Ukierunkowana integracja genów za pośrednictwem TALEN: wykorzystanie zmodyfikowanych nukleaz specyficznych dla sekwencji do precyzyjnej insercji genu białka fluorescencyjnego do hiPSC

Zacznij od indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej zawiesiny komórek macierzystych lub hiPSC w pożywce. Dodaj parę nukleazy efektorowej podobnej do aktywatora transkrypcji lub plazmidów kodujących TALEN. Suplement plazmidem dawcy zawierającym gen białka fluorescencyjnego, sprzężony z genem oporności na antybiotyki, z sąsiednimi ramionami homologicznymi w celu specyficznego dopasowania do docelowych loci.

Elektroporuj mieszaninę, aby wytworzyć przejściowe pory w błonach komórkowych, umożliwiając internalizację plazmidu. Po wejściu do komórek plazmidy kodujące TALEN są przetwarzane, wytwarzając TALEN-y - chimeryczne białka złożone z specyficznej dla miejsca domeny wiążącej DNA TALE, połączonej z niespecyficzną domeną cięcia endonukleazy restrykcyjnej FokI.

Każdy monomer TALEN poprzez swoją domenę wiążącą DNA - składającą się z tandemowych modułów powtórzeń aminokwasów - rozpoznaje i wiąże się z loci docelowymi, po jednym module na nukleotyd, na każdej nici DNA w przeciwnych orientacjach, oddzielonych sekwencją dystansową. Domeny FokI następnie dimeryzują i rozszczepiają DNA w sekwencji dystansowej, tworząc dwuniciowe pęknięcia z nawisami.

W obecności plazmidu dawcy zawierająceg