Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja rozwoju obwodów nerwowych w embrionalnym mózgu myszy przy użyciu trzech odrębnych systemów znakowania komórek za pomocą znacznika transsynaptycznego, który porusza się dwukierunkowo, drugiego znacznika, który porusza się tylko w sposób wsteczny i trzeciej etykiety, która nie przemieszcza się z komórki docelowej. Możliwe jest zidentyfikowanie neuronu docelowego, neuronów znajdujących się w górze i w dół. Wyniki pokazują, że ten eksperymentalny protokół może być wykorzystany do analizy tworzenia się obwodów nerwowych w embrionalnym mózgu samicy myszy w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuronauki rozwojowej, np. kiedy powstają określone obwody neuronalne i jak są one zorganizowane podczas rozwoju embrionalnego. Metoda ta może być również stosowana do śledzenia obwodów neuronalnych u dorosłych myszy. W szczególności może być wykorzystany do analizy aktywności synaptycznej między genetycznie zidentyfikowanymi neuronami i może być wykorzystany do analizy, w jaki sposób różne warunki eksperymentalne mogą modulować obwód neuronalny w czasie.

Zacznij od myszy, która została poddana eutanazji w ciąży. Oczyść brzuszną stronę jej brzucha 70% etanolem, a następnie wykonaj pionowe nacięcie, aby odsłonić zarodki. Usuń łańcuch zarodków i przenieś je do naczynia z lodowatym PBS w naczyniu.

Usuń poszczególne zarodki za pomocą stępionych kleszczy. Oddziel poszczególne zarodki w roztworze za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy, usuwając dodatkową tkankę w procesie, gdy zarodki zostaną całkowicie oczyszczone. Weź małą biopsję ogona z każdego zarodka i umieść w probówce z buforem do lizy, aby pobrać DNA do identyfikacji płci i genotypowania.

Następnie przenieś zarodek do świeżo przygotowanego lodowatego 4% PFA na lodzie. Po przetworzeniu każdego zarodka pozwól im inkubować w PFA z mieszaniem przez co najmniej 1,5 godziny, w zależności od ich wielkości. Po zakończeniu inkubacji.

Umyj utrwalone chusteczki trzy razy lodowatym PBS przez co najmniej pięć minut na pranie. Następnie przenieś zarodki do 30% roztworu sacharozy, utrzymywanego w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Gdy tkanki są całkowicie zanurzone w roztworze, przystąp do kriosekcji.

Najpierw zacznij od oznaczenia formy kriogenicznej za pomocą trwałego markera odpornego na alkohol. Następnie przygotuj zawiesinę pokruszonego suchego lodu w 100% etanolu w wiaderku na lód, używając zawiesiny, schłodzić szklaną zlewkę z izop pentanem przez około 10 minut. Czekając, wyjmij tkanki z roztworu sacharozy i zetrzyj nadmiar sacharozy standardową chusteczką laboratoryjną.

Następnie przenieś tkankę do wstępnie oznakowanej formy kriogenicznej. Z wystarczającą ilością OCT, aby pokryć tkankę. Nie twórz żadnych pęcherzyków powietrza w OCT, zwłaszcza wokół tkanki.

Następnie zorientuj tkankę za pomocą kleszczy entomologicznych o masie pióra, aby spowodować minimalne uszkodzenia. Zamroź formy kriogeniczne w schłodzonej kąpieli iso pentanowej, nie powodując rozprysków, jeśli to konieczne. Zamrożone formy można owinąć i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby podzielić formy na sekcje.

Pokrój je na odcinki szeregowe o grubości 14 mikronów w seriach po pięć. Zbierz każdą serię pięciu plasterków na szkiełku super frost plus. Przygotowując roztwór do tego protokołu, należy pamiętać, aby powoli dodawać tween 20 do bufora TNT, który musi być przygotowany na świeżo.

Następnie powoli spłukuj roztwór w górę iw dół, aby wymieszać. Przygotowując bufor TNB, powoli dodawać odczynnik blokujący małymi porcjami, mieszając. Następnie podgrzej roztwór do 55 stopni Celsjusza za pomocą łaźni wodnej.

Roztwór stanie się mleczny. Teraz, aby rozpocząć pracę nad tkankami, najpierw użyj skalpela, aby usunąć nadmiar OCT otaczający sekcje tkanki. Następnie zaznacz granice każdej sekcji za pomocą długopisu.

Niech szkiełka osiągną temperaturę pokojową. Następnie umyj je w temperaturze pokojowej w jednym buforze XPBS, trzy razy każde pranie powinno trwać pięć minut. Następnie wygasić endogenną aktywność peroksydazy, inkubując szkiełka przez pół godziny w lodowatym zimnym, 0,3% nadtlenku wodoru w metanolu.

Następnie wykonaj trzy prania w PBS w temperaturze pokojowej przez pięć minut na pranie. Następnie inkubować szkiełka przez 10 minut w PBST, aby przepuścić tkanki. Tym razem umyj szkiełka trzykrotnie TNT.

Teraz w nawilżonej komorze zablokuj tkankę w ilości TNB, aby pokryć każde szkiełko. Pozostaw blok na pół godziny w temperaturze pokojowej. Nie pozwól, aby szkiełka wyschły.

Po opróżnieniu buforu blokującego należy całkowicie przykryć szkiełko przeciwciałem pierwszorzędowym w TNB, aby związać znacznik. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby usunąć przeciwciało pierwszorzędowe, należy przemyć szkiełko trotylem trzy razy w temperaturze pokojowej przez pięć minut na mycie.

Podczas tych prań delikatnie mieszaj. Następnie inkubuj skrawki w wtórnym roztworze przeciwciała przez godzinę. Później w temperaturze pokojowej użyj trzech płukanek TNT, aby usunąć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe.

Następnie w wilgotnej komorze inkubować tkanki w jednej do 100 pozbawionych beszyny sprzężonej z chrzanem peroksydazie chrzanowej w TNB przez 30 minut w temperaturze pokojowej, myjąc szkiełka w TNT. Po inkubacji należy ponownie rozcieńczyć roztwór TSA. Teraz nałóż świeżo przygotowane rozcieńczenie TSA na tkanki dokładnie przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Dokładny czas inkubacji TSA ma kluczowe znaczenie. Dlatego nie próbuj przetwarzać zbyt wielu szkiełek na raz w naszej dłoni. W jednym kroku można obsłużyć do 10 slajdów.

Dodatkowe preparaty mogą czekać w buforze TNT do momentu przetworzenia Po kolejnej rundzie prania. Inkubuj tkanki z jedną do 500 podłogą Alexa 5 46 pozbawioną pasków. Trzymaj go w koniugatu w TNB przez 30 minut.

W temperaturze pokojowej usunąć sprzężony z ogołoconego mieszkańca trzema kolejnymi kąpielami TNT. Następnie w celu barwienia jądrowego nałóż 5% roztwór benzy BIS w PBS w temperaturze pokojowej przez 10 minut, usuń plamę benzo BIS za pomocą trzech płukań TNT. Następnie zamontuj szkiełka za pomocą uchwytu fluoro Mount G i przystąp do ich analizy.

Za pomocą opisanego protokołu analizowano dojrzewanie obwodów nerwowych regulujących oś rozrodczą u myszy będących nosicielami alleli R 26 BIZ i R 26 GTT. Ekspresja transgenów była aktywowana przez rekombinację zależną od creeda w embrionalnych neuronach kisspeptyny w jądrze łukowatym przy użyciu podwójnej immunofluorescencji linii kierowcy Kisspeptin specyficznej dla Kisspeptin dla kisspeptyny na zielono i BL na czerwono z pocałunku. IC R 26 BIZ.

Mysz pokazuje aktywację BL w KISS IC R 26 GTT Podwójna immunofluorescencja myszy pokazuje KISSPEPTIN na zielono, a GTT aktywowaną przez sterownik Cree na czerwono. Te i inne badania diagnostyczne wykazały, że transgeny były funkcjonalne w eksperymentalnych zarodkach E 18,5. Okazało się, że jego neurony pepinowe w jądrze łukowatym komunikują się już z GNRH.

Neurony pozbawione Z były ograniczone do CRE wyrażającego neurony kisspeptyny, podczas gdy BL był transsynaptycznie przenoszony do neuronów w górę i w dół. Niektóre, ale nie wszystkie. Neurony GNRH zawierały bl.

Tak więc tylko podzbiór embrionalnych neuronów GNRH jest synaptycznie połączony z neuronami kisspeptyny jądra łukowatego. Neurony GNRH nie zawierały znacznika wstecznego. GTT wykazuje, że neurony te znajdują się za neuronami kisspeptyny.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego dnia po tej procedurze. Inne metody, takie jak podwójna immunofluorescencja, mogą być wykorzystane do identyfikacji biochemicznej natury połączonych neuronów. Technika ta powinna utorować drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii i biologii rozwoju do zbadania połączeń neuronalnych z rozdzielczością pojedynczej komórki zarówno podczas rozwoju, jak i u dorosłych zwierząt.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować powstawanie i dojrzewanie obwodów nerwowych u myszy.