Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy
22 grudnia 2014
Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.
Celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja rozwoju obwodów nerwowych w embrionalnym mózgu myszy przy użyciu trzech odrębnych systemów znakowania komórek za pomocą znacznika transsynaptycznego, który porusza się dwukierunkowo, drugiego znacznika, który porusza się tylko w sposób wsteczny i trzeciej etykiety, która nie przemieszcza się z komórki docelowej. Możliwe jest zidentyfikowanie neuronu docelowego, neuronów znajdujących się w górze i w dół. Wyniki pokazują, że ten eksperymentalny protokół może być wykorzystany do analizy tworzenia się obwodów nerwowych w embrionalnym mózgu samicy myszy w rozdzielczości pojedynczej komórki.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuronauki rozwojowej, np. kiedy powstają określone obwody neuronalne i jak są one zorganizowane podczas rozwoju embrionalnego. Metoda ta może być również stosowana do śledzenia obwodów neuronalnych u dorosłych myszy. W szczególności może być wykorzystany do analizy aktywności synaptycznej między genetycznie zidentyfikowanymi neuronami i może być wykorzystany do analizy, w jaki sposób różne warunki eksperymentalne mogą modulować obwód neuronalny w czasie.
Zacznij od myszy, która została poddana eutanazji w ciąży. Oczyść brzuszną stronę jej brzucha 70% etanolem, a następnie wykonaj pionowe nacięcie, aby odsłonić zarodki. Usuń łańcuch zarodków i przenieś je do naczynia z lodowatym PBS w naczyniu.
Usuń poszczególne zarodki za pomocą stępionych kleszczy. Oddziel poszczególne zarodki w roztworze za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy, usuwając dodatkową tkankę w procesie, gdy zarodki zostaną całkowicie oczyszczone. Weź małą biopsję ogona z każdego zarodka i umieść w probówce z buforem do lizy, aby pobrać DNA do identyfikacji płci i genotypowania.
Następnie przenieś zarodek do świeżo przygotowanego lodowatego 4% PFA na lodzie. Po przetworzeniu każdego zarodka pozwól im inkubować w PFA z mieszaniem przez co najmniej 1,5 godziny, w zależności od ich wielkości. Po zakończeniu inkubacji.
Umyj utrwalone chusteczki trzy razy lodowatym PBS przez co najmniej pięć minut na pranie. Następnie przenieś zarodki do 30% roztworu sacharozy, utrzymywanego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Gdy tkanki są całkowicie zanurzone w roztworze, przystąp do kriosekcji.
Najpierw zacznij od oznaczenia formy kriogenicznej za pomocą trwałego markera odpornego na alkohol. Następnie przygotuj zawiesinę pokruszonego suchego lodu w 100% etanolu w wiaderku na lód, używając zawiesiny, schłodzić szklaną zlewkę z izop pentanem przez około 10 minut. Czekając, wyjmij tkanki z roztworu sacharozy i zetrzyj nadmiar sacharozy standardową chusteczką laboratoryjną.
Następnie przenieś tkankę do wstępnie oznakowanej formy kriogenicznej. Z wystarczającą ilością OCT, aby pokryć tkankę. Nie twórz żadnych pęcherzyków powietrza w OCT, zwłaszcza wokół tkanki.
Następnie zorientuj tkankę za pomocą kleszczy entomologicznych o masie pióra, aby spowodować minimalne uszkodzenia. Zamroź formy kriogeniczne w schłodzonej kąpieli iso pentanowej, nie powodując rozprysków, jeśli to konieczne. Zamrożone formy można owinąć i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby podzielić formy na sekcje.
Pokrój je na odcinki szeregowe o grubości 14 mikronów w seriach po pięć. Zbierz każdą serię pięciu plasterków na szkiełku super frost plus. Przygotowując roztwór do tego protokołu, należy pamiętać, aby powoli dodawać tween 20 do bufora TNT, który musi być przygotowany na świeżo.
Następnie powoli spłukuj roztwór w górę iw dół, aby wymieszać. Przygotowując bufor TNB, powoli dodawać odczynnik blokujący małymi porcjami, mieszając. Następnie podgrzej roztwór do 55 stopni Celsjusza za pomocą łaźni wodnej.
Roztwór stanie się mleczny. Teraz, aby rozpocząć pracę nad tkankami, najpierw użyj skalpela, aby usunąć nadmiar OCT otaczający sekcje tkanki. Następnie zaznacz granice każdej sekcji za pomocą długopisu.
Niech szkiełka osiągną temperaturę pokojową. Następnie umyj je w temperaturze pokojowej w jednym buforze XPBS, trzy razy każde pranie powinno trwać pięć minut. Następnie wygasić endogenną aktywność peroksydazy, inkubując szkiełka przez pół godziny w lodowatym zimnym, 0,3% nadtlenku wodoru w metanolu.
Następnie wykonaj trzy prania w PBS w temperaturze pokojowej przez pięć minut na pranie. Następnie inkubować szkiełka przez 10 minut w PBST, aby przepuścić tkanki. Tym razem umyj szkiełka trzykrotnie TNT.
Teraz w nawilżonej komorze zablokuj tkankę w ilości TNB, aby pokryć każde szkiełko. Pozostaw blok na pół godziny w temperaturze pokojowej. Nie pozwól, aby szkiełka wyschły.
Po opróżnieniu buforu blokującego należy całkowicie przykryć szkiełko przeciwciałem pierwszorzędowym w TNB, aby związać znacznik. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby usunąć przeciwciało pierwszorzędowe, należy przemyć szkiełko trotylem trzy razy w temperaturze pokojowej przez pięć minut na mycie.
Podczas tych prań delikatnie mieszaj. Następnie inkubuj skrawki w wtórnym roztworze przeciwciała przez godzinę. Później w temperaturze pokojowej użyj trzech płukanek TNT, aby usunąć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe.
Następnie w wilgotnej komorze inkubować tkanki w jednej do 100 pozbawionych beszyny sprzężonej z chrzanem peroksydazie chrzanowej w TNB przez 30 minut w temperaturze pokojowej, myjąc szkiełka w TNT. Po inkubacji należy ponownie rozcieńczyć roztwór TSA. Teraz nałóż świeżo przygotowane rozcieńczenie TSA na tkanki dokładnie przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Dokładny czas inkubacji TSA ma kluczowe znaczenie. Dlatego nie próbuj przetwarzać zbyt wielu szkiełek na raz w naszej dłoni. W jednym kroku można obsłużyć do 10 slajdów.
Dodatkowe preparaty mogą czekać w buforze TNT do momentu przetworzenia Po kolejnej rundzie prania. Inkubuj tkanki z jedną do 500 podłogą Alexa 5 46 pozbawioną pasków. Trzymaj go w koniugatu w TNB przez 30 minut.
W temperaturze pokojowej usunąć sprzężony z ogołoconego mieszkańca trzema kolejnymi kąpielami TNT. Następnie w celu barwienia jądrowego nałóż 5% roztwór benzy BIS w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut, usuń plamę benzo BIS za pomocą trzech płukań TNT. Następnie zamontuj szkiełka za pomocą uchwytu fluoro Mount G i przystąp do ich analizy.
Za pomocą opisanego protokołu analizowano dojrzewanie obwodów nerwowych regulujących oś rozrodczą u myszy będących nosicielami alleli R 26 BIZ i R 26 GTT. Ekspresja transgenów była aktywowana przez rekombinację zależną od creeda w embrionalnych neuronach kisspeptyny w jądrze łukowatym przy użyciu podwójnej immunofluorescencji linii kierowcy Kisspeptin specyficznej dla Kisspeptin dla kisspeptyny na zielono i BL na czerwono z pocałunku. IC R 26 BIZ.
Mysz pokazuje aktywację BL w KISS IC R 26 GTT Podwójna immunofluorescencja myszy pokazuje KISSPEPTIN na zielono, a GTT aktywowaną przez sterownik Cree na czerwono. Te i inne badania diagnostyczne wykazały, że transgeny były funkcjonalne w eksperymentalnych zarodkach E 18,5. Okazało się, że jego neurony pepinowe w jądrze łukowatym komunikują się już z GNRH.
Neurony pozbawione Z były ograniczone do CRE wyrażającego neurony kisspeptyny, podczas gdy BL był transsynaptycznie przenoszony do neuronów w górę i w dół. Niektóre, ale nie wszystkie. Neurony GNRH zawierały bl.
Tak więc tylko podzbiór embrionalnych neuronów GNRH jest synaptycznie połączony z neuronami kisspeptyny jądra łukowatego. Neurony GNRH nie zawierały znacznika wstecznego. GTT wykazuje, że neurony te znajdują się za neuronami kisspeptyny.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego dnia po tej procedurze. Inne metody, takie jak podwójna immunofluorescencja, mogą być wykorzystane do identyfikacji biochemicznej natury połączonych neuronów. Technika ta powinna utorować drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii i biologii rozwoju do zbadania połączeń neuronalnych z rozdzielczością pojedynczej komórki zarówno podczas rozwoju, jak i u dorosłych zwierząt.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować powstawanie i dojrzewanie obwodów nerwowych u myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół śledzenia obwodów neuronalnych w embrionalnym mózgu myszy z wykorzystaniem genetycznie kodowanych markerów transsynaptycznych. Metoda ta umożliwia wizualizację rozwoju obwodów neuronalnych z rozdzielczością pojedynczej komórki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwoju
- Obwody neuronalne
Wprowadzenie
- Zrozumienie procesu tworzenia obwodów neuronalnych jest kluczowe dla neurobiologii rozwoju.
- Tracery transsynaptyczne umożliwiają badanie łączności neuronów.
- Zarodekowy mózg myszy służy jako model do badania rozwoju układu nerwowego.
- Produkcja tracerów specyficznych dla danych komórek pozwala na przeprowadzenie ukierunkowanej analizy.
Cel badania
- Wizualizacja rozwoju obwodów neuronalnych w embrionalnym mózgu myszy.
- Analiza organizacji specyficznych obwodów neuronalnych podczas rozwoju.
- Przedstawienie protokołu możliwego do zastosowania zarówno u myszy embrionalnych, jak i dorosłych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie trzech różnych systemów znakowania komórek.
- Zastosowanie dwukierunkowego znacznika transsynaptycznego.
- Użycie znacznika retrogradnego oraz znacznika niestacjonarnego.
- Analiza obwodów neuronalnych z rozdzielczością pojedynczej komórki.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie identyfikuje neurony przedsynaptyczne i postsynaptyczne.
- Wyniki wykazują formowanie się obwodów neuronalnych w embrionalnym mózgu samicy myszy.
- Metoda umożliwia analizę aktywności synaptycznej w genetycznie zidentyfikowanych neuronach.
- Pozwala ona na badanie wpływu warunków eksperymentalnych na obwody neuronalne w czasie.
Wnioski
- Niniejszy protokół eksperymentalny jest skuteczny w badaniu rozwoju obwodów neuronalnych.
- Pozwala on na uzyskanie wiedzy na temat czasu powstania i organizacji obwodów neuronalnych.
- Metoda ta jest wszechstronna i znajduje zastosowanie zarówno w analizie obwodów neuronalnych embrionalnych, jak i dorosłych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zrozumienie procesu formowania obwodów neuronalnych podczas rozwoju embrionalnego dostarcza mechanistycznych informacji na temat zaburzeń neurorozwojowych i wspiera walidację punktów uchwytu w procesie odkrywania leków ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy. Ta metoda genetycznie kodowanego śledzenia transsynaptycznego umożliwia zależne od aktywności mapowanie połączeń synaptycznych z rozdzielczością pojedynczych komórek, oferując odtwarzalny system ograniczania ryzyka w przypadku hipotez terapeutycznych związanych z łącznością neuronalną. Dzięki wyeliminowaniu konieczności wstrzykiwania stereotaktycznego, metoda ta zwiększa standaryzację i skalowalność w różnych punktach czasowych rozwoju oraz w różnych backgroundach genetycznych, co pozwala na spójne przygotowanie testów do badań nad zaangażowaniem celu terapeutycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację łączności synaptycznej między genetycznie zdefiniowanymi populacjami neuronów w krytycznych okresach rozwoju.
- Wartość operacyjna: Zapewnia genetycznie kodowany system bez konieczności iniekcji, który gwarantuje spójną ekspresję znacznika i zmniejsza zmienność w eksperymentach z mapowania obwodów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, zależne od aktywności odczyty sygnałów transsynaptycznych, które odzwierciedlają funkcjonalną komunikację synaptyczną między neuronami aferentnymi a eferentnymi.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testów dzięki zależnej od Cre, specyficznej dla locus ekspresji z locus ROSA26, co umożliwia powtarzalne przygotowanie tkanki nerwowej do dalszych analiz.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego, umożliwiając badaczom śledzenie, w jaki sposób zaburzenia genetyczne lub farmakologiczne wpływają na tworzenie się obwodów neuronalnych w czasie w modelach embrionalnych istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Oferuje kompatybilny z platformą przepływ pracy, który może zostać zintegrowany z immunofluorescencją, genotypowaniem i potokami obrazowania w celu wieloparametrycznej walidacji oddziaływania na cel.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wspiera przepływy pracy we wczesnej fazie odkrywania leków, umożliwiając mapowanie obwodów w oparciu o postawione hipotezy jeszcze przed identyfikacją związku wiodącego, a uzyskane wyniki dostarczają informacji na temat pewności wyboru celu oraz gotowości do przesiewania fenotypowego w programach badań nad rozwojem neurologicznym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wizualizację formowania się i dojrzewania specyficznych obwodów neuronalnych, takich jak obwody regulujące oś rozrodczą, z rozdzielczością pojedynczych komórek.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie standaryzowanych, genetycznie śledzalnych układów neuronalnych odpowiednich do oceny wpływu związków na łączność synaptyczną w mózgach embrionalnych lub dorosłych.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty oparte na fluorescencji (np. transfer sygnału BL, GTT), które pozwalają na porównanie aktywności synaptycznej w różnych warunkach, genotypach lub etapach rozwoju.
- Badania translacyjne: Łączy embrionalne formowanie się obwodów z funkcjami postnatalnymi, umożliwiając podłużną analizę tego, jak wczesne zaburzenia rozwojowe wpływają na łączność neuronalną u osobników dorosłych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Podwójne szczepy z knock-in ROSA26 stanowią wielokrotnie wykorzystywalną platformę genetyczną, którą można zastosować w wielu celach w OUN i modelach chorób bez konieczności powtarzania interwencji chirurgicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów poprzez dostarczenie bezpośrednich, zależnych od aktywności dowodów na łączność synaptyczną między genetycznie zdefiniowanymi populacjami neuronów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i redukuje zmienność techniczną dzięki ekspresji zależnej od Cre i kontrolowanej przez locus, co eliminuje niespójności wynikające z procesu iniekcji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w wyborze celów w OUN, umożliwiając wczesną wizualizację efektów modulacji genetycznej lub farmakologicznej na poziomie obwodów neuronalnych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera optymalizację ryzyka w procesie rozwoju poprzez generowanie danych mechanistycznych na temat formowania się obwodów neuronalnych, co pozwala na priorytetyzację celów w wskazaniach neurorozwojowych i psychiatrycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu embriologii myszy, genotypowania i mikroskopii fluorescencyjnej w celu prawidłowej manipulacji zarodkami, ich sekcjonowania oraz detekcji sygnału.
- Metoda jest zależna od dostępności linii Cre-driver oraz fluorescencyjnych systemów reporterowych do specyficznego znakowania komórek i walidacji multimodalnej.
- Konieczne jest zastosowanie zestandaryzowanych protokołów fiksacji, kriosekcjonowania i immunohistochemii, aby zachować sygnał znacznika i zapewnić powtarzalną jakość przekrojów.
- Adaptacja w różnych systemach modelowych zależy od zachowania funkcjonalności znacznika transsynaptycznego oraz specyficzności promotora u gatunków innych niż myszy.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność transferu znacznika od aktywności synaptycznej, co może wpływać na czułość w obwodach o niskiej aktywności lub niedojrzałych.
