LERLIC-MS/MS do dogłębnej charakterystyki i kwantyfikacji deamidacji glutaminy i asparaginy w proteomice shotgun

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie proteomiki typu shotgun do charakteryzacji i ilościowego oznaczenia endogennych produktów deamidacji glutaminy i asparaginy w złożonych proteomach. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biochemii, takie jak wpływ procesów spontanicznych i enzymatycznych na izomeryczne produkty deamidacji glutaminy i asparaginy. Główną zaletą tej techniki jest to, że izomery deamidacji glutaminy są rozdzielane na długiej kapilarnej kolumnie do wymiany jonowej, co maksymalizuje możliwość rozdzielania peptydów na podstawie ich punktów izoelektrycznych.

Aby rozpocząć konstrukcję kolumny, zawiesić 50 mg materiału wypełniającego do słabej wymiany anionowej w 3,5 ml 90% izopropanolu w wodzie. Na jednym końcu 50 cm odcinka rurki Peak o średnicy wewnętrznej 200 µm zamocować złączkę żeńsko-żeńską, microferal oraz nakrętkę żeńską. Na końcu rurki, wewnątrz microferalu, zamontować sitko o rozmiarze 1/16 cala z porami o wielkości 1 µm.

Używając pompy ciśnieniowej ustawionej na 4 500 psi, wypełnij kapilarę materiałem do wymiany anionowej, aż materiał będzie widoczny u góry. Aby zakończyć montaż kolumny, do górnej części wypełnionej kapilary, na przeciwległym końcu, przymocuj kolejną złączkę żeńsko-żeńską, microferal oraz nakrętkę żeńską. Przemywaj od 50 do 100 miligramów tkanki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym przez pięć minut.

Powtórz to płukanie dwukrotnie, a następnie umieść wypłukaną tkankę w probówkach z bezpiecznymi nakrętkami. Dodaj do każdej probówki kulki ze stali nierdzewnej w ilości odpowiadającej masie tkanki oraz 2,5 równoważnika objętościowo wodnego 100 milimolarnego roztworu octanu amonu z 1%deoxycholanem sodu. Homogenizuj tkankę z maksymalną intensywnością przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie homogenizat wirować przez dziesięć minut przy 10 000 x g i temperaturze czterech stopni Celsjusza. Nadfiltr przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml. Kontynuować homogenizację i wirowanie osadu tkankowego, łącząc nadfiltraty po każdym cyklu, aż do momentu, gdy nie będzie zaobserwowano osadu.

Oznacz stężenie białka w połączonych nadnadłożach za pomocą testu kwasu bicinchononowego. Następnie do homogenatu dodaj 1 M roztwór ditiotreitolu w 100 mM octanie amonu, aby uzyskać stężenie 10 mM ditiotreitolu w próbce. Inkubuj homogenat w łaźni wodnej w temperaturze 60 °C przez trzydzieści minut.

Do homogenatu dodać roztwór jodooctanu o stężeniu 1 M w 100 mM octanie amonu, aby uzyskać stężenie jodooctanu 20 mM w próbce. Inkubować homogenat w temperaturze pokojowej, w ciemności, przez 45 minut. Następnie rozcieńczyć homogenat dwukrotnością jego objętości roztworem ditiotreitolu o stężeniu 10 mM w 100 mM octanie amonu.

Inkubować homogenat w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Do homogenatu dodać odpowiednią objętość modyfikowanej trypsyny klasy sekwencyjnej w 100 mM octanie amonu, aby uzyskać stosunek białka do enzymu wynoszący 1:50 wagowo w próbce. Inkubować próbkę w temperaturze 30 °C przez noc w celu strawienia homogenatu.

Przerwij trawienie, dodając kwas mrawkowy w ilości stanowiącej 0.5% masy próbki, powodując wytrącenie soli taurodeoksycholan sodu. Delikatnie wymieszaj próbki zawierające sole SDC na wstrząsarce typu vortex, a następnie odwiruj próbki przez dziesięć minut przy 12 000 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zlej nadsącz do nowej probówki, uważając, aby nie naruszyć osadu soli SDC.

Ponownie rozpuść sole w 0,5% objętościowo wodnym roztworze wodorotlenku amonu, intensywnie mieszając w wirówce vortex. Uzależnij wkładnik sorpcyjny C-18 o masie jednego grama, przepuszczając przez niego 5 ml acetonitrylu, a następnie 5 ml 0,1% kwasu trifluorooctowego w wodzie. Następnie nanieś strawioną próbkę na wkładnik.

Próbki należy przemyć od trzech do pięciu razy porcjami 5 mL 0,1% TFA. Następnie peptydy należy rozcieńczyć w 5 mL wodnego roztworu 75% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego. Ciecz należy odparować w koncentratorze próżniowym.

Do osadu dodać 200 µL 75% acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym. Mieszaninę mieszać w wstrząsارce (vortex) przez co najmniej dziesięć minut, a następnie poddać sonikacji przez co najmniej 30 minut, aby zrekonstytuować suche peptydy. Próbkę rozcieńczyć w razie potrzeby tak, aby wstrzyknięta próbka zawierała od jednej do trzech µg białka.

Podłącz kolumnę kapilarną LAX do urządzenia do ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej. Przygotuj 0,1% roztwory kwasu mrawkowego w wodzie i acetonitrylu. Ustaw szybkość przepływu na 0,4 µL/min oraz zaprogramuj gradientowy bieg analizy trwający 1 200 minut.

Skonfiguruj zdarzenia skanowania spektrometru mas tak, aby naprzemiennie przeprowadzać akwizycję danych w trybach pełnej spektrometrii mas z transformatą Fouriera oraz tandemowej spektrometrii mas z transformatą Fouriera. Przeprowadź analizę LERLIC MS/MS w celu rozdzielenia i scharakteryzowania peptydów. Wykorzystaj uzyskane dane oraz oprogramowanie proteomiczne do przeprowadzenia przeszukiwania bazy danych białek.

Wyeksportuj wyniki wyszukiwania w bazie danych do programu arkusz kalkulacyjny. Zidentyfikuj i wyodrębnij listę peptydów deamidowanych oraz odpowiadających im peptydów niedeadymidowanych. Wyodrębnij chromatogramy jonowe każdego z tych peptydów przy tolerancji masy wynoszącej 5 ppm.

Przeanalizuj chromatogramy wyekstrahowanych jonów pod kątem pozornego rozdzielenia podwójnych pików produktów izomerycznych. Przy użyciu LERLIC MS/MS oddzielono i zidentyfikowano izoformy zdeamidowane glutaminy i asparaginy w próbce białka w dwóch różnych czasach retencji. Zidentyfikowano enzymatycznie zmodyfikowane pośrednie reszty glutaminy transamidacji, wykazujące odwrócony stosunek gamma do alfa-glutamilu.

Za pomocą tej metody zidentyfikowano również produkt pośredni w postaci succinimidu w resztach asparaginy. Jest to możliwe, ponieważ łagodnie kwasowe warunki przetwarzania próbek stabilizują produkt pośredni succinimidu. Sugeruje to, że technikę LERLIC MS/MS można zastosować w badaniach całego proteomu pod kątem produktów pośrednich succinimidu.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biochemii do charakteryzacji deamidacji białek w kontekstach obejmujących zakres od archeologii po badania biomedyczne.