Wzbogacanie fosfopeptydów na bazie dwutlenku tytanu: metoda selektywnej izolacji fosfopeptydów z biblioteki peptydów

Fosfopeptydy to krótkie ciągi aminokwasów zawierające fosforylowane reszty seryny, treoniny lub tyrozyny. Aby wyizolować fosfopeptydy z mieszaniny peptydów, zacznij od pobrania kulek dwutlenku tytanu w probówce. Zrównoważyć w celu kondycjonowania kulek za pomocą odpowiedniego zakwaszonego buforu wiążącego zawierającego środek hartowniczy. Dodaj żądane stężenie mieszaniny peptydów do zawiesiny perełek.

Inkubuj mieszaninę, ciągle wstrząsając, aby zapobiec osiadaniu kulek. Stan kwaśny sprzyja tworzeniu wiązań koordynacyjnych z koralikami tytanu przez grupę fosforanową fosfopeptydów. Środek hartujący w buforze redukuje wszelkie niespecyficzne wiązanie niefosforylowanych peptydów z kulkami, pozostawiając je w zawiesinie.

Odwirować w celu granulacji kulek związanych z fosfopeptydem, podczas gdy niefosforylowane peptydy pozostają w supernatancie. Odrzucić supernatant. Przenieść kulki związane z fosfopeptydem do wstępnie zmontowanej kolumny filtra spinowego. Odwirować w celu usunięcia buforu wiążącego i wychwytywania kulek sprzężonych z fosfopeptydem.

Przenieś filtr do czystej rurki i dodaj roztwór zawierający amoniak. Amoniak zmienia zawiesinę na zasadową, powodując odłączanie się fosfope