Ukierunkowana integracja genów za pośrednictwem TALEN: wykorzystanie zmodyfikowanych nukleaz specyficznych dla sekwencji do precyzyjnej insercji genu białka fluorescencyjnego do hiPSC

Zacznij od indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej zawiesiny komórek macierzystych lub hiPSC w pożywce. Dodaj parę nukleazy efektorowej podobnej do aktywatora transkrypcji lub plazmidów kodujących TALEN. Suplement plazmidem dawcy zawierającym gen białka fluorescencyjnego, sprzężony z genem oporności na antybiotyki, z sąsiednimi ramionami homologicznymi w celu specyficznego dopasowania do docelowych loci.

Elektroporuj mieszaninę, aby wytworzyć przejściowe pory w błonach komórkowych, umożliwiając internalizację plazmidu. Po wejściu do komórek plazmidy kodujące TALEN są przetwarzane, wytwarzając TALEN-y - chimeryczne białka złożone z specyficznej dla miejsca domeny wiążącej DNA TALE, połączonej z niespecyficzną domeną cięcia endonukleazy restrykcyjnej FokI.

Każdy monomer TALEN poprzez swoją domenę wiążącą DNA - składającą się z tandemowych modułów powtórzeń aminokwasów - rozpoznaje i wiąże się z loci docelowymi, po jednym module na nukleotyd, na każdej nici DNA w przeciwnych orientacjach, oddzielonych sekwencją dystansową. Domeny FokI następnie dimeryzują i rozszczepiają DNA w sekwencji dystansowej, tworząc dwuniciowe pęknięcia z nawisami.

W obecności plazmidu dawcy zawierającego ramiona homologiczne komplementarne do regionów flankujących rozszczepione miejsce, następuje naprawa ukierunkowana na homologię, wykorzystująca sekwencję homologiczną jako matrycę do syntezy naprawy DNA w celu wypełnienia pęknięć dwuniciowych. Po ligacji nacięć, białko fluorescencyjne i geny oporności na antybiotyki zostają zintegrowane z genomem gospodarza.

Traktuj hiPSC, wysiane na warstwie komórek żywiciela w celu wsparcia wzrostu, za pomocą pożywki zawierającej antybiotyki. Gen oporności na antybiotyki bez promotora - napędzany przez endogenny promotor - ułatwia selekcję komórek edytowanych przez TALEN.

Rozpocznij od przemycia kultur iPSC jeden raz PBS, a następnie dodaj 1 mililitr delikatnego odczynnika do dysocjacji komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 5 minut. Gdy więcej niż 50% komórek oddzieli się od naczynia hodowlanego, użyj pipety P1000, aby mechanicznie rozbić wszelkie pozostałe grudki komórek lub przyłączone komórki. Następnie dodaj 2 mililitry pożywki E8 do każdej studzienki i użyj 10-mililitrowej pipety, aby dalej zdezagregować kultury na zawiesiny jednokomórkowe.

Teraz wlej zebrane komórki do 15-mililitrowej stożkowej rurki i odkręć je. Ponownie zawiesić osad w minimalnej ilości podłoża E8 do liczenia. Następnie, po potwierdzeniu żywotności kultur przez wykluczenie błękitu trypanowego, a także ich wystarczającej dysocjacji, przenieś 3 miliony komórek do każdej z dwóch 15-mililitrowych stożkowych probówek.

Podczas wirowania komórek należy ustawić system elektroporacji na program specyficzny dla typu komórki dla linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, H9. Następnie dodać 10 mikrogramów samego dawcy rekombinacji homologicznej do 1 osadu dla próbki kontrolnej i 10 mikrogramów plazmidu dawcy rekombinacji homologicznej wraz z 5 mikrogramami każdego plazmidu TALEN dla próbki eksperymentalnej.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów kompletnego roztworu do transfekcji komórek pierwotnych P3 w temperaturze pokojowej do każdego z kontrolnych i eksperymentalnych granulek i ponownie zawieś komórki. Przenieś próbki do pojedynczych kuwet, a następnie poddaj je elektropolatacji. Natychmiast po transfekcji dodaj 500 mikrolitrów pożywki E8 o temperaturze pokojowej do każdej kuwety, a następnie przenieś przecięte próbki iPSC kroplami do pojedynczych 10-centymetrowych szalek zawierających mysie fibroblasty embrionalne DR4.