Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie metody zapewniającej uproszczone metody karbonizacji ACSF do recyklingu małoobjętościowego oraz uzyskanie długoterminowych zapisów potencjałów pola przy użyciu komory rejestracyjnej zamontowanej na mikroskopie fluorescencyjnym. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuroplastyczności związane z leżącymi u podstaw szlakami ligniny, które regulują przekaźnictwo synaptyczne i tworzenie pamięci w komórkowym trybie uczenia się i wspomnień. Główną zaletą tej techniki jest to, że pomaga ustabilizować poziom tlenu w małym zbiorniku biologicznym w celu zwiększenia efektywności kosztowej eksperymentów z wykorzystaniem określonych antagonistów lub agonistów.

Przygotowanie ostrych wycinków hipokampa zostało zademonstrowane przez doktorantów, Xia i Weiguang z naszego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj zimnego ostrza chirurgicznego, aby wyciąć fragment kory grzbietowej pod kątem 70 stopni wzdłuż grzbietowej krawędzi każdej półkuli. Za pomocą zimnej szpatułki do cementu dentystycznego przenieś każdą półkulę na kawałek bibuły filtracyjnej, aby na krótko wysuszyć powierzchnię.

Zamontuj dwie półkule ze świeżo przyciętymi powierzchniami na lodowatej platformie do krojenia za pomocą szybko działającego kleju samoprzylepnego, tak aby ogonowy koniec półkul był skierowany w stronę żyletki. Następnie umieść platformę do krojenia w komorze chłodzącej wibratomu. Napełnij komorę buforem do krojenia w temperaturze od dwóch do czterech stopni Celsjusza i karbonuj go.

Następnie wytnij plastry o grubości 350 mikrometrów, stosując odpowiednie ustawienia wibrotomu. Odizoluj formację hipokampa od subiculum i kory śródwęchowej za pomocą dwóch kaniul iniekcyjnych jako nożyczek. Usunąć pęcherzyki z siatki przytrzymującej plastry uprzednio przygotowanej komory inkubacyjnej za pomocą pipety Pasteura.

Następnie przenieś plastry, które mają pewną przezroczystość w warstwie piramidalnej, z platformy do krojenia na siatce komory inkubacyjnej za pomocą pipety Pasteura z dużą końcówką. W tym kroku dodaj trójdrożny łącznik rurowy do odpływu systemu recyklingu. Podłącz środkowe ramię trójdrożnego łącznika rurki do rurki zasilającej karboken i wyreguluj natężenie przepływu za pomocą miernika przepływu powietrza.

Następnie dodaj drugi trójdrożny łącznik rurowy do dopływu systemu recyklingu. Podłącz środkowe ramię do rurki skierowanej w stronę grzałki wbudowanej, górne ramię do cienkiej silikonowej rurki, a dolne ramię do rurki dopływowej ze zbiornika. Następnie umieść wyciskarkę do rurek na cienkiej silikonowej rurce w miejscu wzdłuż rurki, w którym pulsacja ACSF w komorze plastrów generowana przez pompę okołoskurczową jest minimalna.

Teraz namocz na kilka minut mały kawałek papieru do czyszczenia soczewek i nylonową siatkę przymocowaną do platynowego drutu w kształcie litery U w komorze zanurzeniowej. Następnie usuń platynowy drut w kształcie litery U. Wyłącz recykling i połóż plasterek na papierze do czyszczenia soczewek.

Następnie natychmiast umieść siatkę przytrzymującą plasterki na wierzchu plasterka. Włącz pompę i pozwól plastrowi zrównoważyć się przez 30 minut bez zanurzania obiektywu w ACSF. W międzyczasie napełnij elektrodę rejestrującą ACSF i zamontuj ją w uchwycie na pipety.

Sprawdź izolację metalowej elektrody stymulacyjnej, umieszczając ją w roztworze wodorowęglanu sodu. Podłącz elektrodę do bieguna ujemnego generatora napięcia stałego i obserwuj tworzenie się pęcherzyków na końcówce pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie umieść testowaną elektrodę stymulacji wolframowej w izolacji apoksydowej w uchwycie manipulatora, a przewód odniesienia w komorze plastora.

Dodaj drugą elektrodę odniesienia do komory i podłącz ją do gniazda odniesienia stopnia głowicy elektrody rejestrującej. W oprogramowaniu sterującym wzmacniaczem kliknij pole trybu zerowego zacisku, a następnie kliknij dwukrotnie pole listy wzmocnienia wyjściowego. Wybierz wzmocnienie 100, kliknij dwukrotnie naczynie filtra górnoprzepustowego, wybierz trzy kiloherce i kliknij dwukrotnie pole listy filtrów dolnoprzepustowych AC, aby wybrać 0,1 herca.

W oprogramowaniu do nagrywania kliknij pobierz, otwórz protokół. Wybierz protokół, który ma ustawienia pozwalające na stymulację epizodyczną i digitalizację wzmocnionych potencjałów przy 10 do 20 kilohercach przez 50 do 100 milisekund i który automatycznie uruchamia izolator bodźca 10 milisekund po rozpoczęciu nagrania epizodycznego. Umieść elektrody stymulacyjne i rejestrujące w linii i równolegle do warstwy piramidalnej.

Następnie kliknij pobierz, edytuj protokół i wybierz zakładkę wyzwalacza w wyskakującym okienku. Kliknij pole źródła wyzwalacza i wybierz spację jako źródło wyzwalacza. Następnie kliknij przycisk w porządku i kliknij przycisk nagrywania, aby rozpocząć akwizycję.

W oprogramowaniu izolatora bodźców kliknij pole kontrolne napięcia i wprowadź zero. Kliknij przycisk pobierania. Następnie kliknij okno oprogramowania do nagrywania i naciśnij spację.

Powtórz ten cykl, wprowadzając sekwencyjnie wartości od 1000 do 8000. Skoreluj siłę stymulacji z wartościami nachylenia FEPSP i określ siłę stymulacji wymaganą do uzyskania 40% maksymalnego nachylenia FEPSP. Kliknij pole kontrolne napięcia i wprowadź określoną wartość.

Następnie kliknij przycisk pobierania. W oprogramowaniu do nagrywania kliknij przycisk zatrzymania, a następnie menu pobierania. Kliknij edytuj protokół i wybierz zakładkę wyzwalacza w wyskakującym okienku.

Następnie kliknij pole źródła wyzwalacza i wybierz wewnętrzny zegar jako źródło wyzwalacza. Kliknij przycisk OK, a następnie przycisk nagrywania, który rozpoczyna automatyczne rejestrowanie potencjałów pola co 60 sekund. Kliknij przycisk zatrzymania po 30 do 60 minutach.

W oprogramowaniu do nagrywania kliknij przycisk pobierz, otwórz protokół i wybierz ten sam protokół, co zapis bazowy. Kliknij przycisk OK, a następnie kliknij przycisk Nagraj. Kontynuuj automatyczne uruchamianie nagrań potencjału terenowego przez dwie do czterech godzin.

Po zakończeniu kliknij przycisk zatrzymania, aby zakończyć nagrywanie. Rysunek ten przedstawia reprezentatywne zapisy zależnego od aktywności wzmocnienia transmisji synaptycznej przy użyciu karbonizacji odpływowej i karbonenacji zbiornikowej z recyklingiem małego zbiornika ACSF. Wzmocnienie zostało wywołane po osiągnięciu punktu zerowego przez trzy razy 100 Hz na sekundę.

Rysunek ten pokazuje, że karbonowanie wypływowe z recyklingiem małego zbiornika ACSF poprawiło indukcję LTD w porównaniu z eksperymentami z karbogenacją tylko w zbiorniku. Po opanowaniu, przygotowanie plastra można wykonać w ciągu pięciu do 10 minut, a stabilny zapis potencjału pola można również osiągnąć przez wiele godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby dostosować poziom karbonizacji, prędkość perfuzji, położenie elektrod i stres stymulacyjny o określonej równoważności.

Po tej procedurze, można przeprowadzić inną metodę, taką jak zacisk krosowy, mikroskopię kryminalistyczną w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak wirylizacja lokalizacji komórkowej soków sond rawinowych w odpowiedzi na indukcję plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się neuroplastycznością do badania plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności jako komórkowego trybu uczenia się i pamięci w in vitro hipokampowych wycinkach dobrze urodzonych i transgenicznych genów myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać przygotowanie ostrego plastra z skroniowego hipokampa i jak uzyskać stabilne warunki do długotrwałego rejestrowania transmisji synaptycznych przy użyciu niewielkiej objętości przetworzonego ACSF.

Nie zapominaj, że praca ze zwierzętami i związkami chemicznymi może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i odpowiednia dezynfekcja.