Wzbogacanie fosfopeptydów na bazie dwutlenku tytanu: metoda selektywnej izolacji fosfopeptydów z biblioteki peptydów

Fosfopeptydy to krótkie ciągi aminokwasów zawierające fosforylowane reszty seryny, treoniny lub tyrozyny. Aby wyizolować fosfopeptydy z mieszaniny peptydów, zacznij od pobrania kulek dwutlenku tytanu w probówce. Zrównoważyć w celu kondycjonowania kulek za pomocą odpowiedniego zakwaszonego buforu wiążącego zawierającego środek hartowniczy. Dodaj żądane stężenie mieszaniny peptydów do zawiesiny perełek.

Inkubuj mieszaninę, ciągle wstrząsając, aby zapobiec osiadaniu kulek. Stan kwaśny sprzyja tworzeniu wiązań koordynacyjnych z koralikami tytanu przez grupę fosforanową fosfopeptydów. Środek hartujący w buforze redukuje wszelkie niespecyficzne wiązanie niefosforylowanych peptydów z kulkami, pozostawiając je w zawiesinie.

Odwirować w celu granulacji kulek związanych z fosfopeptydem, podczas gdy niefosforylowane peptydy pozostają w supernatancie. Odrzucić supernatant. Przenieść kulki związane z fosfopeptydem do wstępnie zmontowanej kolumny filtra spinowego. Odwirować w celu usunięcia buforu wiążącego i wychwytywania kulek sprzężonych z fosfopeptydem.

Przenieś filtr do czystej rurki i dodaj roztwór zawierający amoniak. Amoniak zmienia zawiesinę na zasadową, powodując odłączanie się fosfopeptydów od kulek. Odwirować zespół w celu elucji i zebrania niezwiązanych fosfopeptydów. Kulki dwutlenku tytanu pozostają we wkładzie filtrującym. Wysuszyć fosfopeptydy, aby usunąć wszelkie ślady amoniaku.

Wstępnie kondycjonuj dwutlenek tytanu 500 mikrolitrami 100% ACN dwa razy. Następnie kondycjonuj dwutlenek tytanu 500 mikrolitrami 0,2 M buforu fosforanu sodu o pH 7 dwa razy. Na koniec użyj 300 mikrolitrów buforu równowagi, aby trzykrotnie umyć koraliki. Dodaj 400 mikrolitrów 50% ACN, 0,1% TFA do probówki o niskim poziomie wiązania białka. Następnie dodaj 84 mikrolitry kwasu mlekowego.

Przenieś zawieszone fosfopeptydy do probówki o niskim poziomie wiązania białka i inkubuj je w temperaturze pokojowej za pomocą rotatora end-over-end przez 1 godzinę. Po granulowaniu kulek użyj 300 mikrolitrów bufora równowagi, aby umyć je dwa razy i odwirować. Za pomocą 300 mikrolitrów buforu płuczącego spłucz kulki dwa razy. Następnie przenieś je do filtra wirowego o średnicy 0,2 mikrometra.

Po odwirowaniu przenieś jednostkę filtrującą do czystej 1,5-mililitrowej probówki o niskiej zawartości białka i za pomocą 200 mikrolitrów 0,9% amonu w wodzie wymyj zawartość dwa razy. Po sprawdzeniu pH należy zagęścić eluat próżniowo do sucha przez noc, aby odparować amoniak.

• Phosphopeptides - Short strings of amino acids that contain phosphorylated residues.
• Titanium Dioxide Beads - Used to isolate phosphopeptides from a peptide mix.
• Peptide Mix - A mixture of peptides used in protein analysis and research.
• Phosphopeptide Enrichment Kits - Toolkits developed for isolating and enriching phosphopeptides.
• TFA Buffer - A solution used to stabilize pH, often used in biochemistry and molecular biology.

• Introduction to Phosphopeptides - Essential constituents in protein analysis and research (e.g., phosphopeptides).
• Usage of Titanium Dioxide Beads - They isolate phosphopeptides from a peptide mix (e.g., titanium phosphate).
• Role of Phosphopeptide Enrichment Kits - Helps isolate and enrich phosphopeptides (e.g., massprep phosphopeptide enrichment kits).
• Connection to Experiment – The process of isolating and enriching phosphopeptides is central to this study.

• What is the role of phosphopeptides in a peptide mixture?
• How do titanium dioxide beads help in isolating phosphopeptides?
• What is the purpose of phosphopeptide enrichment kits in this experiment?

• Description of Practical Applications – Isolating phosphopeptides has broad applications in protein analysis and research (e.g., peptide mix).
• Identification of Industry Impact – This process is beneficial in various sectors that heavily rely on biochemistry and molecular biology (e.g., healthcare).
• Highlighting Societal Importance – Having a deeper understanding of protein analysis and research paves the way for biological advancements (e.g., sustainability).
• Link to Scientific Advancements – The innovative techniques used to isolate phosphopeptides helps advance our understanding of proteins.