Name: Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Poznaj metodę warunkowego genetycznego śledzenia transsynaptycznego w embrionalnym mózgu myszy. Technika umożliwia wizualizację rozwoju obwodów nerwowych z rozdzielczością pojedynczej komórki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Michaelowi Candlishowi za krytyczne uwagi na temat rękopisu. Projekt ten został wsparty grantami Deutsche Forschungsgemeinschaft BO1743/6 oraz SFB/TRR 152 P11 i Z02 dla Ulricha Boehma.

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez komitet ds. dobrostanu zwierząt Uniwersytetu w Hamburgu i Uniwersytetu Kraju Saary.
1. Przygotowanie i utrwalenie tkanki embrionalnej
<ol>
	<li>Zorganizuj cały sprzęt potrzebny do wypreparowania zarodków i przygotuj roztwory do późniejszego utrwalenia tkanki przed złożeniem zwierząt w ofierze. 
	UWAGA: Zawsze przygotuj świeży 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) (4% PFA w 0,1 M buforowanej soli fizjologicznej (PBS) w fosforanie, dostosuj pH do 7,4).</li>
	<li>Eutanazja ciężarnej samicy myszy w czasie za pomocą etycznie zatwierdzonej procedury.</li>
	<li>Przenieś mysz na platformę. Zwilż brzuszną stronę brzucha 70% etanolem i wykonaj pionowe nacięcie ostrymi nożyczkami, aby odsłonić jamę brzuszną.</li>
	<li>Zidentyfikuj łańcuch embrionalny i wyciągnij go ostrożnie za pomocą kleszczy i umieść w lodowatym PBS.</li>
	<li>Usuń poszczególne zarodki z łańcucha embrionalnego za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy. Usuń dodatkową tkankę wokół zarodków i umyj je w lodowatym PBS.</li>
	<li>Wykonaj małą biopsję ogona (przed przeniesieniem zarodka do PFA) i inkubuj go w buforze do lizy ogona w celu identyfikacji płci i genotypowania alleli znacznikowych PCR.</li>
	<li>Zacznij od zarodka po najbardziej bocznej stronie i przenieś każdy zarodek osobno do probówki zawierającej lodowate 4% PFA na lodzie na shakerze.</li>
	<li>Moczyć zarodki w wieku E13,5 lub młodsze przez 1,5 godziny na lodzie, ciągle wstrząsając. Moczyć zarodki w wieku E14,5 i E15,5 przez 2,5 godziny na lodzie z ciągłym potrząsaniem.</li>
	<li>W przypadku zarodków w wieku E16,5 lub starszych należy odciąć głowę i usunąć zewnętrzną skórę przed namoczeniem głowy w roztworze PFA. Główki zarodków E16,5 można moczyć przez 4,5 godziny na lodzie przy ciągłym potrząsaniu.</li>
	<li>Po odpowiednim utrwaleniu należy trzykrotnie przemyć zarodki lodowatym PBS. Przenieść zarodki do 30% sacharozy w roztworze PBS w temperaturze 4 °C, aż opadną na dno.</li>
</ol>
2. Zamrażanie
<ol>
	<li>Ułóż wszystkie materiały potrzebne przed rozpoczęciem procesu zamrażania: krioformę, rękawice kriogeniczne, szczypce entomologiczne do wagi piórkowej, marker i pastę o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.)</li>
	<li>Oznacz krioformę trwałym markerem odpornym na działanie alkoholu (wspomnij o orientacji tkanki, dacie i genotypie). Przygotuj błoto pośniegowe z pokruszonego suchego lodu i 100% etanolu w wiaderku z lodem. Umieść w środku szklaną zlewkę zawierającą izopentan. Odczekaj 10 minut, aż izopentan ostygnie.</li>
	<li>W międzyczasie usuń tkankę z roztworu sacharozy, zetrzyj nadmiar sacharozy wokół tkanki za pomocą chusteczek laboratoryjnych. Przenieś tkankę do wstępnie znakowanej krioformy z wystarczającą ilością OCT, aby pokryć tkankę. Unikaj pęcherzyków powietrza w OCT; szczególnie wokół tkanki.</li>
	<li>Zorientuj tkankę w OCT za pomocą lekkich jak piórko kleszczy entomologicznych, aby uniknąć uszkodzenia tkanki. Rozpocznij zamrażanie od przeniesienia formy kriogenicznej do wstępnie schłodzonej kąpieli izopentanowej. Nie rozpryskuj izopentanu do OCT, ponieważ nie zamarznie on prawidłowo. Zawinąć próbki w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Kriosekcja
<ol>
	<li>Wytnij cienkie odcinki szeregowe 14 μm w seriach po pięć za pomocą kriostatu i zbierz na szkiełkach SuperFrost® Plus w celu analizy immunofluorescencyjnej (IF). Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
4. Wizualizacja znacznika za pomocą protokołu TSA (Tyramide Signal Amplification)
<ol>
	<li>Przygotować i odczynniki wymagane do barwienia. Bufor Tris-NaCl-Tween (TNT) należy zawsze przygotowywać na świeżo w dniu użycia.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor TNT przy użyciu 100 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml 5 M NaCl i ddH2O do końcowej objętości 1 l. Dodać 500 μl Tween 20 za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Powoli dodawaj Tween 20 i przepłucz pipetę kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że cała Animacja 20 jest w roztworze.</li>
		<li>Przygotować bufor blokujący Tris-NaCl (TNB) przy użyciu 100 ml 1 M Tris-HCl pH 7,5, 30 ml 5 M NaCl i ddH2O do końcowej objętości 1 l. Dodawać 5 g odczynnika blokującego (dostarczonego z zestawem) powoli, małymi krokami do buforu, mieszając. Podgrzewać roztwór stopniowo do 55 °C z ciągłym mieszaniem, aby całkowicie rozpuścić odczynnik blokujący (nie powinno to trwać dłużej niż 30-60 minut). Aby uzyskać jednorodne ogrzewanie, należy użyć łaźni wodnej o temperaturze 55 °C. Roztwór będzie mleczny. Przed użyciem doprowadzić roztwór do temperatury pokojowej. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Odczynnik tyramidu biotyny (dostarczony z zestawem) w DMSO z biologii molekularnej/HPLC. W zależności od tego, który zestaw jest używany, odpowiednia ilość DMSO może się różnić. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Do analizy obwodów można wykorzystać skrawki zwierząt heterozygotycznych pod względem odpowiednich alleli Cre i R26. Jako kontrole ujemne należy użyć skrawków od rodzeństwa z miotu zawierających odpowiednio jeden allel Cre lub jeden allel R26. Preparaty kontroli negatywnej należy traktować dokładnie tak, jak preparaty pochodzące od zwierząt podwójnie heterozygotycznych. Ponadto należy dołączyć jeden preparat kontrolny od podwójnie heterozygotycznego zwierzęcia, ale pominąć odczynnik TSA (kontrola bez amplifikacji).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą ostrego, świeżego skalpela usuń nadmiar OCT otaczającego skrawki tkanki i zaznacz granicę wokół odcinków za pomocą pisaka PAP.</li>
	<li>Suszyć szkiełka przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Myj szkiełka w RT 3x z TNT przez 5 minut każda. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut w 0,3% roztworze H2O2 w lodowatym metanolu w celu wygaszenia endogennej aktywności peroksydazy.</li>
	<li>Przemyć 3x PBS przez 5 minut w RT. Inkubować przez 10 minut w 0,5% Triton-X 100 w PBS w celu przepuszczalności tkanek. Myj szkiełka w RT 3x z TNT przez 5 minut każda.</li>
	<li>Blok z TNB (roztwór blokujący, 200-300 μl na szkiełko) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Upewnij się, że wszystkie sekcje są całkowicie pokryte TNB. Nie pozwól, aby szkiełka wyschły między stopniami.</li>
	<li>Odcedzić nadmiar buforu blokującego i nałożyć pierwszorzędową surowicę przeciw rozpoznającą znacznik (1:1 000 kozi anty-WGA dla BL, 1:15 000 króliczy anty-GFP dla GTT) rozcieńczoną w TNB przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że użyjesz wystarczającej objętości, aby całkowicie pokryć wycinek tkanki (200-300 μl na szkiełko). 
	UWAGA: Zalecane tutaj podstawowe rozcieńczenia surowic odpornościowych mogą wymagać dostosowania.</li>
	<li>Myć szkiełka w RT 3x z TNT przez 5 minut każdy z mieszaniem.</li>
	<li>Inkubować skrawki z biotynylowaną drugorzędową surowicą antysurowicową, rozpoznając gospodarza pierwszej surowicy (1:500 końskie anty-kozie IgG dla anty-WGA, 1:5 000 kozie anty-królicze IgG dla anty-GFP w TNB przez 1 godzinę w RT).</li>
	<li>Myć 3x trotylem w temperaturze pokojowej przez 5 minut z mieszaniem. Inkubować w 1:100 peroksydazie chrzanowej sprzężonej ze streptawidyną (SA) (SA-HRP, dostarczoną z zestawem) w TNB przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Myj szkiełka w RT 3x z TNT przez 5 minut każda. Tymczasem rozmrozić TSA.</li>
	<li>Rozcieńczyć TSA w stosunku 1:50 w rozcieńczalniku do amplifikacji TSA (dostarczonym z zestawem; użyj zestawu TSA do wizualizacji BL i zestawu TSA+ do GTT). Inkubować skrawki tkanek w rozcieńczonym TSA dokładnie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć TSA bezpośrednio przed użyciem, najlepiej podczas poprzedniego etapu mycia, nie używać pozostałego rozcieńczonego odczynnika TSA do przyszłych eksperymentów; Zawsze przygotowuj świeże.</li>
	<li>Myć szkiełka w RT 3x z TNT przez 5 minut każdy z mieszaniem. Inkubować ze koniugatem streptawidyny Alexa Fluor® 546 w skali 1:500 w TNB przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Myć szkiełka w temperaturze RT 3x z TNT przez 5 minut każda z mieszaniem.</li>
	<li>Inkubować przez 10 minut w 5% roztworze bisbenzimidu w PBS w temperaturze pokojowej w celu barwienia jądrowego. Myć szkiełka w RT 3x z TNT przez 5 minut każdy z mieszaniem. Zamontuj za pomocą Fluromount G i wykonaj mikroskopię epifluorescencyjną lub konfokalną. 
	Rozwiązywanie problemów: Skuteczność transferu znacznika będzie zależała od poziomu ekspresji locus ROSA26 w komórkach wytwarzających (określonego przez zastosowaną linię sterownika Cre) oraz od analizowanego obwodu neuronalnego (np. liczby neuronów wytwarzających znacznik, konwergencji itp.). W związku z tym zalecane tutaj podstawowe rozcieńczenia surowic odpornościowych mogą wymagać dostosowania, aby zapobiec niskiemu lub nadmiarowi sygnału. Tło należy zawsze analizować za pomocą odpowiednich szkiełek kontrolnych (patrz wyżej).</li>
</ol>
5. τlacZ Barwienie dla odcinków embrionalnych
<ol>
	<li>Przygotować i odczynniki wymagane do barwienia. Bufor LacZ C należy zawsze przygotować na świeżo przed użyciem.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozydu (X-gal) (40 mg/ml) przez dodanie 40 g X-gal do 1 ml 70% dimetyloformamidu (DMF). Przykryj folią aluminiową i przechowuj w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy nitro niebieskiego tetrazolu (NBT) (50 mg/ml), dodając 50 g NBT do 1 ml 70% DMF. Przykryj folią aluminiową i przechowuj w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Przygotować utrwalacz LacZ, używając 80 μl 25% aldehydu glutarowego, 5 ml 4% PFA, 20 μl 1 M MgCl2, 100 μl 500 mM EGTA, 1 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7,4 i ddH2O do końcowej objętości 10 ml.</li>
		<li>Przygotować bufor LacZ A, używając 1 ml 1 M MgCl2, 5 ml 500 mM EGTA, 50 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7,4 iddH2O do końcowej objętości 500 ml.</li>
		<li>Przygotować bufor LacZ B, używając 1 ml 1 M MgCl2, 5 ml 500 mM EGTA, 5 ml 1% deoksycholanu sodu, 100 ml 10% NP-40, 50 ml 1 M buforu fosforanowego o pH 7,4 i ddH2O do końcowej objętości 500 ml.</li>
		<li>Przygotować bufor LacZ C, dodając 10 μl roztworu podstawowego NBT i 12,5 μl roztworu podstawowego X-gal do 1 ml buforu LacZ B. Przygotować świeży tuż przed użyciem i przykryć folią aluminiową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej co najmniej przez 10-15 minut (w międzyczasie przygotuj szkiełka za pomocą pisaka PAP).</li>
	<li>Przymocować odcinek utrwalaczem LacZ przez 2 minuty w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze wewnątrz dygestoria chemicznego. Przemyć 3 razy PBS uzupełnionym 2 mM MgCl2.</li>
	<li>Przepłukać szkiełka buforem LacZ A. Przepłukać szkiełka buforem LacZ A 3 razy po 10 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać szkiełka 2 razy buforem LacZ B przez 5 minut każde. Szkiełka inkubować w buforze LacZ C w temperaturze 30-37 °C przez 6 godzin lub przez noc w wilgotnej komorze. 
	UWAGA: Dodać wystarczającą objętość buforu LacZ C; Szkiełka nie powinny wysychać podczas inkubacji.</li>
	<li>Po odpowiedniej inkubacji przemyć szkiełka PBS uzupełnionym 2 mM MgCl2. Krótko spłukać skrawki za pomocą ddH2O. Szkiełko nakrywkowe żelatyną glicynową Mayera. Nadaje się do mikroskopu świetlnego wyposażonego w zestaw do obrazowania z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC).</li>
</ol>
6. Genotypowanie płci i znaczników
<ol>
	<li>Przygotować bufor do lizy ogonowej, używając 1 ml 1 M Tris-HCl pH 8,5, 100 μl 500 mM EGTA, 200 μl 10% SDS, 400 μl 5 M NaCl i ddH2O w celu uzupełnienia końcowej objętości 10 ml.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu do lizy ogona do każdej probówki Eppendorfa zawierającej biopsję ogona. Dodać proteinazę K do końcowego stężenia 100 mg/ml. Inkubować przez noc na wytrząsarce w temperaturze 55 °C.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej. Dodać 500 μl izopropanolu do supernatantu. Mieszaj przez co najmniej 5 minut, odwracając rurki w górę iw dół.</li>
	<li>Wirować w wirówce przy 17 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odlać supernatant. Dodaj 200 μl 70% etanolu. Wstrząsaj przez co najmniej 5 minut.</li>
	<li>Wirować przy 17 000 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant za pomocą Pipetmana (nie wylewać). Suszyć granulat w ciepłej komorze (37 °C) przez 15-30 min.</li>
	<li>Zawiesić granulat w 100 μl o niskim pH TE 8,0 lub w wodzie za pomocą dysz filtrowanych o szerokim otworze. Umieścić w temperaturze 55 °C na 1 godzinę i w temperaturze 37 °C na noc w celu prawidłowego rozpuszczenia. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Użyj 1 μl DNA do reakcji PCR (50 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 μl DNA ogona, 2,5 μl DMSO, 10 pM każdego startera, 25 μM każdego dNTP i 1M betainy). Startery PCR do genotypowania i identyfikacji płci są wymienione w tabeli Materiały.</li>
</ol>

<ol><li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annu. Rev. Neurosci. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+half+century+of+experimental+neuroanatomical+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A half century of experimental neuroanatomical tracing.</a> J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).</li>
<li>DeFalco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-assisted+mapping+of+neural+inputs+to+a+feeding+center+in+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Virus-assisted mapping of neural inputs to a feeding center in the hypothalamus.</a> Science. 291, 2608-2613 (2001).</li>
<li>Kumar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+arcuate+nucleus+kisspeptin+neurons+communicate+with+GnRH+neurons+in+utero%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Murine arcuate nucleus kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in utero.</a> J. Neurosci. 34, 3756-3766 (2014).</li>
<li>Horowitz, L. F., Montmayeur, J. P., Echelard, Y., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+approach+to+trace+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A genetic approach to trace neural circuits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3194-3199 (1999).</li>
<li>Maskos, U., Kissa, K., ST Cloment, C., Brulet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+trans-synaptic+transfer+of+green+fluorescent+protein+allows+the+genetic+mapping+of+neuronal+circuits+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retrograde trans-synaptic transfer of green fluorescent protein allows the genetic mapping of neuronal circuits in transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 10120-10125 (2002).</li>
<li>De Roux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogonadotropic+hypogonadism+due+to+loss+of+function+of+the+KiSS1-derived+peptide+receptor+GPR54%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-derived peptide receptor GPR54.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10972-10976 (2003).</li>
<li>Seminara, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPR54+gene+as+a+regulator+of+puberty%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The GPR54 gene as a regulator of puberty.</a> N. Engl. J. Med. 349, 1614-1627 (2003).</li>
<li>Mayer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+completion+of+puberty+in+female+mice+depend+on+estrogen+receptor+alpha-signaling+in+kisspeptin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor alpha-signaling in kisspeptin neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 22693-22698 (2010).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat. Genet. 21, 70-71 (1999).</li>
<li>Seibler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+copy+shRNA+configuration+for+ubiquitous+gene+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single copy shRNA configuration for ubiquitous gene knockdown in mice.</a> Nucleic Acids Res. 33, e67(2005).</li>
<li>Semaan, S. J., Kauffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+on+the+epigenetic+and+transcriptional+regulation+of+the+Kiss1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts on the epigenetic and transcriptional regulation of the Kiss1 gene.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 31, 452-462 (2013).</li>
<li>Feil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-activated+site-specific+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ligand-activated site-specific recombination in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10887-10890 (1996).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Ekspresja znaczników transsynaptycznych jako transgenów w celu śledzenia obwodów neuronalnych genetycznie zdefiniowanych populacji neuronów ma kilka zalet w porównaniu ze stereotaktycznym wstrzykiwaniem znaczników lub wirusów neurotopowych. Po pierwsze, znacznik jest wytwarzany jako białko endogenne i dlatego nie wywołuje żadnej odpowiedzi immunologicznej, a selektywna ścieżka neuronalna może być analizowana u różnych zwierząt z wysoką odtwarzalnością. Po drugie, ponieważ jest to metoda nieinwazyjna, można ją wykorzystać...

Anatomiczne śledzenie ścieżek jest jednym z najczęściej używanych narzędzi do rozszyfrowywania związku między mózgiem a zachowaniem1. Postęp w technologiach śledzenia obwodów neuronowych umożliwił neuronologom śledzenie obwodów neuronowych z genetycznie zidentyfikowanych populacji neuronów u myszy2. Pomimo tych postępów technicznych, nadal wyzwaniem pozostaje rozwikłanie zagadki powstawania obwodów neuronalnych, zwłaszcza podczas dojrzewania embrionalnego. Dzieje się tak, ponieważ większość opracowanych do tej pory metod śledzenia opiera się na stereotaktycznym wstrzykiwaniu znaczników transsynaptycznych lub genetycznie zmodyfikowanych wirusów neurotropowych (ryc. 1)2,3. Chociaż techniki te osiągają przestrzenną i czasową rozdzielczość połączeń, kilka nieodłącznych ograniczeń, takich jak trudne technicznie wstrzyknięcia znacznika do rozwijającego się mózgu, odtwarzalność miejsca wstrzyknięcia, potencjalny stan zapalny w miejscu wstrzyknięcia i, co najważniejsze, cytotoksyczność spowodowana przez wirusy neurotropowe, ogranicza ich zastosowanie4.
Alternatywną metodą jest ekspresja znaczników transsynaptycznych jako transgenów u genetycznie zmienionych myszy. Niedawno zmodyfikowaliśmy tę technikę i opracowaliśmy binarny genetyczny system śledzenia transsynaptycznego w celu mapowania obwodów neuronalnych dowolnej genetycznie zidentyfikowanej populacji neuronów5. Nasza strategia eksperymentalna opiera się na dwóch nowych szczepach myszy knock-in, które wyrażają albo dwukierunkową lektynę jęczmienna znacznika (BL)6, albo wsteczny znacznik fragmentu C toksyny tężcowej połączonego z GFP (GTT)7 z locus ROSA26 po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Tutaj użyliśmy tych szczepów myszy do selektywnej ekspresji BL i GTT w neuronach wytwarzających kisspeptynę, neuropeptyd, który jest zaangażowany w regulację dojrzewania osi rozrodczej8,9. Pokazujemy, że ta technika jest odpowiednia do wizualizacji rozwoju i dojrzewania obwodów nerwowych kisspeptyny podczas rozwoju embrionalnego mózgu samicy myszy5.
Strategia hodowlana
Linie znacznikowe R26-BL-IRES-τlacZ (BIZ) i R26-GFP-TTC (GTT) są szczepami knock-in5, które zawierają rekombinowane allele ROSA26. Allele R26-BIZ i R26-GTT są transkrypcyjnie ciche ze względu na obecność silnego transkrypcyjnego sygnału zatrzymania, który jest otoczony przez dwa miejsca loxP5. Ekspresja transgenu BIZ i GTT jest aktywowana przez usunięcie transkrypcji sygnału zatrzymania za pośrednictwem Cre. Allele R26-BIZ i R26-GTT mogą być używane niezależnie, po prostu krzyżując się z linią napędową Cre. Do analizy można wykorzystać zwierzęta heterozygotyczne pod względem odpowiednich alleli Cre i R26. Rózeń z miotu posiadających odpowiednio jeden allel Cre lub jeden allel R26 powinien być używany jako kontrola. Alternatywnie możliwe jest również wygenerowanie potrójnych zwierząt knock-in z allelami Cre, R26-BIZ i R26-GTT, jednak będzie to wymagało jednej dodatkowej krzyżówki.

<table><tbody><tr><td>Bisbenzimid (barwnik Hoechst 33258)</td><td>Sigma</td><td>14530-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Forma kriogeniczna (Peel-a-way)</td><td>Polyscience Inc.</td><td>18646A-1</td><td>22 x 22 x 20 mm</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimetyloformamid (DMF)</td><td>VWR Chemicals</td><td>23470,293</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ROTH</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma</td><td>G5882-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma</td><td>34988-7</td><td></td></tr><tr><td>Izopentan (metylo-2-butan)</td><td>Sigma</td><td>M32631-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser's glicyna żelatyna</td><td>Merck</td><td>1092420100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>494437-1L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ROTH</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Sigma</td><td>298-83-9</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 substytut</td><td>Fluka</td><td>743.85</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>PAP długopis</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Parafarmaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie Superfrost</td><td>Zestaw Thermo Scientific</td><td>FT4981GLPLUS</td><td></td></tr><tr><td>TSA</td><td>Zestaw PerkinElmer</td><td>NEL700</td><td></td></tr><tr><td>TSA plus zestaw</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL749A001KT</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>ROTH</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ROTH</td><td>9127.1</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>ROTH</td><td>2315.1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Cryostat</td><td>Leica</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>Light wyposażony w obrazowanie DIC</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 wyposażony w oprogramowanie</td><td></td>Axio Vision</tr><tr><td>Mikroskop Fluroscence</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 wyposażony w oprogramowanie</td><td></td>Axio Vision</tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Goat anty-WGA (rozpoznaje BL)</td><td>Wektor Laboratoria</td><td>AS-2024</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylaid koń anty-kozi IgG</td><td>Wektor Labatoria</td><td>BA-9500</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane kozy anty-królicze IgG</td><td>Vector Laboatoria</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-GFP (rozpoznaje GTT)</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-GnRH</td><td>Affinity Bio Reagent</td><td>PA1-121</td><td></td></tr><tr><td>Dylight488-osioł anty-królicze IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>SA5-10038</td><td></td></tr><tr><td>SA-Alexa Fluor 546</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Primers</td></tr><tr><td>BL Fwd (do genotypowania BIZ)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>ATGAAGATGAGCACCAGGGC</td></tr><tr><td>BL Rev (do genotypowania BIZ)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCCCTCGCCGCAGAACTC</td></tr><tr><td>Cre Fwd (do genotypowania Cre)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG</td></tr><tr><td>Cre Rev (do genotypowania Cre)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCAGGCTAAGTGCCTTCTCTCTACACCTGC</td></tr><tr><td>TTC Fwd (do genotypowania GTT)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>AGCAAGGGCGAGCTGTT</td></tr><tr><td>TTC Rev (do genotypowania GTT)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA</td></tr><tr><td>XY Fwd (do genotypowania płci)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>TGAAGCTTTTGGCTTTGA</td></tr><tr><td>XY Rev (do genotypowania płci)</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CCGCTGCCAAATTCTTTG</td></tr><tr><td>ROSA26 Fwd</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr><tr><td>ROSA26 Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>GCAGATGGAGCGGGAGAAT</td></tr><tr><td>SA Rev</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>CGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC</td></tr></tbody></table>

warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomiczne śledzenie ścieżek ma kluczowe znaczenie dla rozszyfrowania związku między mózgiem a zachowaniem. Rozwikłanie zagadki powstawania obwodów nerwowych podczas embrionalnego dojrzewania mózgu jest jednak wyzwaniem technicznym, ponieważ większość opracowanych do tej pory metod śledzenia transsynaptycznego opiera się na wstrzyknięciu znacznika stereotaktycznego. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy binarną strategię genetyczną warunkowego genetycznego śledzenia transsynaptycznego w mózgu myszy. W tym celu wygenerowaliśmy dwa komplementarne szczepy myszy knock-in, aby selektywnie eksprymować dwukierunkową transsynaptyczną lektynę jęczmienia znacznikowego (BL) i wsteczny transsynaptyczny znacznik transsynaptyczny fragment toksyny tężcowej C z locus ROSA26 po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Specyficzna dla komórki produkcja znacznika u tych myszy jest zakodowana genetycznie i nie zależy od mechanicznego wstrzyknięcia znacznika. Dlatego nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia obwodów nerwowych w embrionalnym mózgu myszy. Ponadto, ponieważ przenoszenie znacznika między synapsami zależy od aktywności synaptycznej, te szczepy myszy mogą być wykorzystywane do analizy komunikacji między genetycznie zdefiniowanymi populacjami neuronów podczas rozwoju mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół śledzenia transsynaptycznego w zarodkach myszy przy użyciu nowych rekombinowanych alleli ROSA26. Wykorzystaliśmy tę eksperymentalną technikę w celu nakreślenia obwodów neuronalnych leżących u podstaw dojrzewania osi rozrodczej w rozwijającym się mózgu samicy myszy.

W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki, jakie można uzyskać, pracując z R26-BIZ (BL-IRES-τlacZ) i oraz R26-GTT (GFP-TTC) allele. W tym przypadku wykorzystujemy R26-BIZ oraz R26-GTT allele w celu analizy dojrzewania obwodów neuronalnych regulujących oś rozrodczą. Rozród u kręgowców jest kontrolowany centralnie przez niewielką grupę neuronów w podwzgórzu, które...

Wykorzystując binarną strategię genetyczną, dostarczamy szczegółowy protokół śledzenia obwodów neuronalnych u myszy, które wyrażają komplementarne znaczniki transsynaptyczne po rekombinacji za pośrednictwem Cre. Ponieważ specyficzna dla komórki produkcja znaczników jest zakodowana genetycznie, nasze eksperymentalne podejście jest odpowiednie do badania tworzenia i dojrzewania obwodów nerwowych podczas rozwoju mysiego embrionalnego mózgu w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja rozwoju obwodów neuronalnych w embrionalnym mózgu myszy przy użyciu trzech odrębnych systemów znakowania komórek: transsynaptycznego znacznika przemieszczającego się dwukierunkowo, drugiego znacznika przemieszczającego się wyłącznie w sposób retrogradowy oraz trzeciego znacznika, który nie przemieszcza się z komórki docelowej. Pozwala to na identyfikację neuronu docelowego, neuronów powyżej (upstream) oraz neuronów poniżej (downstream). Wyniki pokazują, że ten protokół eksperymentalny może być wykorzystany do analizy formowania się obwodów neuronalnych w embrionalnym mózgu samicy myszy z rozdzielczością pojedynczej komórki.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki rozwojowej, takie jak czas formowania się konkretnych obwodów neuronalnych oraz sposób ich organizacji podczas rozwoju zarodkowego. Metoda ta może być również wykorzystywana do śledzenia obwodów neuronalnych u dorosłych myszy. W szczególności może ona służyć do analizy aktywności synaptycznej pomiędzy zidentyfikowanymi genetycznie neuronami, a także do badania, w jaki sposób różne warunki eksperymentalne mogą modulować obwód neuronalny w c

conditional-genetic-transsynaptic-tracing-in-the-embryonic-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Uwarunkowania genetyczne śledzenie transsynapticzne w mózgu zarodkowym myszy

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół elektroporacji in utero kory mózgowia oraz hipokampa u myszy w stadium E14.5. Wykazujemy również, że jest to cenna metoda badania dendrytów i kolców dendrytycznych w tych dwóch obszarach mózgu.

Wizualizacja i manipulacja genetyczna dendrytów i kolców w korze mózgu i hipokampie myszy z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Źródło: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineerical Interneuron Pregenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę wstrzykiwania wektora plazmidowego przenoszącego interesujący nas gen do progenitorów interneuronów w embrionalnym wycinku mózgu, a następnie elektroporacji w celu wejścia plazmidu i ekspresji genu. Te zmodyfikowane komórki progenitorowe mogą być później wykorzystane do leczenia zaburzeń mózgu.

Transfer genów wspomagany elektroporacją osadzony w agarozie w progenitorach interneuronów kory myszy

Jak sieci neuronowe są tworzone w embrionalnym mózgu, jest fundamentalnym pytaniem w neurobiologii rozwojowej. Połączyliśmy technikę elektroporacji z nowatorskimi narzędziami genetycznymi, takimi jak plazmidy Cre/Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac w tyłomózgowiu ptaków, aby oznaczyć interneurony grzbietowe i śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne na różnych etapach rozwoju.

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Autonomiczne funkcje genów w mózgu mogą być badane poprzez wywoływanie utraty lub utraty funkcji w rzadkich populacjach komórek. Tutaj opisujemy elektroporację in utero w celu dostarczenia rekombinazy Cre do rzadkich populacji rozwijających się neuronów korowych z floksowanymi genami, aby spowodować utratę funkcji in vivo.

Indukowanie rekombinacji Cre-lox w korze mózgowej myszy poprzez elektroporację in utero

Połączenie transmisyjnej mikroskopii elektronowej i transdukcji in utero jest potężnym podejściem do badania zmian morfologicznych w ultrastrukturze układu nerwowego podczas rozwoju. Ta połączona metoda pozwala na dogłębny wgląd w zmiany w szczegółach strukturalnych leżących u podstaw neuroplastyczności w odniesieniu do ich reprezentacji topograficznej.

Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę warunkowego genetycznego śledzenia transsynaptycznego w embrionalnym mózgu myszy. Technika umożliwia wizualizację rozwoju obwodów nerwowych z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Warunkowe genetyczne śledzenie transsynaptyczne w embrionalnym mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów