Wzbogacanie fosfopeptydów na bazie dwutlenku tytanu: metoda selektywnej izolacji fosfopeptydów z biblioteki peptydów

0 views • 3:33 min • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosfopeptydy to krótkie ciągi aminokwasów zawierające fosforylowane reszty seryny, treoniny lub tyrozyny. Aby wyizolować fosfopeptydy z mieszaniny peptydów, zacznij od pobrania kulek dwutlenku tytanu w probówce. Zrównoważyć w celu kondycjonowania kulek za pomocą odpowiedniego zakwaszonego buforu wiążącego zawierającego środek hartowniczy. Dodaj żądane stężenie mieszaniny peptydów do zawiesiny perełek.

Inkubuj mieszaninę, ciągle wstrząsając, aby zapobiec osiadaniu kulek. Stan kwaśny sprzyja tworzeniu wiązań koordynacyjnych z koralikami tytanu przez grupę fosforanową fosfopeptydów. Środek hartujący w buforze redukuje wszelkie niespecyficzne wiązanie niefosforylowanych peptydów z kulkami, pozostawiając je w zawiesinie.

Odwirować w celu granulacji kulek związanych z fosfopeptydem, podczas gdy niefosforylowane peptydy pozostają w supernatancie. Odrzucić supernatant. Przenieść kulki związane z fosfopeptydem do wstępnie zmontowanej kolumny filtra spinowego. Odwirować w celu usunięcia buforu wiążącego i wychwytywania kulek sprzężonych z fosfopeptydem.

Przenieś filtr do czystej rurki i dodaj roztwór zawierający amoniak. Amoniak zmienia zawiesinę na zasadową, powodując odłączanie się fosfopeptydów od kulek. Odwirować zespół w celu elucji i zebrania niezwiązanych fosfopeptydów. Kulki dwutlenku tytanu pozostają we wkładzie filtrującym. Wysuszyć fosfopeptydy, aby usunąć wszelkie ślady amoniaku.

Wstępnie kondycjonuj dwutlenek tytanu 500 mikrolitrami 100% ACN dwa razy. Następnie kondycjonuj dwutlenek tytanu 500 mikrolitrami 0,2 M buforu fosforanu sodu o pH 7 dwa razy. Na koniec użyj 300 mikrolitrów buforu równowagi, aby trzykrotnie umyć koraliki. Dodaj 400 mikrolitrów 50% ACN, 0,1% TFA do probówki o niskim poziomie wiązania białka. Następnie dodaj 84 mikrolitry kwasu mlekowego.

Przenieś zawieszone fosfopeptydy do probówki o niskim poziomie wiązania białka i inkubuj je w temperaturze pokojowej za pomocą rotatora end-over-end przez 1 godzinę. Po granulowaniu kulek użyj 300 mikrolitrów bufora równowagi, aby umyć je dwa razy i odwirować. Za pomocą 300 mikrolitrów buforu płuczącego spłucz kulki dwa razy. Następnie przenieś je do filtra wirowego o średnicy 0,2 mikrometra.

Po odwirowaniu przenieś jednostkę filtrującą do czystej 1,5-mililitrowej probówki o niskiej zawartości białka i za pomocą 200 mikrolitrów 0,9% amonu w wodzie wymyj zawartość dwa razy. Po sprawdzeniu pH należy zagęścić eluat próżniowo do sucha przez noc, aby odparować amoniak.

10:27

Otrzymywanie wysokoporowatych koordynacyjnych powłok polimerowych na makroporowatych monolitach polimerowych w celu zwiększonego wzbogacenia fosfopeptydów

Related Videos

0 Views

08:01

LERLIC-MS/MS do dogłębnej charakterystyki i kwantyfikacji deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun

Related Videos

0 Views

05:47

Fosfoproteomiczna strategia profilowania sygnalizacji stresu osmotycznego u rzodkiewnika

Related Videos

0 Views

06:09

Kwantyfikacja białek za pomocą wzbogacania immunopowinowactwa peptydów w połączeniu ze spektrometrią mas

Related Videos

0 Views

03:21

Oczyszczanie peptydów: technika ekstrakcji peptydów z trawionych lizatów białkowych oparta na RP-HPLC

Related Videos

0 Views

04:50

Wzbogacanie fosfopeptydów: technika immunoprecypitacji oparta na przeciwciałach w celu oddzielenia specyficznych fosforylowanych peptydów od złożonych mieszanin peptydowych

Related Videos

0 Views

09:30

Analiza fosfopeptydowa plemników najądrzy gryzoni

Related Videos

0 Views

12:23

Wzbogacanie fosfopeptydem w połączeniu z bezznacznikową ilościową spektrometrią mas w celu zbadania fosfoproteomu w raku prostaty

Related Videos

0 Views

11:54

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Related Videos

0 Views

12:11

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026