Analiza mozaiki funkcji genów w pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy przy użyciu rekombinacji Cre opartej na wirusach
1 sierpnia 2011
Opisano metodę in vivo do badania funkcji genów w mózgu po urodzeniu. Rekombinowane AAV wykazujące ekspresję Cre i/lub białka fluorescencyjnego wstrzykuje się do mózgu noworodka myszy. Osiągnięto mozaikową inaktywację genów i rzadkie znakowanie neuronów, co pozwala na szybką analizę funkcji genów w procesach krytycznych dla rozwoju obwodów nerwowych.
Ogólnym celem tej procedury jest manipulowanie funkcją genów w okresie poporodowym rozwoju mózgu. Osiąga się to poprzez wybór i przygotowanie odpowiednich wirusów, załadowanie ich do strzykawki i przygotowanie sprzętu do wstrzykiwań. Następnie wirus jest wstrzykiwany do mózgów nowonarodzonych szczeniąt myszy, a ostatnim krokiem jest złożenie zwierząt w ofierze i zobrazowanie wstrzykniętych obszarów.
Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują różnicowe znakowanie komórek kontrolnych i nokautujących za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, w jaki sposób okres rozwoju pourodzeniowego jest regulowany genetycznie. Do wstrzykiwań można użyć dostępnego na rynku roztworu wirusa związanego z adenowirusem przy pełnym mianie, zwykle od 10 do 12, kopii genomu na mililitr w celu manipulowania dużą liczbą komórek.
Jeśli pożądane jest rozrzedzenie lub etykietowanie, zacznij od rozcieńczenia od jednego do 10. Po rozmrożeniu wirusa na lodzie należy natychmiast przenieść objętość wstępnego rozcieńczenia do sterylnej probówki PCR o pojemności 250 mikrolitrów. Utrzymuj rozcieńczenie na lodzie. Teraz.
Przygotować pompę wtryskową, wybierając odpowiednią strzykawkę i podłączając ją do igły wprowadzającej. Następnie delikatnie narysuj roztwór wirusa, aż w strzykawce pojawi się bardzo mały pęcherzyk powietrza i można użyć obojętnego barwnika ładującego, aby ułatwić ten krok. Teraz przymocować strzykawkę do pompy za pomocą elementu ustalającego.
Następnie delikatnie przymocować rurkę łączącą między strzykawką a uchwytem igły. Należy upewnić się, że igła do wstrzykiwań znajduje się w bezpośrednim kontakcie z rurką łączącą znajdującą się wewnątrz uchwytu igły. Teraz powoli przesuwaj roztwór przez rurkę łączącą, aż na końcu igły będzie widoczna niewielka kropla roztworu.
Ostrożnie zabezpiecz tłok obok bloku popychacza za pomocą wspornika na pompie. Ustaw szybkość wtryskiwania na osiem mikrolitrów na minutę i ustaw objętość wtrysku na od jednego do dwóch mikrolitrów. Następnie dostosuj ustawienie średnicy strzykawki pompy, aby dopasować ją do średnicy strzykawki, której używasz.
Na koniec, aby chronić szczenięta podczas fazy rekonwalescencji, ustaw płytę grzejną na 38 stopni Celsjusza i przykryj ją ręcznikiem papierowym. Korzystając z zatwierdzonego przez IACUC protokołu, przygotuj młode myszy P zero lub P one do wstrzyknięcia, poddając je zimnemu znieczuleniu. Zwilż wodą kilka ręczników papierowych i połóż je na lodzie.
Następnie umieść cztery lub pięć szczeniąt na ręczniku papierowym, dobrze oddzielone. Złóż ręczniki papierowe na szczeniętach, delikatnie połóż niewielką ilość pokruszonego lodu na ręcznikach papierowych i wysiaduj szczenięta przez około pięć minut. Szczenięta mogą być bezpiecznie trzymane na lodzie do 15 minut i nadal mają dobrą regenerację.
Teraz umieść znieczulone szczenię na bloku montażowym, aby uzyskać najlepszy dostęp do miejsca wstrzyknięcia. Na przykład dostęp do kory mózgowej jest najłatwiejszy, gdy zwierzę kładzie się płasko na brzuchu. Szczenię można przymocować na miejscu za pomocą plastra, ręcznie ustabilizować głowę szczeniaka i mocno pociągnąć skórę, aby się nie poruszała.
Następnie poruszaj się po anatomicznych punktach orientacyjnych czaszki, takich jak szew lambda, i drugą ręką wybierz powtarzalny punkt wstrzyknięcia, delikatnie wbij igłę przez czaszkę. Nie naciskaj mocno, jeśli igła nie przebija łatwo czaszki. Zamiast tego zmień położenie igły i delikatnie spróbuj ponownie.
Głębokość wstrzyknięcia różni się nieznacznie u poszczególnych zwierząt i szczepów kory, zwykle działa głębokość od pół do jednego milimetra. Teraz wstrzyknij roztwór wirusa, prosząc kolegę o aktywację pompy, aby zminimalizować ruchy dłoni. Idealnie byłoby, gdyby do uruchomienia pompy po wstrzyknięciu można było użyć pedału nożnego.
Trzymaj igłę na miejscu przez kilka sekund, a następnie utrzymuj głowę szczeniaka nieruchomo płynnie. Wysunąć igłę. Teraz pozwól szczeniakowi dojść do siebie przez pięć do 10 minut na przykrytej płycie grzejnej.
W tym czasie kontynuuj wstrzykiwanie innym szczeniętom. Kiedy wszystkie szczenięta odzyskają różowy kolor i wszystkie się poruszają, delikatnie przetrzyj je porcją domowej ściółki. Tylko wtedy mogą zostać zwrócone matce.
W przeciwnym razie mogą być traktowane jako nieznane szczenięta, które matka najprawdopodobniej zabije po zwróceniu szczeniąt matce. Zestaw do wstrzykiwań należy oczyścić, całkowicie napełniając strzykawkę acetonem lub 70% etanolem. Jeśli używane są składniki wrażliwe na aceton, takie jak sano, acurate, kleje, należy kilkakrotnie przepłukać roztwór przez zestaw do wstrzykiwań, za każdym razem używając świeżego roztworu.
Spowoduje to usunięcie pozostałego roztworu wirusa i wytrąci rozpuszczalniki, które odparują. Po wypłukaniu zestawu zdezynfekuj obszar roboczy wybielacza, aby pozostawić go gotowym dla następnego eksperymentatora. Mentor. Skuteczna technika powoduje silną infekcję neuronalną w miejscu wstrzyknięcia.
Wstrzyknięcia w określone regiony, takie jak kora mózgowa i wzgórek górny, zazwyczaj generują miejscowe infekcje z minimalnym rozprzestrzenianiem się na sąsiednie regiony. Stosowanie roztworu wirusa o wysokim mianie zwiększa prawdopodobieństwo wstrzyknięcia sąsiedniego obszaru, takiego jak hipokamp, za pomocą roztworu wirusa o niskim mianie. Powoduje rzadkie zakażenie, zwykle w pobliżu miejsca wstrzyknięcia, takie jak wstrzyknięcie móżdżku w linii środkowej, liczba zakażonych komórek powinna korelować z mianem wstrzykniętego roztworu wirusowego.
Na przykład, wstrzyknięcie mieszaniny roztworów o wysokim mianie dwóch wirusów R AAV eight eksprymujących różne białka fluorescencyjne do móżdżku, infekuje wiele komórek kinji, które są różnie znakowane. I odwrotnie, wstrzyknięcie roztworu wirusa o niskim mianie może spowodować rzadką infekcję, która pomoże w wizualizacji pojedynczych komórek. Znakowane fluorescencyjnie neurony można obserwować bezpośrednio w świeżo wyciętej żywej tkance lub można je poddać barwieniu immunologicznemu.
Wzmacnia to endogenne sygnały fluorescencyjne do późniejszej akwizycji obrazu za pomocą szerokokątnej lub konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Wreszcie, RAAV eight jest zdolny do infekowania różnych typów neuronów w korze mózgowej z silnym znakowaniem drobnych procesów Po opanowaniu tej techniki można wykonać w około 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę in vivo do badania funkcji genów podczas rozwoju mózgu po urodzeniu przy użyciu rekombinantnych AAV. Wstrzykując te wirusy do mózgów noworodków myszy, naukowcy mogą uzyskać mozaikową inaktywację genów i rozrzedzone oznaczanie neuronów, ułatwiając analizę funkcji genów w rozwoju obwodów neuronowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Funkcja genu
- Rozwój obwodów neuronowych
Tło
- Zrozumienie funkcji genów podczas rozwoju mózgu po urodzeniu jest kluczowe.
- Rekombinantowe AAV mogą być używane do manipulacji ekspresją genów.
- Ta metoda pozwala na badanie regulacji genetycznej w krytycznych okresach rozwojowych.
- Mikroskopia immunofluorescencyjna może rozróżnić między komórkami kontrolnymi a knockout.
Cel badania
- Manipulowanie funkcją genu w okresie rozwoju mózgu po urodzeniu.
- Badanie, jak czynniki genetyczne regulują rozwój neuronowy po urodzeniu.
- Dostarczenie wglądu w mechanizmy leżące u podstaw formowania obwodów neuronowych.
Zastosowane metody
- Selekcja i przygotowanie odpowiednich rekombinantnych AAV.
- Wstrzyknięcie wirusów do mózgów noworodków myszy.
- Mikroskopia immunofluorescencyjna do obrazowania wstrzykniętych regionów.
- Analiza różnicowego oznaczania komórek kontrolnych i knockout.
Główne wyniki
- Udane osiągnięcie inaktywacji genów i oznaczania neuronów.
- Wyniki pokazują genetyczną regulację rozwoju po urodzeniu.
- Metoda zapewnia ramy dla przyszłych badań neuronaukowych.
- Uzyskane wglądy mogą informować o rozumieniu dynamiki obwodów neuronowych.
Wnioski
- Ta metoda jest skuteczna w badaniu funkcji genów w rozwijającym się mózgu.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia rozwoju obwodów neuronowych.
- Przyszłe badania mogą budować na tym podejściu do eksploracji wpływów genetycznych na zachowanie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, scalable interrogation of gene function in postnatal brain development, addressing a critical gap in target validation for neurodevelopmental disorders. By bypassing embryonic lethality constraints, it supports mechanistic de-risking of therapeutic targets in pathways relevant to autism and schizophrenia. The approach provides predictive confidence in target selection by linking genetic perturbation to circuit-level phenotypes in a physiologically relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in postnatal neural circuits where many neurodevelopmental disorder genes exert their effects.
- Operational Value: Achieves mosaic gene inactivation and sparse labeling within days, avoiding months-long conditional mouse model generation.
- Scientific Value: Supports cell-autonomous functional analysis of genes implicated in axonal growth, dendritic tiling, and synapse refinement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively comparable control and knockout cell populations via differential fluorescent labeling for side-by-side phenotypic assessment.
- Operational Value: Permits titration of viral titer to modulate infection density, enabling scalable sparse or dense labeling as needed for downstream assays.
- Scientific Value: Compatible with immunofluorescence and electrophysiology readouts, facilitating multimodal validation of target engagement and circuit impact.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models postnatal genetic perturbation in mice and rats, aligning with the developmental timing of human neuropsychiatric disorder onset.
- Operational Value: Extends to lentiviral delivery and shRNA/dominant-negative constructs, broadening target modulation toolkit for preclinical validation.
- Scientific Value: Enables study of gene function in critical processes like synapse formation, directly relevant to pathophysiological mechanisms in psychiatric disorders.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting target validation and lead identification by providing causal genetic evidence in postnatal neural circuits prior to compound screening.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by deleting candidate genes in defined brain regions to assess phenotypic consequences on neural circuit maturation.
- Screening: Produces standardized, reproducible neuronal preparations with internal controls (labeled vs. unlabeled cells) for reliable compound effect measurement.
- Analytics: Generates quantitative imaging and electrophysiology readouts that enable statistical comparison of genotypes and treatment conditions.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to circuit-level outcomes, supporting biomarker-aligned preclinical validation of target modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable viral delivery platform applicable across multiple gene targets and brain regions, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation by linking postnatal gene loss to specific circuit phenotypes.
- Operational Value: Standardizes gene perturbation via viral delivery, improving reproducibility across laboratories and studies.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by rapidly establishing genetic causality in disease-relevant postnatal windows.
- Portfolio Impact: De-risks target advancement by providing functional evidence in systems that model human neurodevelopmental timing.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal mouse handling, stereotaxic injection, and viral biosafety protocols.
- Dependent on access to purified recombinant AAV or lentiviral vectors and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of viral titer, injection volume, and anesthesia procedures for cross-study consistency.
- Adaptation to different brain regions or species may require optimization of injection coordinates and viral serotype tropism.
- Practical limitation: Efficacy depends on Cre recombinase efficiency and floxed allele availability, which may vary across targets.
