Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej roślin i komórki, takie jak: w jaki sposób możemy tworzyć białka w komórce. Główną zaletą tej techniki jest wysoka efektywność koekspresji komórkowych białek fuzyjnych w jednym wektorze ekspresyjnym. Procedurę zademonstruje Guitao Zhong, doktorant z naszego laboratorium.

Na początek zaprojektuj startery do klonowania molekularnego fragmentów DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Amplifikacja fragmentów DNA, które są niezbędne do budowy częściowo niezależnych kaset ekspresji białek za pomocą standardowych reakcji PCR z odpowiadającymi im starterami i polimerazą o wysokiej wierności. Należą do nich promotor, reporter fluorescencyjny, gen docelowy i terminator.

Zbadaj jakość produktów pierwszej rundy PCR, szukając degradacji i zanieczyszczenia DNA za pomocą elektroforezy DNA przy użyciu 1% żelu agarozowego. Określić ilościowo produkty PCR za pomocą spektrofotometru. Stosunek odczytów produktów PCR w 260 i 280 nanometrach powinien wynosić od 1,6 do 1,8.

Wymieszaj fragmenty DNA przeznaczone dla tej samej kasety ekspresji białka w jednej probówce PCR do końcowej objętości pięciu mikrolitrów. Informacje o mieszaniu danych DNS z różnych danych kasety wyrażeń. Ponieważ równa zmniejsza wydajność składania DNA, ze względu na rosnącą liczbę cząsteczek DNA, które muszą być połączone.

Teraz dodaj 15 mikrolitrów 2x głównej mieszaniny do 5 mikrolitrowej mieszaniny DNA i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 60 minut. Amplifikować całą częściowo niezależną kasetę ekspresji białek za pomocą drugiej rundy PCR. Użyć od 0,5 do jednego mikrolitra produktu z pierwszej rundy reakcji montażu izotermicznego jako szablon w najbardziej zewnętrznych starterach.

Użyj jednej jednostki polimerazy o wysokiej wierności w objętości reakcyjnej 50 mikrolitrów przez 30 cykli, a następnie końcowego przedłużenia w temperaturze 68 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie zlinearyzuj końcowy wektor szkieletu ekspresji białka POC 18 i wektor CAMBIA 1300, dodając cztery jednostki małej do końcowej objętości reakcyjnej 10 mikrolitrów. Wektory te są przeznaczone do przejściowej ekspresji białek i transformacji genetycznej.

Inkubować trawienie restrykcyjne przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po trawieniu dezaktywuj enzym restrykcyjny, inkubując w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie wymieszaj równomolowe cząsteczki DNA kaset ekspresji białek i zlinearyzowanego wektora końcowego w końcową objętość reakcji wynoszącą pięć mikrolitrów.

Na koniec wykonaj drugą rundę rekombinacji DNA, mieszając reakcję z 15 mikrolitrami 2x buforu głównego i inkubując w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 60 minut. Aby przygotować komórki zawiesinowe tytoniu BY-2 do bombardowania, należy zebrać 30 mililitrów 3-dniowych komórek BY-2 z 3-dniowej hodowli na kawałku 70-mililitrowej autoklawowanej bibuły filtracyjnej za pomocą pompy próżniowej, ustawiając ciśnienie podciśnienia na 40 milibarów. W międzyczasie dodaj kilka kropli płynnej pożywki hodowlanej BY-2 do szalki Petriego.

Przenieś bibułę filtracyjną z komórkami BY-2 na szalkę Petriego. Aby przygotować młode rośliny rzodkiewnika do bombardowania, należy przygotować siedmiodniowe próbki roślin, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie przenieś je do prostokąta pośrodku nowej płytki średniej MS o połowie mocy, aby zwiększyć skuteczność bombardowania.

Uważaj, aby nie nakładać się na rośliny podczas przenoszenia i umieszczania ich na talerzu. Dodaj kilka kropli płynnego podłoża MS o połowie mocy na powierzchnię roślin lub tkanek, aby zachować wilgoć i zapobiec wysuszeniu roślin podczas pozostałych etapów. Aby pokryć cząsteczki złota plazmidowym DNA, najpierw dokładnie wiruj roztwór mikronośnika złota przez trzy minuty.

Teraz dodaj 25 mikrolitrów cząsteczek złota do nowej 1,5-mililitrowej probówki i wiruj przez 10 sekund. Dodaj 10 mikrolitrów 25,46 miligrama na litr spermidyny i wiruj przez 10 sekund. Następnie dodaj pięć mikrolitrów jednego mikrograma na mikrolitr plazmidowego DNA i wiruj przez trzy minuty.

Na koniec dodaj 25 mikrolitrów 277,5 miligramów na litr roztworu chlorku wapnia i wiruj przez jedną minutę. Obracaj złote mikronośniki za pomocą wirówki stołowej z maksymalną prędkością przez pięć sekund. Po odwirowaniu ostrożnie wyciśnij sklarat z supernatentu, nie naruszając osadu.

Następnie umyj granulat 200 mikrolitrami absolutnego etanolu i ponownie zawiesij granulkę, wirując przez pięć do 10 sekund. Po wzmocnieniu wiruj złote mikronośniki z maksymalną prędkością przez pięć sekund i usuń etanol. Ponownie zawiesić cząsteczki złota w 18 mikrolitrach absolutnego etanolu.

Następnie podnieś sześć mikrolitrów zawiesiny cząstek na środek trzech mikronośników i pozwól im wyschnąć na powietrzu. Aby przenieść DNA do komórek i roślin poprzez bombardowanie cząsteczkami, najpierw ustaw system dostarczania cząstek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie trzykrotnie bombarduj komórki lub rośliny na płycie agropodłoża w trzech różnych pozycjach.

Trzymaj bombardowane komórki i rośliny w ciemności w komorze wzrostu roślin przez sześć do 72 godzin przed obserwacją sygnałów fluorescencyjnych. Ustaw komorę wzrostu roślin na 24-godzinną ciemność i 22 stopnie Celsjusza. Przenieś młode rośliny lub komórki zawiesinowe na konwencjonalne szkiełko podstawowe i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na górze w celu obrazowania za pomocą standardowej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Korzystając z ustawień wymienionych w protokole tekstowym, wzbudz białka oznaczone GFP na 485 nanometrach i wykryj fluorescencję na 525 nanometrach. W przypadku białek oznaczonych RFP wzbudzić w 585 nanometrach i wykryć w 608 nanometrach. Na koniec oblicz współczynnik kolokacji sygnałów fluorescencyjnych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Jednoczesna ekspresja Arabidopsy VSR-2 i Arabidopsy SCAMP4 w komórkach BY-2 tytoniu została osiągnięta poprzez bombardowanie cząstkami i wykazuje prawidłowe lokalizacje. RFP arabidopsis VSR-2 wykazuje punktowy wzór, który różnił się od lokalizacji arabidopsis SCAMP4-GFP w błonie plazmatycznej, z kilkoma cytozolowymi kropkami punktowymi. Co więcej, transgeniczne rośliny arabidopsy, które współwyrażają rzodkiewnik SCAMP4-GFP i RFP arabidopsis VSR-2, zostały wygenerowane w wyniku transformacji za pośrednictwem agrobakterii.

Pokazano subkomórkowe lokalizacje koekspresji dwóch chimerycznych białek w komórkach rzęsaków korzeniowych i korzeniowych. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, leczenie transgenicznej arabidopsi spowodowało znakowanie RFP arabidopsis VSR-2 przedziałów przedpróżniowych, tworząc małą strukturę przypominającą pierścień. Podczas gdy leczenie prefacyną A indukowało arabidopsę, SCAMP GFP znakował agregację sieci G transzłotu.

Jako kontrolę negatywną, w komórkach BY-2 tytoniu oraz komórkach korzenia arabidopsis i komórek rzęsaków arabidopsji obserwuje się niewielki sygnał autofluorescencyjny przy zastosowaniu tych samych ustawień zbierania obrazów. Ta metoda może zapewnić wgląd w subkomórkową lokalizację białek. Może być również stosowany do badania białka w kierunku.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii komórek roślinnych. Aby wygodnie eksportować lokalizacje subkomórkowe i oddziaływanie przestrzenne białek w żywej komórce roślinnej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak transformacja za pośrednictwem PET i krzyżowanie genetyczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jak współekspresja kilku białek fuzyjnych w roślinach.

Nie zapominaj, że praca z bombardowaniem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak osłony oczu.