Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

Ogólnym celem tej metody cytogenetyki molekularnej jest obserwacja stabilnych aberracji interchromosomalnych w komórkach szpiku kostnego myszy poddanych całkowitemu napromieniowaniu ciała. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny radiobiologii, takie jak ryzyko indukowania stabilnych aberracji chromosomowych w komórkach szpiku kostnego myszy narażonych na całkowite napromieniowanie ciała. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona ukierunkowaną wizualizację indukowanych promieniowaniem stabilnych uszkodzeń genetycznych w komórkach szpiku kostnego myszy, które mogą być przekazywane przez wiele pokoleń komórek.

Po wyizolowaniu szpiku kostnego z kości udowych i piszczelowych myszy i przygotowaniu zawiesiny pojedynczych komórek zgodnie z protokołem tekstowym, ostrożnie nałóż zawiesinę komórkową na równą objętość medium do separacji mononuklearnych komórek szpiku kostnego. Wirowarkę ustaw na 400 ×g w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie ostrożnie pobierz frakcję leukocytarną (buffy coat), nie naruszając pozostałych warstw, i przenieś roztwór do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.

Aby przygotować preparaty rozprzestrzone z komórek w metafazie, należy dodać 10 mililitrów PBS do probówki zawierającej warstwę leukocytarną. Następnie probówkę wiruje się z prędkością 400 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Potem ostrożnie usuwa się nadsącz i delikatnie opukuje probówkę, aby rozbić osad komórkowy.

Następnie dodać 10 ml PBS i ponownie odwirować zawiesinę. Usunąć nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Rozbić osad i, delikatnie i stale wstrząsając, dodawać kroplami 4 ml uprzednio ogrzanego hipotonicznego 0,075 M roztworu chlorku potasu.

Inkubować zawiesinę komórkową w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Następnie dodać do probówki taką samą objętość utrwalacza i delikatnie wymieszać, odwracając probówkę. Odwirować zawartość probówki i usunąć nadsącz.

Następnie rozbić pellet komórkowy i dodać świeży utrwalacz. Powtórzyć wirowanie i dodawanie utrwalacza jeszcze pięć razy. Po ponownym zawieszeniu komórek w 400 do 600 µL utrwalacza, nanieść 30 µL utrwalonych komórek na uprzednio oczyszczone i zwilżone szkiełka nachylone pod kątem 45 stopni i pozostawić szkiełka do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przez noc.

Aby przeprowadzić malowanie chromosomów mysich metodą mFISH, należy umieścić szkiełko z preparatami rozłazów komórek w metafazie w 2X SSC na dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie odwodnić szkiełko poprzez seryjne przemywanie etanolem w stężeniach 70%, 80% i 100% przez dwie minuty w każdym cyklu płukania. Podgrzać 40 ml roztworu denaturującego w szklanym słojku Coplin do 70°C przez 30 minut.

Następnie przenieś preparat do uprzednio podgrzanego roztworu i inkubuj próbkę od 1 do 1 1/2 minuty, aby zdenaturować chromosomy. Bezzwłocznie użyj lodowatego 70% ethanol, aby schłodzić preparat przez dwie minuty, co zatrzyma proces denaturacji i zapobiegnie renaturacji zdenaturowanych chromosomów. Następnie odwodnij preparat, stosując serię stężeń etanolu, zaczynając od 80% ethanol przez dwie minuty.

Następnie umieść preparat w 100% etanolu na dwie minuty. Po tym czasie całkowicie wysusz preparat w temperaturze pokojowej. Aby zdenaturować sondę, krótko odwirowuj mieszaninę sondy dostarczoną przez producenta, a następnie przenieś 10 µL do probówki wirówkowej z zakrętką typu snap cap o pojemności 500 µL i inkubuj probówkę w kąpieli wodnej w temperaturze 80 °C przez siedem minut.

Następnie umieść probówkę zawierającą zdenaturowaną sondę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C na 10 minut. Potem nanieś mieszaninę sondy na preparat z zdenaturowanymi chromosomami. Ostrożnie przykryj ten obszar szkiełkiem podstawowym o wymiarach 18 mm na 18 mm i usuń widoczne pęcherzyki powietrza, bardzo delikatnie dociskając szkiełko do slajdu.

Użyj cementu gumowego, aby uszczelnić wszystkie cztery boki szkiełka nakrywkowe. Następnie inkubuj preparat w ciemności, w komorze nawilżanej w temperaturze 37 °C przez 12 do 16 godzin. Po hybrydyzacji ostrożnie usuń cement gumowy oraz szkiełko nakrywkowe i umieść preparat w uprzednio podgrzanym roztworze 0.4X SSC w temperaturze 74 °C na pięć minut.

Następnie przenieś preparat do trzeciego roztworu piorącego na dwie minuty. Na preparat nanieś 20 µL medium montażowego zapobiegającego blaknięciu z barwnikiem kontrastowym DAPI i przykryj go szkiełkiem podstawowym. Za pomocą ręcznika laboratoryjnego delikatnie dociśnij szkiełko, aby usunąć pęcherzyki powietrza oraz nadmiar medium montażowego.

Następnie należy użyć laku do paznokci, aby uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowe. Preparaty należy oglądać za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w odpowiednie filtry. W przypadku spektralnego kariotypowania chromosomów myszy, po hybrydyzacji sond z denaturowanymi chromosomami i przemyciu próbek zgodnie z protokołem tekstowym, na preparat należy nanieść 80 µL odczynnika barwiącego SY5.

Umieść plastikową laminkę o wymiarach 24 na 60 mm na górze próbki, a następnie inkubuj ją w ciemności w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 40 minut. Zanurz preparat w szklanym słoju Coplina zawierającym uprzednio podgrzany roztwór piorący 3 i inkubuj go w kąpieli wodnej w temperaturze 45 °C przy jednoczesnym potrząsaniu przez dwie minuty. Powtórz płukanie trzykrotnie.

Nanieś 80 µL odczynnika barwiącego SY5.5 na próbkę, przykryj ją plastikowym szkiełkiem podstawowym o wymiarach 24 by 60 mm i inkubuj w ciemności w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 40 minut. Użyj podgrzanego wcześniej roztworu płuczącego trzy, aby przemyć preparat trzykrotnie, a następnie przytrzymaj szkiełko pod kątem przy ręczniku papierowym, aby odsączyć nadmiar cieczy. Dodaj 20 µL odczynnika antifade DAPI do próbki i ostrożnie nałóż na wierzch szkiełko nakrywkowe, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.

Użyj laku do paznokci, aby zabezpieczyć krawędzie, a następnie obserwuj próbkę za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przystosowanego do rejestrowania obrazów typu sky. Rycina przedstawia reprezentatywne preparaty komórek w metafazie z prawidłowymi i aberracyjnymi parami chromosomów jeden, dwa i trzy myszy. Tutaj widoczna jest stabilna aberracja obejmująca chromosom jeden, w której część chromosomu jeden została zintegrowana z niebarwionym chromosomem DAPI, podczas gdy inna część utworzyła fragment acentryczny.

W tym przykładzie fragment chromosomu drugiego został zintegrowany z chromosomem niebarwionym. Ta stabilna aberracja obejmuje chromosom trzeci. Stabilne aberracje obejmujące wszystkie trzy barwione chromosomy są widoczne w tej preparacie metafazy.

Przedstawiono tutaj przykład spektrokariotypowania normalnej samicy myszy. Ten panel reprezentuje stabilną aberrację obejmującą chromosomy 4 i 12. Ostatni panel przedstawia stabilną aberrację chromosomową obejmującą chromosomy 7 i 10.

Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu 48 do 72 godzin, pod warunkiem właściwego wykonania. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać, że należy używać wyłącznie komórek proliferujących. Zastosowanie tej procedury oraz innych metod, takich jak analiza prążków, może posłużyć do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. czy w napromieniowanych komórkach występują stabilne aberracje interchromosomalne.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie cytogenetyki molekularnej do zbadania związku między aberracjami genetycznymi a różnymi chorobami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jaśniejsze wyobrażenie o tym, jak określać stabilne aberracje międzychromosomalne. Należy pamiętać, że praca z kolchicyną może być niezwykle niebezpieczna, ponieważ jest ona substancją rakotwórczą, dlatego podczas przeprowadzania tego eksperymentu należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek.