Analiza mozaiki funkcji genów w pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy przy użyciu rekombinacji Cre opartej na wirusach

Ogólnym celem tej procedury jest manipulowanie funkcją genów w okresie poporodowym rozwoju mózgu. Osiąga się to poprzez wybór i przygotowanie odpowiednich wirusów, załadowanie ich do strzykawki i przygotowanie sprzętu do wstrzykiwań. Następnie wirus jest wstrzykiwany do mózgów nowonarodzonych szczeniąt myszy, a ostatnim krokiem jest złożenie zwierząt w ofierze i zobrazowanie wstrzykniętych obszarów.

Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują różnicowe znakowanie komórek kontrolnych i nokautujących za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, w jaki sposób okres rozwoju pourodzeniowego jest regulowany genetycznie. Do wstrzykiwań można użyć dostępnego na rynku roztworu wirusa związanego z adenowirusem przy pełnym mianie, zwykle od 10 do 12, kopii genomu na mililitr w celu manipulowania dużą liczbą komórek.

Jeśli pożądane jest rozrzedzenie lub etykietowanie, zacznij od rozcieńczenia od jednego do 10. Po rozmrożeniu wirusa na lodzie należy natychmiast przenieść objętość wstępnego rozcieńczenia do sterylnej probówki PCR o pojemności 250 mikrolitrów. Utrzymuj rozcieńczenie na lodzie. Teraz.

Przygotować pompę wtryskową, wybierając odpowiednią strzykawkę i podłączając ją do igły wprowadzającej. Następnie delikatnie narysuj roztwór wirusa, aż w strzykawce pojawi się bardzo mały pęcherzyk powietrza i można użyć obojętnego barwnika ładującego, aby ułatwić ten krok. Teraz przymocować strzykawkę do pompy za pomocą elementu ustalającego.

Następnie delikatnie przymocować rurkę łączącą między strzykawką a uchwytem igły. Należy upewnić się, że igła do wstrzykiwań znajduje się w bezpośrednim kontakcie z rurką łączącą znajdującą się wewnątrz uchwytu igły. Teraz powoli przesuwaj roztwór przez rurkę łączącą, aż na końcu igły będzie widoczna niewielka kropla roztworu.

Ostrożnie zabezpiecz tłok obok bloku popychacza za pomocą wspornika na pompie. Ustaw szybkość wtryskiwania na osiem mikrolitrów na minutę i ustaw objętość wtrysku na od jednego do dwóch mikrolitrów. Następnie dostosuj ustawienie średnicy strzykawki pompy, aby dopasować ją do średnicy strzykawki, której używasz.

Na koniec, aby chronić szczenięta podczas fazy rekonwalescencji, ustaw płytę grzejną na 38 stopni Celsjusza i przykryj ją ręcznikiem papierowym. Korzystając z zatwierdzonego przez IACUC protokołu, przygotuj młode myszy P zero lub P one do wstrzyknięcia, poddając je zimnemu znieczuleniu. Zwilż wodą kilka ręczników papierowych i połóż je na lodzie.

Następnie umieść cztery lub pięć szczeniąt na ręczniku papierowym, dobrze oddzielone. Złóż ręczniki papierowe na szczeniętach, delikatnie połóż niewielką ilość pokruszonego lodu na ręcznikach papierowych i wysiaduj szczenięta przez około pięć minut. Szczenięta mogą być bezpiecznie trzymane na lodzie do 15 minut i nadal mają dobrą regenerację.

Teraz umieść znieczulone szczenię na bloku montażowym, aby uzyskać najlepszy dostęp do miejsca wstrzyknięcia. Na przykład dostęp do kory mózgowej jest najłatwiejszy, gdy zwierzę kładzie się płasko na brzuchu. Szczenię można przymocować na miejscu za pomocą plastra, ręcznie ustabilizować głowę szczeniaka i mocno pociągnąć skórę, aby się nie poruszała.

Następnie poruszaj się po anatomicznych punktach orientacyjnych czaszki, takich jak szew lambda, i drugą ręką wybierz powtarzalny punkt wstrzyknięcia, delikatnie wbij igłę przez czaszkę. Nie naciskaj mocno, jeśli igła nie przebija łatwo czaszki. Zamiast tego zmień położenie igły i delikatnie spróbuj ponownie.

Głębokość wstrzyknięcia różni się nieznacznie u poszczególnych zwierząt i szczepów kory, zwykle działa głębokość od pół do jednego milimetra. Teraz wstrzyknij roztwór wirusa, prosząc kolegę o aktywację pompy, aby zminimalizować ruchy dłoni. Idealnie byłoby, gdyby do uruchomienia pompy po wstrzyknięciu można było użyć pedału nożnego.

Trzymaj igłę na miejscu przez kilka sekund, a następnie utrzymuj głowę szczeniaka nieruchomo płynnie. Wysunąć igłę. Teraz pozwól szczeniakowi dojść do siebie przez pięć do 10 minut na przykrytej płycie grzejnej.

W tym czasie kontynuuj wstrzykiwanie innym szczeniętom. Kiedy wszystkie szczenięta odzyskają różowy kolor i wszystkie się poruszają, delikatnie przetrzyj je porcją domowej ściółki. Tylko wtedy mogą zostać zwrócone matce.

W przeciwnym razie mogą być traktowane jako nieznane szczenięta, które matka najprawdopodobniej zabije po zwróceniu szczeniąt matce. Zestaw do wstrzykiwań należy oczyścić, całkowicie napełniając strzykawkę acetonem lub 70% etanolem. Jeśli używane są składniki wrażliwe na aceton, takie jak sano, acurate, kleje, należy kilkakrotnie przepłukać roztwór przez zestaw do wstrzykiwań, za każdym razem używając świeżego roztworu.

Spowoduje to usunięcie pozostałego roztworu wirusa i wytrąci rozpuszczalniki, które odparują. Po wypłukaniu zestawu zdezynfekuj obszar roboczy wybielacza, aby pozostawić go gotowym dla następnego eksperymentatora. Mentor. Skuteczna technika powoduje silną infekcję neuronalną w miejscu wstrzyknięcia.

Wstrzyknięcia w określone regiony, takie jak kora mózgowa i wzgórek górny, zazwyczaj generują miejscowe infekcje z minimalnym rozprzestrzenianiem się na sąsiednie regiony. Stosowanie roztworu wirusa o wysokim mianie zwiększa prawdopodobieństwo wstrzyknięcia sąsiedniego obszaru, takiego jak hipokamp, za pomocą roztworu wirusa o niskim mianie. Powoduje rzadkie zakażenie, zwykle w pobliżu miejsca wstrzyknięcia, takie jak wstrzyknięcie móżdżku w linii środkowej, liczba zakażonych komórek powinna korelować z mianem wstrzykniętego roztworu wirusowego.

Na przykład, wstrzyknięcie mieszaniny roztworów o wysokim mianie dwóch wirusów R AAV eight eksprymujących różne białka fluorescencyjne do móżdżku, infekuje wiele komórek kinji, które są różnie znakowane. I odwrotnie, wstrzyknięcie roztworu wirusa o niskim mianie może spowodować rzadką infekcję, która pomoże w wizualizacji pojedynczych komórek. Znakowane fluorescencyjnie neurony można obserwować bezpośrednio w świeżo wyciętej żywej tkance lub można je poddać barwieniu immunologicznemu.

Wzmacnia to endogenne sygnały fluorescencyjne do późniejszej akwizycji obrazu za pomocą szerokokątnej lub konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Wreszcie, RAAV eight jest zdolny do infekowania różnych typów neuronów w korze mózgowej z silnym znakowaniem drobnych procesów Po opanowaniu tej techniki można wykonać w około 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.