Name: Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę rejestracji plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa przy użyciu systemu recyklingu małej objętości. Technika ta stabilizuje poziom tlenu i umożliwia długotrwałe pomiary potencjałów polowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

W.W. przeprowadził, przeanalizował i zaprojektował eksperymenty oraz napisał rękopis. D.X. i C.P. pomagali w przygotowaniu figur i przeprowadzili eksperymenty. Prace te były wspierane przez NSFC (31320103906) i Projekt 111 (B16013) na rzecz T.B.

Zwierzęta były utrzymywane zgodnie z ustalonymi standardami opieki nad zwierzętami i procedurami Instytutu Nauk o Mózgu i Państwowego Kluczowego Laboratorium Neurobiologii Medycznej Uniwersytetu Fudan w Szanghaju w Chinach.
1. Przygotowanie roztworu
UWAGA: Zobacz tabelę materiałów.
<ol>
	<li>Przygotuj bufor do krojenia (zmodyfikowany roztwór Geya): 92 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 25 mM glukozy, 20 mM HEPES, 3 mM Na+-pirogronian, 10 mMMgSO4 i 0,5 mM CaCl2.</li>
	<li>Doprowadzić pH do 7,6 za pomocą 1 M NaOH bez karbonowania.</li>
	<li>Przechowywać bufor w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Miareczkowanie klaruje mętną ciecz. Osmolalność wynosi 305-310 mOsm. Klasa carbogen<sup="xref">21 zawiera 5% dwutlenku węgla i 95% tlenu.</li>
	<li>Przygotować aCSF, rozcieńczając 10x roztwór podstawowy aCSF, który nie zawiera wodorowęglanu i glukozy, uzyskując ostateczny skład: 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 i 1,25 mM KH2PO4.</li>
	<li>Dodaj wodorowęglan i glukozę, aby uzyskać 10 mM glukozy i 26 mM NaHCO3.</li>
	<li>Karbogenować aCSF przez perforowaną rurkę silikonową z zablokowanym końcem natychmiast po dodaniu NaHCO3.</li>
	<li>Zmierz pH podczas karbonowania (pH 7,3-7,4). 
	UWAGA: Pojemność bufora można nieznacznie dostosować, zmieniając ilość NaHCO3. Ponieważ uzyskane pH jest zależne od temperatury, konieczne jest sprawdzenie uzyskanego pH podczas karbonowania w temperaturze roboczej (np. 30 °C).</li>
</ol>
2. Przygotowanie ostrych plastrów hipokampa
UWAGA: Zobacz tabelę materiałów.
<ol>
	<li>Umieść siatkę do przechowywania plastrów w komorze inkubacyjnej dla ostrych plastrów mózgu, wypełnij komorę CSF i karbogenianem (4-6 l/h) przez co najmniej 30 min22 w temperaturze 28-30 °C.</li>
	<li>Schłodzić narzędzia chirurgiczne do temperatury 2-4 °C.</li>
	<li>Umieścić szklaną zlewkę wypełnioną zimnym i karbogenowanym buforem do krojenia (2-4 °C), utrzymywanym w mieszaninie lodu i wody, w pobliżu wibratomu.</li>
	<li>Znieczulenie szczurów lub myszy do momentu ustąpienia odruchów rogówkowych (30-50 s) za pomocą izofluranu, przyjmując 500 μl do szklanego słoika o pojemności 2 litrów lub 12,5 μl do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wyizoluj mózg za pomocą metody opisanej i szczegółowo zwizualizowanej w publikacjach Mathis et al. (2011)23 i Yuanxiang et al. (2014)24.</li>
	<li>Schłodzić mózg do temperatury 2-4 °C w lodowatym buforze do krojenia (przez co najmniej 2 minuty) przed preparacją móżdżku i oddzieleniem półkul.</li>
	<li>Użyj zimnego ostrza chirurgicznego, aby wyciąć fragment kory grzbietowej pod kątem 70° wzdłuż grzbietowej krawędzi każdej półkuli25, aby uzyskać poprzeczne przekroje z brzusznej i pośredniej części hipokampa, jak pokazano w Rysunek 1C i E.</li>
	<li>Za pomocą zimnej szpatułki do cementu dentystycznego przenieś półkulę na kawałek bibuły filtracyjnej, aby na krótko wysuszyć utworzoną powierzchnię (1-2 s).</li>
	<li>Zamontuj dwie półkule ze świeżo przyciętymi powierzchniami na lodowatej platformie do krojenia za pomocą szybko działającego kleju klejącego; niech ogonowy koniec półkul jest skierowany w stronę żyletki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Umieścić platformę do krojenia w komorze chłodzącej wibratomu i napełnić tę komorę buforem do krojenia (2-4 °C). Karbogenian za pomocą perforowanej rurki silikonowej.</li>
	<li>Wytnij plastry o grubości 350 μm, używając odpowiednich ustawień wibracji (np. prędkość ostrza do przodu: 1,2 mm/s, amplituda ostrza: 1 mm).</li>
	<li>Odizoluj formację hipokampa od subiculum i kory śródwęchowej za pomocą dwóch kaniul iniekcyjnych (>28 G) jako nożyczek.</li>
	<li>Usunąć pęcherzyki z siatki przytrzymującej plastry wcześniej przygotowanej komory inkubacyjnej za pomocą pipety Pasteura.</li>
	<li>Przenieś plastry, które mają pewną przezroczystość w warstwie piramidalnej, z platformy do krojenia na siatce komory inkubacyjnej. Unikaj składania, rozciągania, nakładania się i unoszenia się na wodzie, zasysając CSF i plasterek do pipety Pasteura z dużą końcówką. 
	UWAGA: Cała procedura (kroki 2.5-2.14) może zająć 5-10 minut; dlatego ważne jest, aby sprawdzać temperaturę roztworu buforowego w czasie, aby utrzymać go na poziomie 4 °C.</li>
	<li>Inkubować plastry w temperaturze 30 °C przez co najmniej 1,5–2 godziny w komorze inkubacyjnej i dostarczyć karbogen w temperaturze 4–6 l/h 
	UWAGA: Dostosuj natężenie przepływu karbogenu, aby zapewnić cyrkulację buforu w inkubatorze, ale nie pozwól, aby plastry unosiły się na wodzie.</li>
</ol>
3. Modyfikacje karbogenacji dla recyklingu małych zbiorników aCSF
<ol>
	<li>Dodaj 3-drożny łącznik rurowy do odpływu systemu recyklingu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Połącz środkowe ramię 3-drożnego łącznika rurowego z rurką zasilającą karbogen i reguluj natężenie przepływu za pomocą przepływomierza powietrza (3-4 l/h, <silna klasa="xfig">Rysunek 2D i <silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>Dodaj drugie 3-drożne złącze rurowe do dopływu systemu recyklingu. Podłącz środkowe ramię do rurki skierowanej w stronę grzałki liniowej, górne ramię do cienkiej silikonowej rurki (10 cm długości), a dolne ramię do rurki dopływowej ze zbiornika (filtr dolnoprzepustowy; <silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>Umieść wyciskarkę do rurek na cienkiej silikonowej rurce (OD: 2 mm) w miejscu wzdłuż rurki, w którym pulsacja aCSF w komorze plastrowej, generowana przez pompę perystaltyczną, jest minimalna. 
	UWAGA: Modyfikacja karboneacji wypływowo-wypływowej (karbonizacji wypływowej) zmniejsza wrażliwość poziomu karbonizacji na objętość zbiornika aCSF, szybkość recyklingu aCSF i względne położenie probówek w małych zbiornikach aCSF (<50 ml; <silna klasa="xfig">Rysunek 3). Jeśli chodzi o filtr dolnoprzepustowy, pewna ilość powietrza w cienkiej rurce krzemowej zmniejsza pulsację przepływu aCSF; W związku z tym rurka powinna być wypełniona głównie powietrzem.</li>
</ol>
4. Rejestrowanie odpowiedzi synaptycznych w komorze zanurzeniowej
UWAGA: Zobacz tabelę materiałów.
<ol>
	<li>Podgrzej roztwór aCSF w łaźni wodnej do temperatury około 28-30 °C (zapobiegnie to tworzeniu się pęcherzyków w komorze nagrywającej).</li>
	<li>Uruchom system recyklingu (4-5 ml/min) i włącz grzałkę liniową, aby wyrównać działanie systemu przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Namocz na kilka minut mały kawałek papieru do czyszczenia soczewek i nylonową siatkę przymocowaną do platynowego drutu w kształcie litery U w komorze zanurzeniowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Usuń platynowy drut w kształcie litery U.</li>
	<li>Wyłącz recykling i połóż plasterek na papierze do czyszczenia obiektywów.</li>
	<li>Natychmiast umieść siatkę przytrzymującą plasterek na wierzchu plastra, włącz pompę i pozwól plasterkowi zrównoważyć się przez 30 minut bez zanurzania obiektywu w aCSF.</li>
	<li>Napełnij mikropipetę borokrzemianową (tj. elektrodę rejestrującą) płynem CSF (rezystancja końcówki: 1-2 MΩ, napełniona w 1/3 aCSF) i umieść ją w uchwycie na pipety.</li>
	<li>Sprawdź izolację metalowej elektrody stymulującej, umieszczając ją w roztworze NaHCO3 (>40 mM). Podłącz elektrodę do bieguna ujemnego generatora napięcia prądu stałego (1-2 V, biegun dodatni: drut srebrny lub platynowy) i obserwuj tworzenie się pęcherzyków na końcówce pod mikroskopem preparacyjnym (powiększenie >60x).</li>
	<li>Umieść testowaną elektrodę stymulacyjną wolframową z izolacją epoksydową w uchwycie manipulatora, a przewody odniesienia w komorze plastora.</li>
	<li>Dodaj drugą elektrodę odniesienia do komory i podłącz ją do gniazda referencyjnego stopnia czołowego elektrody rejestrującej (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
	<li>W oprogramowaniu sterującym wzmacniaczem kliknij pole "tryb zerowego zacisku" i kontynuuj, klikając dwukrotnie pole "lista wzmocnień wyjściowych". Wybierz wzmocnienie "100", kliknij dwukrotnie "pole listy filtrów górnoprzepustowych (Bessel)", wybierz "0.1 Hz" i kliknij dwukrotnie "pole listy filtrów dolnoprzepustowych (AC)", aby wybrać "3 kHz".</li>
	<li>W oprogramowaniu do nagrywania kliknij przycisk "Acquire | Otwórz protokół." Wybierz protokół, który ma ustawienia pozwalające na stymulację epizodyczną i digitalizację wzmocnionych potencjałów przy 10-20 kHz przez 50-100 ms i który automatycznie uruchamia izolator bodźca 10 ms po rozpoczęciu nagrania epizodycznego.</li>
	<li>Umieść elektrody stymulacyjne i rejestrujące w linii i równolegle do warstwy piramidalnej, na przykład (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B i <silna klasa="xfig">Rysunek 5).</li>
	<li>Kliknij "Zdobądź | Edytuj protokół" i wybierz zakładkę "wyzwalacz" (w wyskakującym okienku). Kliknij pole "źródło wyzwalaczy" i wybierz "spację" jako źródło wyzwalacza. Kliknij przycisk "OK". Kliknij przycisk "nagraj", aby rozpocząć akwizycję i zanotuj wyskakujące okienko z przyciskiem wyzwalającym.</li>
	<li>W oprogramowaniu izolatora bodźców kliknij pole "kontrola napięcia" i wprowadź "0". Kliknij przycisk "pobierz". Kliknij okno "oprogramowanie do nagrywania" i naciśnij spację. Powtórz ten cykl, wprowadzając sekwencyjnie wartości od 1 do 8, na przykład w krokach co 1 mV w polu "kontrola napięcia".</li>
	<li>Skoreluj siłę stymulacji z wartościami nachylenia fEPSP i określ siłę stymulacji wymaganą do uzyskania 40% maksymalnego nachylenia fEPSP. Kliknij "pole kontroli napięcia" i wprowadź określoną wartość. Kliknij przycisk "pobierz". 
	UWAGA: Izolator bodźca służy do przykładania krótkich impulsów napięcia lub prądu do tkanki mózgowej. Impulsy dwufazowe mogą mieć 100 μs na fazę.</li>
	<li>W oprogramowaniu do nagrywania kliknij przycisk zatrzymania, a następnie menu "Pobierz". Kliknij "Edytuj protokół" i wybierz zakładkę "wyzwalacz" w wyskakującym okienku. Kliknij pole źródła wyzwalacza i wybierz "wewnętrzny licznik czasu" jako źródło wyzwalacza. Kliknij przycisk "OK". Kliknij przycisk nagrywania, który rozpoczyna automatyczne rejestrowanie potencjałów pola na przykład co 30 s. Kliknij przycisk "stop" po 30-60 min.</li>
	<li>Kliknij menu "Pobierz", kliknij "Otwórz protokół", wybierz żądany protokół indukcji plastyczności synaptycznej i kliknij przycisk "OK". Kliknij przycisk "nagrywaj", aby automatycznie aktywować stymulację i nagrywanie wysokiej częstotliwości. Kliknij przycisk "zatrzymaj". 
	UWAGA: W przypadku badań dotyczących plastyczności synaptycznej należy zastosować jeden ze standardowych paradygmatów indukcji dla długotrwałego wzmocnienia lub długotrwałej depresji po długotrwałym zapisie wyjściowym. Reprezentatywne przykłady wynikającej modulacji transmisji synaptycznej przedstawiono na Rysunek 7 i <silna klasa="xfig">Rysunek 8.</li>
	<li>W oprogramowaniu do nagrywania kliknij "Acquire | Otwórz protokół" i wybierz ten sam protokół, co w kroku 4.12. Kliknij przycisk "OK", a następnie kliknij "nagraj". Kontynuuj automatyczne uruchamianie nagrań potencjału terenowego, na przykład przez 2-4 godziny. Kliknij przycisk "zatrzymaj", aby zakończyć nagrywanie.</li>
	<li>W przypadku badań farmaceutycznych należy nanieść związek bezpośrednio do zbiornika aCSF, jeśli pożądane jest stałe podawanie związku (<silna klasa = "xfig">Ryc. 6).</li>
</ol>
5. Czyszczenie konfiguracji i wskazówek
UWAGA: Poniżej znajdują się ogólne wskazówki.
<ol>
	<li>System należy czyścić co tydzień, poddając recyklingowi 10% H2O2 przez nie więcej niż 20 minut, a następnie myć dejonizowanym H2O. 
	UWAGA: Etanol nie jest zalecany do czyszczenia. Nie zaleca się również zanurzania przewodów odniesienia i obiektywu wH2O2.</li>
	<li>Usunąć wytrąconą sól z powierzchni soczewki obiektywu lub otoczenia komory za pomocą 0,1 N HCl, a następnie wody.</li>
	<li>Umyj bełkotkę karbogeniczną w wodzie destylowanej lub 0,1 N HCl.</li>
	<li>Raz w tygodniu zanurzyć komorę inkubacji plastrów w 10% H2O2 na 5 minut, a następnie dokładnie przepłukać komorę inkubacyjną dejonizowanymH2O.</li>
	<li>W przypadku elektrod stymulacyjnych z metalu, po każdym eksperymencie przepłucz końcówkę elektrody stymulującej wodą dejonizowaną i delikatnie przetrzyj końcówkę elektrody stymulującej wacikiem nasączonym etanolem w celu usunięcia resztek tkanki.</li>
	<li>Zmniejsz opór komercyjnych elektrod do stymulacji metalu, usuwając izolację na końcówce poprzez ostrożne przeciągnięcie papierem ściernym.</li>
	<li>Zmniejszenie strat karbogenu z aCSF podczas recyklingu przez rurki poprzez zastąpienie rurek silikonowych rurkami z politetrafluoroetylenu.</li>
	<li>Trzymaj srebrne druty elektrody rejestrującej i elektrody odniesienia w wybielaczu przez kilka dni, aby utworzyć AgCl na powierzchni drutu.</li>
</ol>

<ol><li>McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+response+in+vitro+to+electrical+stimulation+of+sections+of+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain.</a> Biochem J. 48 (4), (1951).</li>
<li>McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+in+vitro+from+the+piriform+cortex+of+the+rat%2C+and+their+susceptibility+to+centrally-acting+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs.</a> J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).</li>
<li>Yamamoto, C., McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activities+in+thin+sections+from+the+mammalian+brain+maintained+in+chemically-defined+media+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro.</a> J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).</li>
<li>Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamellar+organization+of+hippocampal+excitatory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand%22%5BJournal%5D)">Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways.</a> Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).</li>
<li>Skrede, K. K., Westgaard, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transverse+hippocampal+slice%3A+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).</li>
<li>Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slices+have+more+synapses+than+perfusion-fixed+hippocampus+from+both+young+and+mature+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats.</a> J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).</li>
<li>Schwartzkroin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+CA1+neurons+recorded+intracellularly+in+the+hippocampal+in+vitro+slice+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation.</a> Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).</li>
<li>Schwartzkroin, P. A., Wester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+facilitation+of+a+synaptic+potential+following+tetanization+in+the+in+vitro+hippocampal+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice.</a> Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).</li>
<li>Reymann, K. G., Frey, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+late+maintenance+of+hippocampal+LTP%3A+requirements%2C+phases%2C+%27synaptic+tagging%27%2C+%27late-associativity%27+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharm%22%5BJournal%5D)">The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, 'synaptic tagging', 'late-associativity' and implications.</a> Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).</li>
<li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+in+health+and+disease%3A+introduction+and+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129(2014).</li>
<li>Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+potentiation+of+synaptic+transmission+in+the+dentate+area+of+the+unanaestetized+rabbit+following+stimulation+of+the+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path.</a> J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).</li>
<li>Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+in+the+Use+of+Brain-Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Pitfalls in the Use of Brain-Slices.</a> Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).</li>
<li>Hajos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+network+activity+in+submerged+hippocampal+slices%3A+importance+of+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply.</a> Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).</li>
<li>Redondo, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+tagging+and+capture%3A+differential+role+of+distinct+calcium%2Fcalmodulin+kinases+in+protein+synthesis-dependent+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation.</a> J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).</li>
<li>Stopps, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+a+novel+brain+slice+system+that+permits+independent+electrophysiological+recordings+from+multiple+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices.</a> J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).</li>
<li>Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+gene+expression+during+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Imaging of gene expression during long-term potentiation.</a> Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).</li>
<li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li>
<li>Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+protein+synthesis+and+degradation+in+long-term+potentiation+of+Schaffer+collateral+CA1+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses.</a> J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).</li>
<li>Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiation+of+Schaffer-Collateral+CA1+Synaptic+Transmission+by+eEF2K+and+p38+MAPK+Mediated+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms.</a> Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).</li>
<li>Meduna, L. J., Jackman, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+dioxide+inhalation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Publ+Assoc+Res+Nerv+Ment+Dis%22%5BJournal%5D)">Carbon dioxide inhalation therapy.</a> Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).</li>
<li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CA1+nuclear+enriched+fractions+from+hippocampal+slices+to+study+activity-dependent+nuclear+import+of+synapto-nuclear+messenger+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins.</a> J Vis Exp. (90), e51310(2014).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+%28P25-30%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).</li>
<li>Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+and+basal+orthodromic+population+spikes+in+hippocampal+CA1+in+vivo+show+different+origins+and+patterns+of+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation.</a> J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).</li>
<li>Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+microcirculation+chamber+for+inexpensive+long-term+investigations+of+nervous+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro.</a> Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).</li>
<li>Shetty, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Synaptic+Tagging%2FCapture+and+Cross-capture+using+Acute+Hippocampal+Slices+from+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Du, H., Lin, J., Zuercher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+efficiency+of+CO2+injection+into+seawater+by+a+venturi+than+a+conventional+diffuser+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour+Technol%22%5BJournal%5D)">Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system.</a> Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).</li>
<li>Weinman, J., Mahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Analysis+of+Electrical+Properties+of+Metal+Electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Electron+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes.</a> Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).</li>
<li>Fanselow, M. S., Dong, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+the+dorsal+and+ventral+hippocampus+functionally+distinct+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures.</a> Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+BDNF-gene+transcripts+with+short+3%27+UTR+in+hippocampal+CA1+neurons+improves+memory+formation+and+enhances+synaptic+plasticity-relevant+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways.</a> Neurobiol Learn Mem. , (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Chociaż komory warstwowe interfejsu wykazują bardziej odporne odpowiedzi synaptyczne 25,26,27,28, komory zanurzeniowe zapewniają dodatkową wygodę przy nagrywaniu patch-clamp i obrazowaniu fluorescencyjnym. W związku z tym opisaliśmy kilka aspektów zapisów potencjału pola w ostrych wycinkach hipokampa za pomocą komercyjnej komory zanurzeniowej, którą można łatwo rozszerzyć o obrazowanie sond flu...

W 1951 roku przeprowadzono pierwsze opisane eksperymenty z ostrym wycinkiem mózgu1. W 1971 roku, po udanych zapisach in vitro z kory gruszkowatej2,3 i odkryciu, że neurony hipokampa są połączone poprzecznie wzdłuż osi przegrodowo-skroniowej hipokampa4, osiągnięto jeden z pierwszych zapisów aktywności neuronalnej hipokampa in vitro5. Podobieństwo parametrów neurofizjologicznych lub neurostrukturalnych neuronów w warunkach in vivo i in vitro jest nadal przedmiotem dyskusji6, ale w 1975 roku Schwartzkroin7 wskazał, że podstawowe właściwości neuronów są zachowane in vitro i że stymulacja wysokiej częstotliwości (tj. tetanizacja) aferentów w formacji hipokampa indukuje długotrwałe ułatwienie potencjałów synaptycznych8. Elektrofizjologiczny zapis aktywności neuronalnej in vitro znacznie rozszerzył badania nad komórkowymi mechanizmami plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności9,10, która została odkryta w 1973 roku przez Bliss et al.11 w eksperymentach in vivo na królikach.
Badanie aktywności neuronalnej lub szlaków sygnałowych w wycinkach mózgu, a zwłaszcza w ostrych wycinkach hipokampa, jest teraz standardowym narzędziem. Jednak, co zaskakujące, eksperymenty in vitro nie zostały jeszcze ustandaryzowane, o czym świadczy wiele podejść, które nadal istnieją w przypadku przygotowania i utrzymania ostrych plastrów hipokampa. Reid et al. (1988)12 dokonali przeglądu wyzwań metodologicznych związanych z utrzymaniem ostrych wycinków mózgu w różnych typach komór do wycinków oraz wyborem podłoża do kąpieli, pH, temperatury i poziomu tlenu. Parametry te są nadal trudne do kontrolowania w komorze zapisu ze względu na wykonane na zamówienie elementy zestawów do nagrywania warstw in vitro. Można znaleźć publikacje, które mogą pomóc w przezwyciężeniu niektórych wyzwań metodologicznych i które opisują nowe typy komór zanurzeniowych, takie jak międzywęzłowy system mikroperfuzji 3D13, komora o zwiększonym przepływie laminarnym i dopływie tlenu14, system ze skomputeryzowaną kontrolą temperatury15, oraz wielokomorowy system rejestracji16. Ponieważ komory te nie są łatwe do zbudowania, większość naukowców polega na dostępnych na rynku komorach warstwowych. Komory te mogą być zamontowane na systemie mikroskopowym, co pozwala na połączenie elektrofizjologii i obrazowania fluorescencyjnego17,18,19. Ponieważ komory te utrzymują wycinki mózgu zanurzone w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF), konieczne jest utrzymanie wysokiego natężenia przepływu roztworu buforowego, co zwiększa koszty aplikacji leków. W tym celu zastosowaliśmy system perfuzji recyklingowej z karbonizacją odpływową, który zapewnia wystarczającą stabilność do długotrwałego rejestrowania potencjałów pola w komorze zanurzeniowej przy użyciu stosunkowo małej objętości aCSF. Ponadto podsumowaliśmy, w jaki sposób zastosowanie tego eksperymentalnego systemu karbonizacji/perfuzji wpływa na wynik plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności10 i jak hamowanie kinazy eukariotycznego czynnika wydłużenia-2 (eEF2K) moduluje transmisję synaptyczną20.

<table><tbody><tr><td>< silny> Wymagane odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, Chiny</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, Chiny</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>10017618</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &środkowa kropka; 6H2O</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm, Chiny</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik chemiczny CaCl2</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>10005861</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik chemiczny NaHCO3</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>10018960</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Odczynnik chemiczny Sinopharm, Chiny</td><td>10010518</td><td></td></tr><tr><td>NaH2 PO4</td><td>Sinopharm Odczynnik chemiczny, Chiny</td><td>20040718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>A4043</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sinopharm, Chiny</td><td>20025118</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik chemiczny NaOH Sinopharm, Chiny</td><td>10019718</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia i materiały do sekcji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decapitators</td><td>Aparat Harvard</td><td>55-0012</td><td>do dekapitacji szczurów</td></tr><tr><td>Nożyczki do bandaży</td><td>SCHREIBER</td><td>12-4227</td><td>do dekapitacji myszy</td></tr><tr>Ostrze<td>obosieczne</td><td>Flying Eagle, Chiny</td><td>Nożyczki 74-C</td><td></td></tr><tr><td>IRIS</td><td>RWD, Chiny</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>Bone Rongeurs</td><td>RWD, Chiny</td><td>S22002-14</td><td></td></tr><tr><td>Łyżka</td><td>Hammacher&nbsp;</td><td>HSN 152-13</td><td></td></tr><tr><td>szpatułka do cementu dentystycznego</td><td>Hammacher&nbsp;</td><td>HSN 016-15</td><td></td></tr><tr><td>dentystyczna koparka dwustronna</td><td>Blacksmith Surgical, USA</td><td>BS-415-017</td><td></td></tr><tr><td>Wibracyjny mikrotom</td><td>Leica, Niemcy</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>ostrze chirurgiczne&nbsp;</td><td>RWD, Chiny</td> Uchwyt chirurgiczny <td>S31023-02</td><td></td></tr><tr><td></td><td>RWD, Chiny</td><td>S32007-14</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt i materiały do elektrofizjologii</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do pipet</td><td>Narishige, Japonia</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Stół do izolacji drgań</td><td>Meirits, Japonia</td><td>ADZ-A0806</td><td></td></tr><tr><td>nagrywanie w zanurzeniu komora</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>4-osiowy mikromanipulator</td><td>Sutter, USA</td><td>MP-285, MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Wire</td><td>World Precision Instruments</td><td>PTP406</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Urządzenia molekularne, USA</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji danych</td><td>Urządzenia molekularne, USA</td><td>Analizator Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td> oprogramowanie</td><td>Molecular Devices, USA</td> Mikroskop fluorescencyjny <td>Clampex 10.2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon, Japonia</td> Źródło światła LED <td>FN1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Lumen Dynamics Group, Kanada</td> Mikropipety <td>X-cite 120LED</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aparatura Harvarda</td><td>GC150TF</td><td>zapis pozakomórkowy</td></tr><tr><td>Mikropipety borokrzemianowe</td><td>Sutter, USA</td><td>BF150-86</td> zacisk <td>krosowy</td></tr><tr><td>elektroda wolframowa</td><td>AM Systems, USA</td><td>575500</td><td></td></tr><tr><td>pompa perystaltyczna</td><td>Longer, Chiny</td><td>Rurki BT00-300T</td><td></td></tr><tr><td>do pompy perystaltycznej</td><td>ISMATEC, Wertheim, Niemcy</td><td>SC0309</td><td>1x dopływ, ID: 1,02 mm</td></tr><tr><td>rurki do pompy perystaltycznej</td><td>ISMATEC, Wertheim, Niemcy</td><td>SC0319</td><td>2x rurki odpływowe, ID: 2,79 mm</td></tr><tr><td>kamera CCD</td><td>PCO, Niemcy</td> papier do czyszczenia soczewek <td>pco.edge sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa</td><td></td><td></td> Kodak 50 ml Thermo scientific 339652 <td></td></tr><tr><td>Komora wstępna</td><td>Warner Instruments</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>Grzałka liniowa</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Mimo że eksperymenty na wycinkach mózgu są używane od 1951 roku, nadal występują problemy, które zmniejszają prawdopodobieństwo osiągnięcia stabilnej i udanej analizy modulacji transmisji synaptycznej podczas wykonywania zapisów potencjału pola lub wewnątrzkomórkowych. W artykule opisano aspekty metodologiczne, które mogą być pomocne w poprawie warunków eksperymentalnych dla utrzymania ostrych wycinków mózgu oraz dla rejestracji pobudzających potencjałów postsynaptycznych w dostępnej na rynku komorze zanurzeniowej z jednostką wypływu-karbonacji. Karbonowanie wypływowe pomaga ustabilizować poziom tlenu w eksperymentach, które opierają się na recyklingu małego zbiornika buforowego w celu zwiększenia efektywności kosztowej eksperymentów z lekami. Ponadto w manuskrypcie przedstawiono reprezentatywne eksperymenty, które badają wpływ różnych trybów karbonizacji i paradygmatów stymulacji na zależną od aktywności plastyczność synaptyczną transmisji synaptycznej.

W sekcji protokołu opisaliśmy przygotowanie ostrych skrawków hipokampa z brzusznej i pośredniej części formacji hipokampa (Rycina 1) samców myszy C57BL/6 oraz samców szczurów Wistar (5–8 tygodni). Położenie półkul na platformie do skrawania pomaga utrzymać je w stabilnej pozycji i eliminuje konieczność stabilizacji za pomocą agaru lub agarozy. Sam system perfuzyjny opiera się na pompie perystaltycznej pracującej na wysokich obrotach w celu zapewnienia wymagan...

Ten protokół opisuje stabilizację poziomu tlenu w małej objętości buforu z recyklingu oraz metodologiczne aspekty rejestrowania plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności w zanurzonych ostrych wycinkach hipokampa.

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie metody zapewniającej uproszczony sposób karbogenacji małych objętości recyrkulowanego ACSF oraz umożliwienie długotrwałych rejestracji potencjałów polowych z wykorzystaniem komory rejestracyjnej zamontowanej na mikroskopie fluorescencyjnym. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuroplastyczności dotyczące podstawowych szlaków ligandowych regulujących transmisję synaptyczną oraz tworzenie pamięci w komórkowym modelu uczenia się i pamięci. Główną zaletą tej techniki jest pomoc w stabilizacji poziomu tlenu w małym biorezerwuarze, co zwiększa efektywność kosztową eksperymentów z wykorzystaniem specyficznych antagonistów lub agonistów.Przygotowanie ostrych przekrojów hipokampa jest prezentowane przez doktorantów naszego laboratorium, Xia i Weiguanga. Aby rozpocząć tę procedurę, należy użyć zimnego skalpela do wycięcia fragmentu kory grzbietowej pod kątem 70 stopni wzdłuż krawędzi grzbietowej każdej półkuli. Za pomocą zimnej szpatułki do cementu dentystycznego przenieś każdą półkulę na kawałek papieru filtrującego, aby krótko osuszyć powierzchnię.Przymocuj dwie półkule z nowo wyciętymi powierzchniami do lodowatej platformy do krojenia za pomocą szybkoutwardzalnego kleju, tak aby koniec ogonowy półkul był skierowany w stronę ostrza brzytwy. Następnie umieść platformę do krojenia w komorze chłodzącej wibratomu. Napełnij komorę buforem do krojenia w temperaturze od 2 do 4 °C i nasyć go karbogenem.Następnie, przy zastosowaniu odpowiednich ustawień wibrotomu, należy wykonać skrawki o grubości 350 µm. Formację hipokampa należy oddzielić od subikulum i kory entorynalnej, używając dwóch kaniul do iniekcji jako nożyczek. Pęcherzyki powietrza z siatki do utrzymywania skrawków w uprzednio przygotowanej komorze inkubacyjnej należy usunąć za pomocą pipety Pasteura.Następnie, za pomocą pipety Pasteura o szerokim wylocie, przenieś plastry wykazujące pewną przezroczystość w obrębie stratum pyramidal z platformy do krojenia na siatkę komory inkubacyjnej. Na tym etapie do odpływu systemu recyrkulacji należy dodać trójdrożny konektor rurek. Środnie ramię konektora trójdrożnego podłącz do rurki z dopływem carbogenu i wyreguluj szybkość przepływu za pomocą przepływomierza.Następnie do wlotu systemu recyrkulacyjnego dodaj drugi trójdrożny łącznik rurek. Środnie ramię połącz z rurką skierowaną w stronę grzałki przepływowej, górne ramię z cienką rurką silikonową, a dolne ramię z rurką doprowadzającą płyn z rezerwuaru. Następnie na cienkiej rurce silikonowej zamocuj zacisk do rurek w miejscu, w którym pulsacja ACSF w komorze z plastrami generowana przez pompę perystaltyczną jest minimalna.Następnie namocz przez kilka minut w komorze do cięcia metodą imersyjną mały kawałek papieru do czyszczenia soczewek oraz nylonową siatkę przymocowaną do platynowego drutu w kształcie litery U. Po tym czasie wyjmij platynowy drut w kształcie litery U. Wyłącz recyrkulację i umieść skrawek tkanki na papierze do czyszczenia soczewek.Następnie niezwłocznie umieść siatkę do utrzymywania skrawka na jego wierzchu. Włącz pompę i pozostaw skrawek do równowagi na 30 minut, nie zanurzając obiektywu w ACSF. W międzyczasie napełnij elektrodę rejestrującą ACSF i zamontuj ją w uchwycie do pipet.Sprawdź izolację metalowej elektrody stymulującej, umieszczając ją w roztworze wodorowęglanu sodu. Podłącz elektrodę do bieguna ujemnego generatora napięcia DC i obserwuj powstawanie pęcherzyków na końcówce pod mikroskopem sekcyjnym. Następnie umieść przetestowaną, izolowaną epoksydem wolframową elektrodę stymulującą w uchwycie manipulatora, a drut referencyjny w komorze do skrawków.Dodaj drugą elektrodę odniesienia do komory i podłącz ją do gniazda odniesienia w przedwzmacniaczu elektrody rejestrującej. W oprogramowaniu sterującym wzmacniaczem zaznacz pole trybu zero clamp, a następnie dwukrotnie kliknij listę wzmocnienia wyjściowego. Wybierz wzmocnienie 100, dwukrotnie kliknij pole filtra górnoprzepustowego, wybierz 3 kHz i dwukrotnie kliknij listę filtrów dolnoprzepustowych AC, aby wybrać 0,1 Hz.W oprogramowaniu do rejestracji kliknij acquire, open protocol. Wybierz protokół z ustawieniami umożliwiającymi stymulacje epizodyczne i digitalizację wzmocnionych potencjałów z częstotliwością od 10 do 20 kHz przez 50 do 100 ms, który automatycznie uruchamia izolator stymulatora 10 ms po rozpoczęciu rejestracji epizodycznej. Umieść elektrody stymulujące i rejestrujące w linii równolegle do stratum pyramidale.Następnie kliknij acquire, edit protocol i wybierz kartę trigger w oknie wyskakującym. Kliknij pole trigger source i wybierz space bar jako źródło wyzwalacza. Następnie kliknij przycisk okay i kliknij przycisk record, aby rozpocząć akwizycję.W oprogramowaniu izolatora bodźców kliknij pole sterowania napięciem i wprowadź wartość zero. Kliknij przycisk pobierania (download). Następnie kliknij okno oprogramowania do rejestracji i naciśnij pasek spacji.Powtórz ten cykl, wprowadzając sekwencyjnie wartości od 1000 do 8000. Powiąż natężenie stymulacji z wartościami nachylenia FEPSP i wyznacz natężenie stymulacji wymagane do uzyskania 40% maksymalnego nachylenia FEPSP. Kliknij pole sterowania napięciem i wprowadź wyznaczoną wartość.Następnie kliknij przycisk pobierania. W oprogramowaniu do rejestracji kliknij przycisk stop, a następnie menu akwizycji. Kliknij opcję edytuj protokół i wybierz zakładkę wyzwalacz w wyskakującym oknie.Następnie kliknij pole źródła wyzwalania i wybierz wewnętrzny timer jako źródło wyzwalania. Kliknij przycisk OK, a następnie przycisk rejestracji, aby rozpocząć automatyczny zapis potencjałów polowych co 60 sekund. Po 30 do 60 minutach kliknij przycisk stop.W oprogramowaniu rejestrującym kliknij acquire, otwórz protokół i wybierz ten sam protokół, który został użyty do pomiaru bazowego. Kliknij przycisk okay, a następnie kliknij record. Kontynuuj automatyczną rejestrację potencjałów polowych przez okres od dwóch do czterech godzin.Po zakończeniu kliknij przycisk stop, aby przerwać nagrywanie. Na tym rysunku przedstawiono reprezentatywne zapisy potencjacji transmisji synaptycznej zależnej od aktywności, z wykorzystaniem karbogenacji odpływowej oraz karbogenacji zbiornikowej z recyrkulacją małego zbiornika ACSF. Potencjację wywołano po punkcie czasowym zero za pomocą trzech serii impulsów o częstotliwości 100 Hz.Rycina ta pokazuje, że karbogenacja odpływu z recyrkulacją małego zbiornika ACSF poprawiła indukcję LTD w porównaniu z eksperymentami z samą karbogenacją zbiornika. Po opanowaniu techniki przygotowanie skrawka można przeprowadzić w czasie od 5 do 10 minut, a przy prawidłowym wykonaniu można również uzyskać stabilny zapis potencjału polowego przez wiele godzin. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest dostosowanie poziomu karbogenacji, prędkości perfuzji, położenia elektrod oraz intensywności stymulacji do konkretnej konfiguracji aparatury.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak patch clamp czy mikroskopia kryminalistyczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące wirylizacji soku, lokalizacji komórkowej sond ravin w odpowiedzi na indukcję zależnej od aktywności plastyczności synaptycznej. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie neuroplastyczności do badania zależnej od aktywności plastyczności synaptycznej jako komórkowego mechanizmu uczenia się i pamięci w plastrach hipokampa in vitro pobranych od myszy typu dzikiego oraz transgenicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować świeże plastry z hipokampa skroniowego oraz jak uzyskać stabilne warunki do długoterminowej rejestracji transmisji synaptycznych przy użyciu niewielkiej objętości recyrkulowanego ACSF.Należy pamiętać, że praca ze zwierzętami i związkami chemicznymi może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i właściwa dezynfekcja.

recording-synaptic-plasticity-acute-hippocampal-slices-maintained

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Opisano przygotowanie ostrych skrawków mózgu z izolowanych struktur hipokampa oraz jednoczesne rejestracje elektrofizjologiczne astrocytów i neuronów w stratum radiatum podczas stymulacji kolaterali Schaffera. Zaprezentowano farmakologiczną izolację prądów transporterów potasu i glutaminianu w astroglei.

Podwójne rejestracje elektrofizjologiczne odpowiedzi astroglialnych i neuronalnych wywołanych synaptycznie w ostrych skrawkach hipokampa

Ten film demonstruje procedurę ustawiania wycinka mózgu w komorze zanurzeniowej w celu rejestrowania aktywności synaptycznej. Proces ten polega na zabezpieczeniu wycinka na papierze soczewki, utrzymaniu ciągłego przepływu sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) w celu zapewnienia żywotności neuronów oraz dokładnym ustawieniu elektrod stymulacyjnych i rejestrujących względem określonego obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Taka konfiguracja pozwala na precyzyjne monitorowanie...

Rejestrowanie pobudzających potencjałów postsynaptycznych pola neuronalnego w ostrych wycinkach hipokampa

Ten film demonstruje metodę rejestrowania odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1 w wycinku hipokampa szczura. Przedstawiono w nim kroki związane z umieszczeniem elektrod stymulujących i rejestrujących na wycinku hipokampa oraz pomiarem pobudzającego potencjału postsynaptycznego pola (fEPSP) w celu oceny siły odpowiedzi synaptycznej.

Rejestrowanie odpowiedzi synaptycznych CA3-CA1 w wycinku hipokampa szczura

Ten film pokazuje rejestrację rytmicznej aktywności sieci neuronalnej, znanej również jako oscylacje theta, w izolowanym hipokampie. Elektrody są umieszczane w różnych warstwach i pozycjach przestrzennych w celu wykrywania i analizowania oscylacji theta. Pokazuje to unikalny skład neuronalny i łączność sieci neuronalnej w różnych warstwach hipokampa.

Zapis in vitro oscylacji theta w hipokampie myszy

Ten artykuł przedstawia kompletną metodologię przygotowania i konserwacji in vitro ostrych wycinków hipokampa od dorosłych myszy. Protokół ten pozwala na rejestrowanie bardzo stabilnego, długotrwałego wzmocnienia (LTP) przez ponad 8 godzin ze wskaźnikiem sukcesu 95%.

Ulepszone przygotowanie i konserwacja wycinków myszy z hipokampa w celu uzyskania bardzo stabilnego i powtarzalnego zapisu długotrwałego wzmocnienia

Ten artykuł wideo opisuje eksperymentalne procedury badania długoterminowej plastyczności i jej procesów asocjacyjnych, takich jak znakowanie synaptyczne, przechwytywanie i krzyżowanie w neuronach piramidowych CA1 przy użyciu ostrych wycinków hipokampa od gryzoni.

Badanie znakowania/przechwytywania synaptycznego i przechwytywania krzyżowego przy użyciu ostrych plastrów hipokampa od gryzoni

Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.

Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego

Prezentowany protokół opisuje transport i przygotowanie wyciętej ludzkiej tkanki hipokampa, której ostatecznym celem jest wykorzystanie ważnych wycinków mózgu jako narzędzia do oceny przedklinicznej potencjalnych substancji przeciwpadaczkowych.

Przygotowanie ostrych wycinków ludzkiego hipokampa do zapisów elektrofizjologicznych

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Poznaj metodę rejestracji plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa przy użyciu systemu recyklingu małej objętości. Technika ta stabilizuje poziom tlenu i umożliwia długotrwałe pomiary potencjałów polowych.

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości (Wideo) | JoVE Journal

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Przeglądaj więcej filmów