnie delikatnie podłącz przewód łączący między strzykawką a uchwytem igły. Upewnij się, że igła wstrzykująca znajduje się w bezpośrednim kontakcie z przewodem łączącym wewnątrz uchwytu igły. Teraz powoli przesuń roztwór przez przewód łączący, aż na końcówce igły pojawi się mała kropla roztworu.Starannie przymocuj tłok obok bloku popychacza za pomocą uchwytu na pompie. Ustaw szybkość iniekcji na 8 µL/min oraz objętość iniekcji w zakresie od 1 do 2 µL. Następnie dostosuj ustawienie średnicy strzykawki w pompie tak, aby odpowiadało średnicy używanej strzykawki.Na koniec, aby chronić szczenięta podczas fazy rekonwalescencji, ustaw temperaturę płyty grzewczej na 38 °C i przykryj ją ręcznikiem papierowym. Zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC, przygotuj szczenięta myszy w wieku P0 lub P1 do iniekcji, poddając je anestezji chłodniczej. Zwilż kilka ręczników papierowych wodą i umieść je na lodzie.Następnie umieść cztery lub pięć szczeniąt na ręczniku papierowym w dużych odstępach od siebie. Złóż ręczniki papierowe nad szczeniętami, ostrożnie połóż na wierzchu niewielką ilość kruszonego lodu i inkubuj szczenięta przez około pięć minut. Szczenięta mogą być bezpiecznie utrzymywane w lodzie do 15 minut, co wciąż pozwala na ich pełny powrót do równowagi.Następnie umieść znieczulonego szczeniaka na bloku montażowym, aby zapewnić optymalny dostęp do miejsca wstrzyknięcia. Do kory mózgowej, na przykład, najłatwiej dotrzeć, kładąc zwierzę płasko na brzuchu. Szczeniaka można przymocować za pomocą plastra; należy ręcznie ustabilizować głowę szczeniaka i mocno naciągnąć skórę, aby zapobiec jego przemieszczaniu się.Następnie, orientując się według punktów anatomicznych czaszki, takich jak szew lambdoidalny, wybierz drugą ręką powtarzalny punkt wstrzyknięcia i delikatnie wprowadź igłę przez czaszkę. Nie naciskaj mocno, jeśli igła nie przenika łatwo przez kość. Zamiast tego zmień położenie igły i spróbuj ponownie, robiąc to delikatnie.Głębokość wstrzyknięcia w obrębie kory różni się nieznacznie pomiędzy poszczególnymi zwierzętami i szczepami; zazwyczaj odpowiednia jest głębokość od 0,5 do 1 mm. Teraz należy wstrzyknąć roztwór wirusa, prosząc współpracownika o uruchomienie pompy, aby zminimalizować ruchy dłoni. W idealnym przypadku do uruchomienia pompy po wstrzyknięciu można by użyć pedału nożnego.Pozostaw igłę w miejscu przez kilka sekund, a następnie, utrzymując głowę szczeniaka w bezruchu, płynnie wysuń igłę. Teraz pozwól szczeniakowi odpocząć od 5 do 10 minut na przykrytej płycie grzewczej.W tym czasie należy kontynuować wstrzykiwanie pozostałych szczeniąt. Gdy wszystkie szczenięta odzyskają różowy kolor i zaczną się poruszać, należy je delikatnie potrzeć częścią ściółki z ich klatki. Dopiero wtedy mogą one zostać zwrócone matce.W przeciwnym razie mogłyby zostać potraktowane jako obce szczenięta, które matka najprawdopodobniej zabiłaby po ich powrocie do gniazda. Oczyść zestaw do iniekcji, całkowicie napełniając strzykawkę acetonem lub 70% etanolem. Jeśli używane są komponenty wrażliwe na aceton, takie jak uszczelnienia, precyzyjne elementy lub kleje, przepłucz zestaw do iniekcji roztworem kilkukrotnie, za każdym razem używając świeżej porcji roztworu.Usunie to wszelkie pozostałości roztworu wirusa oraz osady, a rozpuszczalniki wyparują. Po przepłukaniu układu, zdezynfekuj obszar roboczy wybielaczem, aby pozostawić go w stanie gotowości dla następnego badacza. Prawidłowo wykonana technika zapewnia silną infekcję neuronalną w miejscu wstrzyknięcia.Wstrzyknięcia do konkretnych obszarów, takich jak kora mózgowia i wzgórze górne, zazwyczaj wywołują miejscowe zakażenia z minimalnym rozprzestrzenieniem na obszary sąsiednie. Zastosowanie roztworu wirusa o wysokim mianie zwiększa prawdopodobieństwo zakażenia obszarów przyległych, takich jak hipokamp, w porównaniu z wstrzyknięciem roztworu wirusa o niskim mianie. To ostatnie skutkuje rzadkim zakażeniem, zazwyczaj w pobliżu miejsca wstrzyknięcia, jak w przypadku wstrzyknięcia do linii środkowej móżdżku; liczba zainfekowanych komórek powinna korelować z mianem wstrzykniętego roztworu wirusa.Na przykład wstrzyknięcie do móżdżku mieszaniny wysokomianowych roztworów dwóch wirusów AAV8 wykazujących ekspresję różnych białek fluorescencyjnych prowadzi do zainfekowania wielu komórek Purkinjego, które zostają różnicowo oznakowane. Z kolei wstrzyknięcie roztworu wirusa o niskim mianie może skutkować rzadką infekcją, co ułatwia wizualizację pojedynczych komórek. Neurony oznakowane fluorescencyjnie można obserwować bezpośrednio w świeżo pociętej żywej tkance lub poddać je barwieniu immunologicznemu.Wzmacnia to endogenne sygnały fluorescencyjne w celu późniejszego pozyskiwania obrazów za pomocą szerokopolowej lub konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Na koniec, RAAV eight jest zdolny do infekowania różnych typów neuronów w korze z silnym znakowaniem drobnych wypustek. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje około 30 minut, pod warunkiem, że zostanie przeprowadzona prawidłowo.

mosaic-analysis-gene-function-postnatal-mouse-brain-development-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza mozaiki funkcji genów w rozwoju mózgu myszy po urodzeniu za pomocą rekombinacji Cre opartej na wirusie

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Wektory wirusowe pozwalają na celową manipulację genami. Demonstrujemy metodę warunkowej ekspresji genów lub ablacji w rdzeniu kręgowym myszy, wykorzystując stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego do rogu grzbietowego, widocznego miejsca kontaktu synaptycznego między pierwotnymi aferentami somatosensorycznymi a neuronami ośrodkowego układu nerwowego.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego w celu warunkowej manipulacji genami w rdzeniu kręgowym myszy

Tutaj demonstrujemy technikę rozległej transdukcji neuronalnej poprzez dokomorowe wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do mózgu noworodka myszy.  Metoda ta zapewnia szybki i łatwy sposób na osiągnięcie trwającej całe życie ekspresji transgenów dostarczanych przez wirusa.

Śródmózgowe wstrzyknięcie wirusa do mózgu nowonarodzonego myszy w celu trwałej i rozległej transdukcji neuronalnej

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Opisujemy protokół chirurgii stereotaktycznej za pomocą domowego urządzenia do mikrowstrzykiwania odczynników do prążkowia mózgów noworodków myszy. Technika ta pozwala na manipulację genetyczną w komórkach neuronalnych określonych regionów mózgów noworodków myszy.

Chirurgia stereotaktyczna w manipulacji genetycznej w komórkach prążkowia mózgów noworodków myszy

Przedstawiono protokół do śledzenia linii i funkcjonalnej analizy genetycznej genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki za pomocą analizy mozaikowej z podwójnymi markerami (MADM). Analiza klonalna MADM zapewnia ilościowe ramy do pomiaru zachowania proliferacyjnego, produkcji komórkowej i pokrewieństwa liniowego poszczególnych komórek progenitorowych i ich komórek potomnych.

Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)

Rola niedawno odkrytych genów związanych z chorobą w patogenezie zaburzeń neuropsychiatrycznych pozostaje niejasna. Zmodyfikowana technika obustronnej elektroporacji in utero pozwala na transfer genów w dużych populacjach neuronów i badanie przyczynowego wpływu zmian ekspresji genów na zachowania społeczne.

Rurociąg wykorzystujący obustronną elektroporację in utero do badania wpływów genetycznych na zachowanie gryzoni

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę analizy funkcji genów w pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy przy użyciu rekombinacji Cre opartej na wirusach AAV. Technika umożliwia mozaikową inaktywację genów i analizę rozwoju obwodów nerwowych.

Mozaikowa analiza funkcji genów w postnatalnym rozwoju mózgu myszy z wykorzystaniem rekombinacji Cre opartej na wirusach

Przeglądaj więcej filmów