Name: LERLIC-MS/MS do dogłębnej charakterystyki i kwantyfikacji deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę LERLIC-MS/MS do kwantyfikacji i charakterystyki izoform deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun. Technika ta umożliwia skuteczną separację izomerów na długiej kolumnie jonowymiennej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z Ministerstwa Edukacji Singapuru (Poziom 2: Grant ARC9/15), Narodowej Rady Badań Medycznych Singapuru (NMRC-OF-IRG-0003-2016) oraz NTU-NHG Ageing Research Grant (Grant ARG/14017). Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność i najszczersze podziękowania dla dr Andrew Alperta i zespołu PolyLC za uprzejme dostarczenie nam materiałów opakowaniowych, które umożliwiły to badanie.

1. Pakowanie kolumny kapilarnej z długowymienną wymianą anionową (LAX)
(Uwaga: Chociaż kolumna LAX może być pakowana w domu, jak opisujemy w tym protokole, kolumny LAX są również dostępne na rynku, zobacz Tabelę materiałów i odczynników dla dalszych szczegółów).
<ol>
	<li>Zawiesić 50 mg słabego materiału opakowaniowego z anionowymiennikiem w 3,5 ml buforu do pakowania (tabela 1) w celu przygotowania gnojowicy.</li>
	<li>Zamontuj koniec kolumny kapilarnej (rurka o długości 50 cm - średnicy wewnętrznej (ID) 200 μm) za pomocą złączki żeńskiej, tulejki i nakrętki żeńskiej. Umieść ekran o średnicy zewnętrznej 1/16 cala i wielkości porów 1 mikron wewnątrz złączki żeńskiej. (Uwaga: Zastosowane tutaj sito musi mieć mniejszy rozmiar porów niż rozmiar cząstek materiału uszczelniającego, aby zapobiec wyciekowi materiału z kolumny).</li>
	<li>Wypełnij kapilarę gnojowicą za pomocą pompy ciśnieniowej pracującej pod ciśnieniem 4,500 psi. (Uwaga: Pakować kolumnę tak długo, aż materiał opakowaniowy będzie widoczny przy wejściu kolumny).</li>
	<li>Zamontować drugi koniec kolumny kapilarnej zgodnie z opisem w ppkt 1.2.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki
Ten protokół opisuje zastosowanie LERLIC-MS/MS do analizy tkanek ludzkiego mózgu jako modelowego proteomu. (Uwaga: W przypadku użycia innych tkanek lub próbek proteomicznych należy dostosować procedury przygotowania próbek).
<ol>
	<li>Homogenizacja tkanek: 
	a. Przemyć tkanki mózgu (50 do 100 mg) 1x roztworem buforu fosforanowego przez pięć minut trzykrotnie. 
	b. Homogenizować tkankę w stosunku 1:1:2,5 tkanka/kulki metaliczne/bufor homogenizacyjny SDC (Tabela 2) (w/w/v) przez 5 minut w temperaturze 4 °C w probówkach z bezpieczną blokadą przy maksymalnej intensywności przy użyciu homogenizatora tkankowego. (Uwaga: Bufor homogenizacyjny SDC może zawierać inhibitory proteazy, jak wcześniej wskazano w3) 
	c. Odwirować homogenat tkankowy, otrzymany w poprzednim etapie, w temperaturze 10 000 × g, w temperaturze 4 °C przez 10 minut i zebrać supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. 
	d. Powtórzyć kroki b-c dla pozostałych osadów i połączyć supernatanty tyle razy, ile to konieczne, aż nie zaobserwuje się żadnych osadów. (Uwaga: Jeśli musisz powtórzyć kroki b-c więcej niż dwa razy, przenieś próbkę i kulki do nowej probówki z bezpiecznym zamkiem, aby zapobiec utracie próbki podczas etapu wirowania). 
	e. Określ ilościowo stężenie białka w otrzymanych homogenatach za pomocą testu kwasu bicynchoninowego (BCA)12.</li>
	<li>Trawienie tryptyczne wspomagane deoksycholanem sodu (SDC) w roztworze13 homogenatów mózgu. 
	a. Dodać końcowe stężenie 10 mM ditiotreitolu (DTT) (przy użyciu roztworu podstawowego wskazanego w roztworze 5 w tabeli 3) do otrzymanego homogenatu, aby zainicjować redukcję wiązań dwusiarczkowych białek. 
	b. Inkubować homogenat przez 30 minut w łaźni nastawionej na 60 °C. 
	c. Dodać do homogenatu końcowe stężenie 20 mM jodoacetamidu (IAA) przy użyciu roztworu podstawowego wskazanego w roztworze 7 w tabeli 4. 
	d. Inkubować homogenat zawierający IAA w temperaturze pokojowej w ciemności przez 45 min. 
	e. Rozcieńczyć mózg homogenat dwukrotnie, używając buforu rozcieńczającego (roztwór 6 w tabeli 3). 
	f. Inkubować próbkę do drugiego etapu redukcji przez 30 minut w temperaturze 37 °C. 
	g. Dodać trypsynę zmodyfikowaną do sekwencjonowania rozpuszczoną w roztworze 2 w tabeli 2 w stosunku białka do enzymu 1:50 (w/w). 
	h. Homogenat trawić trypsyną przez całonocną inkubację w temperaturze 30 °C. 
	ja. Następnego dnia wygasić trawienie enzymatyczne, dodając 0,5% końcowego stężenia kwasu mrówkowego (FA). (Uwaga: Dodanie FA spowoduje wytrącanie się soli SDC w warunkach kwaśnych.) 
	j. Delikatnie wytrząsnąć próbki zawierające osady SDC. 
	k. Sole SDC należy granulować, odwirowując próbki w temperaturze 12 000 × g, w temperaturze 4 °C przez 10 minut 
	l. Zebrać supernatant i przenieść ciecz do nowej, czystej probówki. (Uwaga: Podczas pipetowania na tym etapie należy zachować ostrożność, aby nie zawiesić ponownie i/lub nie zebrać soli z granulatu SDC.) 
	m. Ponownie rozpuścić osad SDC w buforze do ponownego rozpuszczania SDC (Tabela 5) pod energicznym wirowaniem przez 1 min. 
	n. Powtórz kroki j-l dwukrotnie, aby odzyskać wytrącone peptydy i połączyć supernatanty. (Uwaga: Zobacz Serra et al. 201613, aby uzyskać więcej informacji na temat protokołu trawienia tryptycznego wspomaganego SDC w roztworze dostosowanego tutaj.)</li>
	<li>Odsalanie próbek trawionych tryptycznie. 
	a. Przeprowadzić odsalanie przefermentowanych próbek za pomocą wkładu 1 g C-18. (Uwaga: Użycie wkładu o dużej objętości (5 ml) niezależnie od ilości uzyskanego białka gwarantuje prawidłowe oczyszczenie pozostałych soli SDC w próbkach przed wstrzyknięciem LC-MS/MS.) 
	b. Kondycjonować wkład 1 g C-18 za pomocą 5 ml acetonitrylu (ACN). 
	c. Przepuścić 5 ml buforu czyszczącego (Tabela 6) przez kondycjonowany wkład 1 g C-18 w celu usunięcia pozostałego rozpuszczalnika organicznego. 
	d. Załaduj próbkę do 1 g wkładu C-18. 
	e. Wykonaj 3 - 5 kroków oczyszczania próbki w kolumnie C-18 o masie 1 g, używając 5 ml buforu czyszczącego w każdym kroku. 
	f. Eluować odsolone peptydy z 1 g wkładu C-18 przy użyciu 5 ml buforu elucyjnego (Tabela 7). 
	g. Wysuszyć eluowane peptydy w koncentratorze próżniowym. 
	c. Rozpuścić wysuszoną próbkę w końcowej objętości 200 μl buforu elucyjnego. (Uwaga: Stosować energiczne i długie (> 10 min) wirowanie, a następnie sonikację w kąpieli sonizacyjnej przez 30 minut, aby całkowicie ponownie zawiesić wysuszone peptydy w buforze do wstrzykiwań.) 
	d. Dostosuj objętość iniekcji próbki dla LERLIC-MS/MS, aby przeanalizować od 1 do 3 μg białka.</li>
</ol>
3. Jednowymiarowa separacja LERLIC-MS/MS
<ol>
	<li>Warunki chromatografii cieczowej: 
	Fazy mobilne: 
	A: 0,1% FA w wodzie (tabela 8). 
	B: 0,1% FA w ACN (Tabela 9) 
	Natężenie przepływu: 0,4 μl/min 
	Kolumna: Kolumna kapilarna LAX (długość 50 cm - średnica wewnętrzna 200 μm) 
	a. Stosuj następujące nachylenie 1200 min: 95% B przez 40 min, 95 − 85% B przez 434 min, 85− 70% B przez 522 min, 70− 35% B przez 124 min, 35− 3% B przez 45 min, izokratyczny przy 3% B przez 5 min, 3 – 95% B przez 7 min i utrzymywany izokratyczny na poziomie 95% B przez 23 min. 
	b. Przeprowadzić separację peptydów za pomocą kapilary LAX, jak wskazano w Serra & Gallart-Palau i wsp.3 przy użyciu ultra-wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej.</li>
	<li>Konfiguracja spektrometru masowego: 
	a. Skonfiguruj szczegóły zdarzenia skanowania, aby przeprowadzić akwizycję danych na przemian między pełną spektrometrią mas z transformacją Fouriera (FT-MS) i spektrometrią mas z transformacją Fouriera (FT-MS/MS) z następującymi parametrami: 
	a.1. Tryb akwizycji danych: dodatni 
	a.2 Parametry FT-MS: 
	Zakres masy: 350 − 2 000 m/z 
	Rozdzielczość: 60 000 
	Mikroskany: 1 na spektrum 
	Automatyczna kontrola wzmocnienia: 1 × 106 
	a.3 Parametry FT-MS/MS: 
	Tryb fragmentacji: Wysokoenergetyczna dysocjacja kolizyjna (HCD) 
	a.4 Zakres masy: 150 − 2 000 m/z 
	a.5 Rozdzielczość: 30 000 
	a.6 Górne jony N: 10 
	Mikroskany: 1 na spektrum 
	Stan naładowania: > 2 + 
	Szerokość izolacji: 2 Da 
	a.7 Automatyczna kontrola wzmocnienia: 1 × 106 
	b. Wykonaj detekcję peptydów za pomocą spektrometrii mas, jak wskazano w3 przy użyciu orbitrapowego spektrometru masowego wyposażonego w źródło jonów nanoelektronrozpylania pracującego pod napięciem 1,5 kV.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Przeszukaj bazę danych białek na podstawie danych uzyskanych w LERLIC-MS/MS przy użyciu następujących parametrów przy użyciu specjalnego oprogramowania proteomicznego: (Uwaga: Zobacz3, aby uzyskać więcej informacji.) 
	a. Tolerancja jonów: 10 ppm 
	b. Tolerancja jonów fragmentacyjnych: 0,05 Da 
	c. Wskaźnik fałszywych odkryć (FDR): 1% 
	d. Baza danych: UniProt Human database 
	e. Poprawiono modyfikacje: Karbamydometylacja w Cys 
	f. Zmienne modyfikacje (jeśli jest to wymagane przez oprogramowanie): Utlenianie (Met), Deamidacja (Asn i Gln).</li>
	<li>Pewna charakterystyka i kwantyfikacja izomerycznych produktów deamidowanych w danych LERLIC-MS/MS: 
	a. Eksport wyników wyszukiwania w bazie danych z LERLIC-MS/MS do oprogramowania spreedsheet w celu analizy. 
	b. Znajdź i wyodrębnij całą listę zdeamidowanych peptydów i ich niezdeamidowanych odpowiedników. 
	c. Korzystając z wykazu otrzymanych peptydów jako odniesienia, wyekstrahować chromatogramy jonowe (XIC) tych peptydów za pomocą odpowiedniego oprogramowania przy 5 ppm tolerancji masy. (Uwaga: Zobacz3, aby uzyskać więcej informacji na temat oprogramowania używanego do ekstrakcji XIC.) 
	d. Zbadaj wzrokowo otrzymane XIC, aby zidentyfikować oddzieloną elucję dwupikową produktów izomerycznych, jak wskazano3. (Uwaga: Produkty izomeryczne tych peptydów zidentyfikowanych na poziomie MS/MS można łatwo znaleźć, kierując się obecnością dwóch różnych czasów retencji w wynikach wyszukiwania w bazie danych). 
	e. Względne oznaczanie ilościowe produktów izomerycznych z każdego zdeamidowanego miejsca/peptydu musi być przeprowadzone w oparciu o powierzchnię piku każdego zidentyfikowanego izomeru w otrzymanych XIC.</li>
</ol>

<ol><li>Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+mass+spectrometric+analysis+of+protein+deamidation%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li>
<li>Geiger, T., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deamidation%2C+isomerization%2C+and+racemization+at+asparaginyl+and+aspartyl+residues+in+peptides.+Succinimide-linked+reactions+that+contribute+to+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation.</a> J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).</li>
<li>Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Glutamine+Deamidation+by+Long-Length+Electrostatic+Repulsion-Hydrophilic+Interaction+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+%28LERLIC-MS%2FMS%29+in+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics.</a> Anal Chem. , (2016).</li>
<li>Reissner, K. J., Aswad, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deamidation+and+isoaspartate+formation+in+proteins%3A+unwanted+alterations+or+surreptitious+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals.</a> Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).</li>
<li>Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/240939643_First_evidence_of_spontaneous_deamidation_of_glutamine_residue_via_cyclic_imide_to_-_and_-glutamic_residue_under_physiological_conditions">First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions.</a> JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).</li>
<li>Gallart-Palau, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+white+matter+pathology+and+mitochondrial+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease+with+cerebrovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease.</a> Mol Brain. 9, 27(2016).</li>
<li>Gallart-Palau, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+lobe+proteins+implicated+in+synaptic+failure+exhibit+differential+expression+and+deamidation+in+vascular+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia.</a> Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).</li>
<li>Robinson, N. E., Robinson, A. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11158575">Molecular clocks.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).</li>
<li>Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+separation+and+characterization+of+deamidated+peptides+with+RP-ERLIC-based+multidimensional+chromatography+coupled+with+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry.</a> J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).</li>
<li>Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+deamidation%3A+differentiation+of+glutamic+acid+and+gamma-glutamic+acid+in+peptides+by+electron+capture+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation.</a> Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+proteome+coverage+is+increased+by+unique+peptide+recovery+from+sodium+deoxycholate+precipitate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate.</a> Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+Neurodegenerative+Protein+Modifications+via+Proteomic+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling.</a> Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).</li>
<li>Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+Fc+deamidation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Human antibody Fc deamidation in vivo.</a> Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).</li>
<li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercial+processed+soy-based+food+product+contains+glycated+and+glycoxidated+lunasin+proteoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms.</a> Sci Rep. 6, 26106(2016).</li>
<li>Serra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+peptidomic+strategy+to+decipher+the+molecular+diversity+of+cyclic+cysteine-rich+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides.</a> Sci Rep. 6, 23005(2016).</li>
<li>Leo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deamidation+at+asparagine+and+glutamine+as+a+major+modification+upon+deterioration%2Faging+of+proteinaceous+binders+in+mural+paintings%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings.</a> Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).</li>
<li>Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+extent+of+bone+degradation+using+glutamine+deamidation+in+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen.</a> Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).</li>
<li>Buszewski, B., Noga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+%28HILIC%29--a+powerful+separation+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique.</a> Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).</li>
<li>Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion-exchange+chromatography+of+phosphopeptides%3A+weak+anion+exchange+versus+strong+anion+exchange+and+anion-exchange+chromatography+versus+electrostatic+repulsion-hydrophilic+interaction+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography.</a> Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).</li>
<li>Adav, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dementia-linked+amyloidosis+is+associated+with+brain+protein+deamidation+as+revealed+by+proteomic+profiling+of+human+brain+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues.</a> Mol Brain. 9 (1), 20(2016).</li>
<li>Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+laterally+about+neurodegenerative+proteinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies.</a> J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+expressing+human+SOD1+successfully+recapitulates+mitochondrial+phenotypic+features+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).</li>
<li>Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+in+vitro+and+in+vivo+stability+of+a+succinimide+intermediate+observed+on+a+therapeutic+IgG1+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule.</a> mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+functional+implication+of+a+stable+succinimide+in+the+structural+stability+of+Methanocaldococcus+jannaschii+glutaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase.</a> Nat Commun. 7, 12798(2016).</li>
<li>Alpert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrostatic+Repulsion+Hydrophilic+Interaction+Chromatography+for+Isocratic+Separation+of+Charged+Solutes+and+Selective+Isolation+of+Phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides.</a> Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).</li>
<li>Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+Evaluation+and+Minimization+of+Nonenzymatic+Deamidation+in+Proteomic+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111(2011).</li>
<li>Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+trypsin+digestion+buffers+on+artificial+deamidation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation.</a> J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).</li>
<li>Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mildly+acidic+conditions+eliminate+deamidation+artifact+during+proteolysis%3A+digestion+with+endoprotease+Glu-C+at+pH+4.5%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5.</a> Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule wideo przedstawiamy krok po kroku protokół LERLIC-MS/MS 3, metodę przeprowadzania dogłębnej charakterystyki i dokładnego określania zakresu deamidacji białek i procesów enzymatycznych związanych z tą modyfikacją białka. LERLIC-MS/MS opiera się na zastosowaniu długiego (50 cm) LAX na zasadzie chromatografii odpychająco-hydrofilowej (ERLIC)27. Zastosowanie długiej kolumny, jak pokazano w naszym badaniu3, maksymalizuje potencjał ERLIC do ...

Deamidacja to potranslacyjna modyfikacja białka (PTM), która wprowadza ujemny ładunek do szkieletu białkowego poprzez modyfikację reszt asparaginy (Asn) i/lub glutaminy (Gln)1. Ta modyfikacja, wpływając na reszty Asn, generuje produkty izomeryczne, kwas izoasparaginowy (isoAsp) i kwas n-asparaginowy (Asp) w wspólnym stosunku 3:12. Niezależnie od tego, stosunek ten może zostać zmieniony przez interwencję enzymu naprawczego metylotransferazy L-izoaspartylu (PIMT)3,4. Podobnie, deamidacja reszt Gln generuje izomeryczne izoformy kwasu gamma-glutaminowego (γ-Glu) i kwasu alfa-glutaminowego (α-Glu) w oczekiwanym stosunku 1:73,5, ale stosunek ten może zostać zmieniony przez działanie wszechobecnego enzymu transglutaminazy 2 i innych transglutaminaz, w tym transglutaminazy 1, enzymu niedawno zidentyfikowanego jako związany z pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi w mózgu6.
Pochodzenie deamidacji może być albo spontaniczne, albo enzymatyczne, to pierwsze jest szczególnie powszechne na resztach Gln, w których transglutaminazy i inne enzymy pośredniczą w międzycząsteczkowym sieciowaniu poprzez transamidację (zobacz 3 więcej szczegółów na temat transamidacji Gln i jej implikacji w kilku przewlekłych i śmiertelnych chorobach ludzkich). Dlatego deamidacja jest PTM, który ma decydujący wpływ na strukturę i funkcję dotkniętych molekuł4,7,8 i wymaga dogłębnej charakterystyki chemicznej3 w świetle jego różnorodnych konsekwencji biochemicznych, w tym jego usługi jako zegara molekularnego starzenia9.
Chociaż deamidacja reszt Asn została stosunkowo dobrze scharakteryzowana przez proteomikę typu shotgun bottom-up1,10, deamidacja reszt Gln nadal nie ma odpowiedniej metody charakterystyki poza trudną analizą modelowych związków za pomocą fragmentacji rodników opartej na elektronach11. Niedawno opracowaliśmy nowatorską, jednowymiarową strategię proteomiki typu shotgun (LERLIC-MS/MS)3, która umożliwia separację izoform deamidacji Gln i Asn ze złożonych próbek biologicznych i związków modelowych w jednej analizie. LERLIC-MS/MS opiera się na separacji peptydów trawionych tryptycznie za pomocą długodystansowej (50 cm) kolumny jonowymiennej (LAX) pracującej w trybie chromatografii elektrostatycznej odpychająco-hydrofilowej (ERLIC) i sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS). Ta nowa strategia analityczna została wykorzystana do scharakteryzowania i względnego ilościowego określenia zakresu każdej deamidowanej reszty w tkankach ludzkiego mózgu3. Niemniej jednak, przedstawiony tutaj protokół zapewni obrazowanie wideo LERLIC-MS/MS mające na celu zbadanie specyfiki deamidacji białek w kontekście biochemicznym będącym przedmiotem zainteresowania.
OŚWIADCZENIE ETYCZNE
Wszystkie procedury tego protokołu zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję rewizyjną Uniwersytetu Technologicznego Nanyang w Singapurze i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucji.

<table><tbody><tr><td>PolyCAT 3 i mikro; m 100-&Aring; (materiał sypki)</td><td>PolyLC Inc.</td><td>Na specjalne zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Długa kolumna kapilarna jonowymienna 50 cm - 200 &mikro; m ID</td><td>PolyLC Inc.</td>Rurki PEEKsil <td>na specjalne zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>1/16" OD x 200 &micro; m ID x 50 cm długości</td><td>SGE Analytical Science pod kierownictwem Trajan Scientific Australia&nbsp;</td><td>620050</td><td></td></tr><tr><td>Złączka żeńsko-żeńska do rurek o średnicy zewnętrznej 1/16"</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-125</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętka żeńska do mikroferule</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHP-416</td><td></td></tr><tr><td>Mikroferule</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UPCHF-132</td><td></td></tr><tr><td>Bomba ciśnieniowa NanoBaume</td><td>Western Fluids Engineering</td><td>SP-400</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu Prominence UFLC system</td><td>Shimadzu</td><td>Prominence UFLC</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>Rurki Safe-lock</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej. 0,9 i 2,0 mm. 1 funt Niesterylne.</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa&nbsp;</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>Rotina 380 R Standardowa</td><td></td></tr><tr><td>cyfrowa podgrzewana kąpiel obiegowa, 120VAC</td><td>PolyScience 8006 6L</td><td>8006A11B</td><td></td></tr><tr><td>Opakowanie wrz C18 Wkład odsalający 50 mg</td><td>Wody</td><td>WAT020805</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator Vacumm</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Koncentrator Plus System</td><td></td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 UHPLC&nbsp;</td><td>Dionex</td><td>UltiMate 3000 UHPLC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr masowy Orbitrap Elite</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>ORBITRAP ELITE</td><td></td></tr><tr><td>Michrom Thermo CaptiveSpray&nbsp;</td><td>Michrom-Bruker Inc.</td><td>Inkubator TCSI-SS2</td><td></td></tr><tr><td>INCUCELL&nbsp;</td><td>MMM Group</td><td>INCUCELL111</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy w tabletkach koktajlowych</td><td>Roche</td><td>11836170001 (ROCHE)</td><td></td></tr> <tr><td>Roztwór buforowy fosforanowy 10x (rozcieńczony do 1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>i6125</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818 (HONEYWELL)</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl klasy</td><td>HPLC Sigma-Aldrich</td><td>675415</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol HPLC klasy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>675431</td><td></td></tr><tr><td>Woda HPLC klasy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14263</td><td></td></tr></tbody></table>

lerlic-ms/ms do dogłębnej charakterystyki i kwantyfikacji deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Charakterystyka deamidacji białek jest niezbędna do zrozumienia roli (ról) i możliwości tej modyfikacji potranslacyjnej białka (PTM) w patologii człowieka i innych kontekstach biochemicznych. W celu przeprowadzenia charakterystyki deamidacji białek, opracowaliśmy niedawno nowatorską metodę długotrwałej chromatografii odpychania elektrostatycznego i oddziaływania hydrofilowego, chromatografii z tandemową spektrometrią mas (LERLIC-MS/MS), która może oddzielić produkty izoformy glutaminy (Gln) i asparaginy (Asn) od związków modelowych do wysoce złożonych próbek biologicznych. LERLIC-MS/MS jest zatem pierwszą strategią proteomiczną typu shotgun do separacji i kwantyfikacji izoform deamidacji Gln. Wykazujemy również, jako nowość, że przedstawiony tutaj protokół przetwarzania próbek stabilizuje produkt pośredni sukcynimidu, umożliwiając jego scharakteryzowanie przez LERLIC-MS/MS. Zastosowanie LERLIC-MS/MS, jak pokazano w tym artykule wideo, może pomóc w wyjaśnieniu obecnie nieznanych układów molekularnych deamidacji białek. Ponadto projekt LERLIC-MS/MS dostarcza dalszych informacji na temat reakcji enzymatycznych, które obejmują deamidację w różnych tłach biologicznych.

Deamidacja reszt Gln i Asn jest uważana za degeneracyjną modyfikację białek (DPM), która bierze udział w rozwoju wielu chorób przewlekłych i śmiertelnych14. Wykazano, że ta modyfikacja potranslacyjna (PTM) może służyć do przewidywania okresu półtrwania oraz stanów degradacji przeciwciał i innych cząsteczek w organizmie człowieka oraz w podobnych środowiskach biologicznych1,15. Znaczenie deamidacji białek wy...

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół długotrwałej elektrostatycznej chromatografii odpychającej-hydrofilowej z tandemową spektrometrią mas (LERLIC-MS/MS). Jest to nowatorska metodologia, która po raz pierwszy umożliwia kwantyfikację i charakterystykę izoform deamidacji glutaminy i asparaginy za pomocą proteomiki typu shotgun.

LERLIC-MS/MS do dogłębnej charakterystyki i kwantyfikacji deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie proteomiki typu shotgun do charakteryzacji i ilościowego oznaczenia endogennych produktów deamidacji glutaminy i asparaginy w złożonych proteomach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biochemii, takie jak wpływ procesów spontanicznych i enzymatycznych na izomeryczne produkty deamidacji glutaminy i asparaginy. Główną zaletą tej techniki jest to, że izomery deamidacji glutaminy są rozdzielane na długiej kapilarnej kolumnie do wymiany jonowej, co maksymalizuje możliwość rozdzielania peptydów na podstawie ich punktów izoelektrycznych.Aby rozpocząć konstrukcję kolumny, zawiesić 50 mg materiału wypełniającego do słabej wymiany anionowej w 3,5 ml 90% izopropanolu w wodzie. Na jednym końcu 50 cm odcinka rurki Peak o średnicy wewnętrznej 200 µm zamocować złączkę żeńsko-żeńską, microferal oraz nakrętkę żeńską. Na końcu rurki, wewnątrz microferalu, zamontować sitko o rozmiarze 1/16 cala z porami o wielkości 1 µm.Używając pompy ciśnieniowej ustawionej na 4 500 psi, wypełnij kapilarę materiałem do wymiany anionowej, aż materiał będzie widoczny u góry. Aby zakończyć montaż kolumny, do górnej części wypełnionej kapilary, na przeciwległym końcu, przymocuj kolejną złączkę żeńsko-żeńską, microferal oraz nakrętkę żeńską. Przemywaj od 50 do 100 miligramów tkanki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym przez pięć minut.Powtórz to płukanie dwukrotnie, a następnie umieść wypłukaną tkankę w probówkach z bezpiecznymi nakrętkami. Dodaj do każdej probówki kulki ze stali nierdzewnej w ilości odpowiadającej masie tkanki oraz 2,5 równoważnika objętościowo wodnego 100 milimolarnego roztworu octanu amonu z 1%deoxycholanem sodu. Homogenizuj tkankę z maksymalną intensywnością przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie homogenizat wirować przez dziesięć minut przy 10 000 x g i temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nadfiltr przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml. Kontynuować homogenizację i wirowanie osadu tkankowego, łącząc nadfiltraty po każdym cyklu, aż do momentu, gdy nie będzie zaobserwowano osadu.Oznacz stężenie białka w połączonych nadnadłożach za pomocą testu kwasu bicinchononowego. Następnie do homogenatu dodaj 1 M roztwór ditiotreitolu w 100 mM octanie amonu, aby uzyskać stężenie 10 mM ditiotreitolu w próbce. Inkubuj homogenat w łaźni wodnej w temperaturze 60 °C przez trzydzieści minut.Do homogenatu dodać roztwór jodooctanu o stężeniu 1 M w 100 mM octanie amonu, aby uzyskać stężenie jodooctanu 20 mM w próbce. Inkubować homogenat w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez 45 minut. Następnie rozcieńczyć homogenat dwukrotnością jego objętości roztworem ditiotreitolu o stężeniu 10 mM w 100 mM octanie amonu.Inkubować homogenat w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Do homogenatu dodać odpowiednią objętość modyfikowanej trypsyny klasy sekwencyjnej w 100 mM octanie amonu, aby uzyskać stosunek białka do enzymu wynoszący 1:50 wagowo w próbce. Inkubować próbkę w temperaturze 30 °C przez noc w celu strawienia homogenatu.Przerwij trawienie, dodając kwas mrawkowy w ilości stanowiącej 0.5% masy próbki, powodując wytrącenie soli taurodeoksycholan sodu. Delikatnie wymieszaj próbki zawierające sole SDC na wstrząsarce typu vortex, a następnie odwiruj próbki przez dziesięć minut przy 12 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zlej nadsącz do nowej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu soli SDC.Ponownie rozpuść sole w 0,5% objętościowo wodnym roztworze wodorotlenku amonu, intensywnie mieszając w wirówce vortex. Uzależnij wkładnik sorpcyjny C-18 o masie jednego grama, przepuszczając przez niego 5 ml acetonitrylu, a następnie 5 ml 0,1% kwasu trifluorooctowego w wodzie. Następnie nanieś strawioną próbkę na wkładnik.Próbki należy przemyć od trzech do pięciu razy porcjami 5 mL 0,1% TFA. Następnie peptydy należy rozcieńczyć w 5 mL wodnego roztworu 75% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego. Ciecz należy odparować w koncentratorze próżniowym.Do osadu dodać 200 µL 75% acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym. Mieszaninę mieszać w wstrząsارce (vortex) przez co najmniej dziesięć minut, a następnie poddać sonikacji przez co najmniej 30 minut, aby zrekonstytuować suche peptydy. Próbkę rozcieńczyć w razie potrzeby tak, aby wstrzyknięta próbka zawierała od jednej do trzech µg białka.Podłącz kolumnę kapilarną LAX do urządzenia do ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej. Przygotuj 0,1% roztwory kwasu mrawkowego w wodzie i acetonitrylu. Ustaw szybkość przepływu na 0,4 µL/min oraz zaprogramuj gradientowy bieg analizy trwający 1 200 minut.Skonfiguruj zdarzenia skanowania spektrometru mas tak, aby naprzemiennie przeprowadzać akwizycję danych w trybach pełnej spektrometrii mas z transformatą Fouriera oraz tandemowej spektrometrii mas z transformatą Fouriera. Przeprowadź analizę LERLIC MS/MS w celu rozdzielenia i scharakteryzowania peptydów. Wykorzystaj uzyskane dane oraz oprogramowanie proteomiczne do przeprowadzenia przeszukiwania bazy danych białek.Wyeksportuj wyniki wyszukiwania w bazie danych do programu arkusz kalkulacyjny. Zidentyfikuj i wyodrębnij listę peptydów deamidowanych oraz odpowiadających im peptydów niedeadymidowanych. Wyodrębnij chromatogramy jonowe każdego z tych peptydów przy tolerancji masy wynoszącej 5 ppm.Przeanalizuj chromatogramy wyekstrahowanych jonów pod kątem pozornego rozdzielenia podwójnych pików produktów izomerycznych. Przy użyciu LERLIC MS/MS oddzielono i zidentyfikowano izoformy zdeamidowane glutaminy i asparaginy w próbce białka w dwóch różnych czasach retencji. Zidentyfikowano enzymatycznie zmodyfikowane pośrednie reszty glutaminy transamidacji, wykazujące odwrócony stosunek gamma do alfa-glutamilu.Za pomocą tej metody zidentyfikowano również produkt pośredni w postaci succinimidu w resztach asparaginy. Jest to możliwe, ponieważ łagodnie kwasowe warunki przetwarzania próbek stabilizują produkt pośredni succinimidu. Sugeruje to, że technikę LERLIC MS/MS można zastosować w badaniach całego proteomu pod kątem produktów pośrednich succinimidu.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biochemii do charakteryzacji deamidacji białek w kontekstach obejmujących zakres od archeologii po badania biomedyczne.

lerlic-msms-for-depth-characterization-quantification-glutamine

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Źródło: Wulf, M., et.al.  Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny. J. Vis. Exp. (2021). Ten film przedstawia analizę próbek peptydów z granulek neuromelaniny (NMG) wyizolowanych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej. Peptydy są najpierw rozdzielane za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), a następnie analizowane za pomocą spektrometrii mas w celu określenia ich stosunku masy do ładunku (m / z). Docelowe...

Analiza LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny wyizolowanych z ludzkiej tkanki mózgowej

Znakowanie stabilnych izotopów peptydów metodą redukcyjnej dimetylacji (znakowanie ReDi) to szybka, tania strategia dla dokładnej proteomiki ilościowej opartej na spektrometrii mas. W tym miejscu demonstrujemy solidną metodę przygotowania i analizy mieszanin białkowych przy użyciu podejścia ReDi, którą można zastosować do prawie każdego rodzaju próbki.

Proteomika ilościowa wykorzystująca dimetylację redukcyjną do znakowania stabilnych izotopów

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Solidny protokół jest tutaj prezentowany do izolowania granulek neuromelaniny z ludzkiej tkanki pośmiertnej istoty czarnej pars compacta za pomocą mikrodysekcji laserowej. Ten zmieniony i zoptymalizowany protokół znacznie minimalizuje wymagany czas pobierania próbek, zmniejsza wymaganą ilość próbki oraz usprawnia identyfikację i kwantyfikację białek za pomocą analizy LC-MS/MS.

Protokół oparty na mikrodysekcji laserowej do analizy LC-MS/MS profilu proteomicznego granulek neuromelaniny

Protokół proteomiki znakowania bliskości lizosomów neuronalnych jest tutaj opisany w celu scharakteryzowania dynamicznego mikrośrodowiska lizosomów w ludzkich neuronach pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Lizosomalne białka błonowe i białka, które oddziałują z lizosomami (stabilnie lub przejściowo), można dokładnie określić ilościowo w tej metodzie z doskonałą wewnątrzkomórkową rozdzielczością przestrzenną w żywych ludzkich neuronach.

Charakterystyka interaktomu lizosomu neuronalnego z proteomiką znakowania zbliżeniowego

Poznaj metodę LERLIC-MS/MS do kwantyfikacji i charakterystyki izoform deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun. Technika ta umożliwia skuteczną separację izomerów na długiej kolumnie jonowymiennej.

LERLIC-MS/MS do dogłębnej charakterystyki i kwantyfikacji deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun

Przeglądaj więcej filmów