Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Edycja genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych jest wyzwaniem. Protokół ten zapewnia szczegółową procedurę edycji genomu w tych komórkach przy użyciu sparowanego przypadku Cas-90 w połączeniu z wektorem docelowym. Jest niezawodny i łatwy do naśladowania.

Główną zaletą tego protokołu jest to, że jest to bezproblemowa edycja genomu. Dwuetapowa selekcja pomaga zwiększyć liczbę docelowych komórek i sprawiła, że badania przesiewowe genotypowania są bardziej efektywne. Utrzymuj ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste na powierzchniach kodowanych rekombinowaną lamininą 21 w pożywce mTeSR1.

Komórki powinny osiągnąć zbieżność od 70 do 85%, 72 godziny po podziale od jednego do trzech. W dniu transfekcji pokryć wystarczającą ilość studzienek 24-dołkowej płytki 300 mikrolitrami roztworu lamininy 521 i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Po inkubacji delikatnie usunąć roztwór powlekający i natychmiast dodać 300 mikrolitrów świeżej pożywki mTeSR1, uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK do każdej studzienki.

Następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora. Wyjąć z inkubatora ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste. Usuń zużytą pożywkę i umyj komórki raz jednym mililitrem sterylnego DPBS.

Następnie dodaj jeden mililitr delikatnego odczynnika do dysocjacji komórek do każdej studzienki i inkubuj go w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć do ośmiu minut, aby zdysocjować komórki. Delikatnie postukaj w płytkę, aby upewnić się, że komórki mogą się łatwo odczepić. Następnie użyj końcówki P1000, aby podnieść komórki, pipetując w górę iw dół.

Dodaj dwa mililitry pożywki mTeSR1 z inhibitorem ROCK, aby zakończyć dysocjację. Dobrze wymieszaj zawiesinę i przenieś ją do 50-mililitrowej tubki. Odwirować komórki w temperaturze 200 G przez trzy minuty.

Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w dwóch mililitrach pożywki mTeSR1 z inhibitorem ROCK. Policz komórki za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego. Przenieś 800 000 do 1 miliona komórek do probówki o pojemności 1,5 mililitra dla każdej reakcji nukleofekcji i odwiruj je przy 200 G przez trzy minuty.

Następnie ostrożnie odessać supernatant. Wymieszaj trzy mikrogramy sparowanych plazmidów ekspresyjnych Cas-9n z pojedynczym przewodnikiem RNA i pięć mikrogramów docelowego plazmidu wektorowego w 100 mikrolitrach mieszanego roztworu nukleofekcji z zestawu do nukleofekcji ludzkich komórek macierzystych. Przygotuj również mieszaninę plazmidów kontrolnych GFP.

Ponownie zawieś komórki za pomocą mieszanki DNA i przenieś je do kuwety do elektroporacji, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Elektroporuj komórki za pomocą urządzenia do nukleofekcji, wykorzystując zoptymalizowane warunki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Natychmiast dodaj 500 mikrolitrów świeżej i ciepłej pożywki mTeSR1 uzupełnionej 10 mikromolowym inhibitorem ROCK do elektroporowanych ogniw

Następnie przenieś mieszaninę do dwóch dołków wcześniej przygotowanej płytki 24-dołkowej. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza zasilanym 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić komórkom regenerację. Wymień pożywkę do konserwacji komórek po 12 do 16 godzinach, wycofując inhibitor ROCK, jeśli komórki nawiążą kontakt komórka-komórka.

Po 24 do 48 godzinach sprawdź wydajność nukleofekcji, badając ekspresję GFP w komórkach kontrolnych. Rozpocznij selekcję komórek od uzupełnienia pożywki mTeSR1 jednym mikrogramem na mililitr puromycyny, 48 godzin po nukleofekcji. Po 72 godzinach uzupełnij pożywkę 0,5 mikrograma na mililitr puromycyny.

Jeśli konfluencja komórek jest mniejsza niż 30%, uzupełnij również podłoże 10-mikromolowym inhibitorem ROCK. Cztery do sześciu dni po pasażu nukleofekcji komórki oporne na puromycynę do 10 do 15 96 dołków w stężeniu 0,8 komórki na studzienkę. Upewnij się, że uzupełniasz podłoże inhibitorem ROCK i puromycyną.

Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 10% dwutlenku węgla przez 10 do 12 dni, aby utworzyć kolonie pochodzące z pojedynczych komórek. Uzupełnienie podłoża siedem dni po wysianiu. Zaznacz studzienki zawierające pojedynczą kolonię i zastąp pożywkę świeżą pożywką mTeSR1, zawierającą 0,5 mikrograma na mililitr puromycyny, ale bez inhibitora ROCK.

Hoduj komórki jeszcze przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie zmień pożywkę dla studzienek zawierających niezróżnicowane kolonie. Delikatnie zeskrob kolonie i przenieś zawiesinę komórek z jednej kolonii do dwóch nowych dołków na oddzielnych płytkach 96-dołkowych.

Jeden do genotypowania, a drugi do utrzymania. Gdy zbieg komórek genotypujących osiągnie 50% lub więcej, zrzuć zużyte podłoże i umyj komórki raz DPBS. Zdaj komórki za pomocą buforu Bradleya Lysis Buffer i wyizoluj genomowe DNA z każdej studzienki.

Po wykonaniu trzech PCR z połączeniem starterów i sekwencjonowaniu produktów, należy zachować kolonie z prawidłowym genotypem, a resztę wyrzucić. Namnażać odpowiednie kolonie pod ciągłą selekcją puromycyny i zamrażać je przy najwcześniejszym możliwym pasażu. Protokół ten został wykorzystany do wprowadzenia dwóch mutacji punktowych do eksonu8 genu alfa czynnika jądrowego hepatocytów.

Do przeprowadzenia badań przesiewowych w poszukiwaniu prawidłowo ukierunkowanych komórek zastosowano metodę PCR opartą na trzech starterach, a w celu potwierdzenia wyników PCR przeprowadzono sekwencjonowanie Sangera. Po wyjęciu kasety selekcyjnej zmodyfikowany region został ponownie zsekwencjonowany w celu potwierdzenia prawidłowego wprowadzenia pożądanych mutacji punktowych. Wybrano kolonie o prawidłowym genotypie, a komórki scharakteryzowano przed dalszą analizą.

Edytowane komórki mają taką samą morfologię jak komórki rodzicielskie i wyrażają reprezentatywne markery ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, w tym czynniki transkrypcyjne Nanog i Oct4, a także markery powierzchniowe komórek, SSEA-4 i TRA-160. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o sprawdzeniu zbiegu komórek po selekcji puromycyny w ciągu pierwszych 24 godzin. Niezbędne jest uzupełnienie mediany w inhibitor ROCK.

Jeśli zbieg komórek jest mniejszy niż 30%aby utrzymać komórki w ruchu. Po ustaleniu edytowanych przez genom linii pluripotencjalnych komórek macierzystych można je wykorzystać do badania funkcji genów lub ukierunkowanego różnicowania. Technika ta toruje naukowcom drogę do badania różnych kwestii, takich jak specyficzna funkcja genów lub celowana korekta genów w przypadku chorób genetycznych.