Name: Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj efektywną metodę koekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach przy użyciu jednego wektora ekspresyjnego. Technika ta umożliwia badanie lokalizacji subkomórkowej i interakcji białek w żywych komórkach roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Wang za pomocne dyskusje i komentarze. Prace te są wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC, grant nr 31570001) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Guangdong i miasta Guangzhou (grant nr 2016A030313401 i 201707010024) dla H.W.

1. Strategia projektowania podkładów i amplifikacja DNA
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery do klonowania molekularnego fragmentów DNA. Startery składają się z sekwencji wiążących specyficznych dla genu 20 pz i sekwencji zwisu końca 5' od 20 do 25 pz, które są komplementarną nakładającą się sekwencją sąsiednich cząsteczek DNA (patrz na przykład tabela 1). 
	UWAGA: Późniejsze składanie każdego fragmentu DNA, połączenie różnych kaset ekspresji białek i integracja z końcowym wektorem ekspresji zależą od rozpoznania sąsiednich nakładających się sekwencji.</li>
	<li>Amplifikacja fragmentów DNA, w tym promotora, reportera fluorescencyjnego, genu docelowego i terminatora, które są niezbędne do budowy częściowo niezależnych kaset ekspresji białek za pomocą standardowych reakcji PCR z odpowiednimi starterami i polimerazą o wysokiej wierności. 
	UWAGA: Szablony użyte w tym badaniu do amplifikacji DNA pochodzą z poprzednich badań15,22,23. Temperatura wyżarzania i czas wydłużenia reakcji PCR są zależne od startera i genu.</li>
</ol>
2. Składanie fragmentów DNA i budowa kaset ekspresji białek
<ol>
	<li>Zbadać jakość produktów pierwszej rundy PCR za pomocą elektroforezy DNA i określić ilościowo za pomocą spektrofotometru. Sprawdź, czy doszło do degradacji i zanieczyszczenia DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym o stężeniu 1%. OD260/OD280 produktów PCR powinien wynosić od 1,6 do 1,8.</li>
	<li>Wymieszaj różne fragmenty DNA (0,05 - 0,1 pmol na każdy fragment) w nowej probówce PCR do końcowej objętości 5 μL. 
	UWAGA: Wymieszaj cząsteczki DNA przeznaczone dla tej samej kasety ekspresji białka w jednej probówce PCR. Unikaj mieszania ze sobą DNA z różnych kaset ekspresyjnych, ponieważ zmniejszy to wydajność składania DNA ze względu na rosnącą liczbę cząsteczek DNA, które muszą być połączone. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	<li>Przygotuj 5 ml bufora zapasowego ISO: 500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 1 mM deoksynukleotydu (dNTP); 50 mM ditiotreitolu; 25% glikolu polietylenowego (PEG) 8000; i 5 mM dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD).</li>
	<li>Przygotować 1 ml 2x mieszaniny głównej z 400 μl 5x bufor podstawowy ISO, 7,5 jednostki egzonukleazy T5, 62,5 jednostki polimerazy DNA o wysokiej wierności, 5,000 jednostek polimerazy Taq (patrz tabela materiałów) i sterylizowane podwójnie destylowane H2O. 
	UWAGA: Jest to adaptacja z poprzednich badań24,25,26; Wolumeny te należy zoptymalizować.</li>
	<li>Porcja 100 μl 2x mieszaniny wzorcowej w probówce i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	Uwaga: Częste zamrażanie i rozmrażanie 2x mieszanki głównej może powodować niską wydajność składania DNA.</li>
	<li>Dodać 15 μl 2x mieszaniny głównej do 5 μl mieszaniny DNA i inkubować w temperaturze 50 °C przez 60 minut.</li>
</ol>
3. Budowa wektora do koekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach
<ol>
	<li>Amplifikować całą częściowo niezależną kasetę ekspresji białek za pomocą drugiej rundy PCR, używając produktu (0,5 - 1,0 μl) z pierwszej rundy reakcji składania izotermicznego jako matrycy i najbardziej zewnętrznych starterów (np. 1-FP35S i 1-RNOS dla kasety ekspresji 1).
	<ol>
		<li>Użyć 1 jednostki polimerazy o wysokiej wierności w objętości reakcyjnej 50 μl, a następnie wykonać 30 cykli (94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s i 68 °C przez 2 min), a następnie końcowe przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 5 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Linearyzować końcowe wektory szkieletowe ekspresji białek pUC18 i pCAMBIA1300, które są przeznaczone odpowiednio do przejściowej ekspresji białek i transformacji genetycznej, dodając 4 jednostki Sma I do końcowej objętości reakcyjnej 10 μl i inkubując przez 1-2 godziny w temperaturze 25 °C. Dezaktywować enzym restrykcyjny przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Wymieszać równomolowe cząsteczki DNA kaset ekspresji białek i zlinearyzowanego wektora końcowego w końcową objętość reakcji 5 μl. Następnie przeprowadzić drugą rundę rekombinacji DNA, mieszając z 15 μl 2x bufor główny i inkubując w temperaturze 50 °C przez 60 minut.</li>
	<li>Użyj produktów końcowych reakcji rekombinacji izotermicznej drugiej rundy do przekształcenia kompetentnych komórek E. coli (np. DH5α) zgodnie ze standardowymi procedurami27. Dwukrotnie sprawdź dodatnie kolonie za pomocą PCR kolonii i sekwencjonowania DNA. Ekstrahować dodatnie plazmidy z E. coli za pomocą mini zestawu do ekstrakcji plazmidu i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	Uwaga: W przypadku długotrwałego przechowywania plazmidy rozpuszczone w buforze TE lub podwójnie destylowanymH2Osą bardziej stabilne niż trzymanie ich w szczepach E. coli.</li>
</ol>
4. Przejściowa koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach za pośrednictwem bombardowania biolistycznego
<ol>
	<li>Przygotuj komórki zawiesinowe tytoniu BY-2 i młode rośliny Arabidopsis do bombardowania.
	<ol>
		<li>Hodowla komórek BY-2 w pożywce Murashige i Skoog (MS) poprzez subhodowlę dwa razy w tygodniu w temperaturze 25 °C w wytrząsarce ustawionej na 130 obr./min. Filtr zbiera 30 ml 3-d hodowanych komórek BY-2 na kawałku 70-milimetrowej autoklawowanej bibuły filtracyjnej za pomocą pompy próżniowej, ustawiając podciśnienie na 40 mbar.</li>
		<li>Aby zapobiec wysychaniu komórek podczas kolejnych etapów, dodaj kilka kropli płynnej pożywki hodowlanej komórek BY-2 na szalce Petriego przed umieszczeniem bibuły filtracyjnej (następny krok).</li>
		<li>Przenieść bibułę filtracyjną z komórkami BY-2 na nową szalkę Petriego (85 mm x 15 mm).</li>
		<li>Nasiona Arabidopsis thaliana (Col-0) należy sterylizować powierzchniowo, wirując mieszaninę z 70% (v/v) etanolem zawierającym 0,05% Tween 20 przez 10 minut.</li>
		<li>Odwiruj nasiona za pomocą wirówki stołowej z maksymalną prędkością przez 2 sekundy, usuń supernatant i umyj nasiona 100% etanolem raz przez 30 sekund. Odpipetuj nasiona na nową sterylną bibułę filtracyjną w sterylnym kapturze. Następnie wysusz nasiona na powietrzu i rozprowadź je na płytkach agarowych o pojemności 1/2 MS.</li>
		<li>Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez 48 godzin przed przeniesieniem ich do komory wzrostu roślin z następującymi ustawieniami: 16 h światła / 8 h ciemności o intensywności 120 - 150 μm m-2 s-1, 22 °C.</li>
		<li>Przenieś 7-dniowe próbki roślin do okręgu o średnicy 30 mm w środku nowej płytki średniej 1/2 MS, aby zwiększyć skuteczność bombardowania. 
		Uwaga: Unikaj nakładania się roślin podczas przenoszenia i umieszczania ich na nowej płytce 1/2 MS.</li>
		<li>Dodaj kilka kropli 1/2 MS płynnego podłoża na powierzchnię roślin lub tkanek, aby zachować wilgoć i zapobiec wysuszeniu roślin podczas kolejnych kroków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokryj cząsteczki złota plazmidowym DNA.
	<ol>
		<li>Dokładnie przetaczaj roztwór mikronośnika ze złotem przez 3 minuty. Przygotuj nową probówkę o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Kolejno dodawać następujące roztwory do probówki i wirować: 25 μL (1,5 mg) cząsteczek złota, wir 10 s; 10 μL 25,46 mg/L spermidyny, wir 10 s; 5 μL 1 μg/μL plazmidowego DNA, wir 3 min; 25 μL roztworu 277,5 mg/L CaCl2, wir 1 min. 
		Uwaga: Na tym etapie kontynuuj wirowanie.</li>
		<li>Odwiruj mikronośniki złota za pomocą wirówki stołowej z maksymalną prędkością przez 5 s i ostrożnie odpipetuj supernatant bez naruszania osadu. Przemyć 200 μl absolutnego etanolu i ponownie zawiesić granulat wirowo na 5 - 10 s. Kręć z maksymalną prędkością przez 5 s i usuń etanol.</li>
		<li>Ponownie zawiesić cząstki złota w 18 μl absolutnego etanolu i podwielokrotnej zawiesinie 6 μl cząstek na środku trzech makronośników. Pozwól im wyschnąć na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś DNA do roślin poprzez bombardowanie cząstkami.
	<ol>
		<li>Ustaw system dostarczania cząstek w następujący sposób: 1100 psi, podciśnienie 28 mm Hg, odległość 1 cm przerwy i odległość lotu cząstek 9 cm.</li>
		<li>Bombarduj komórki/rośliny na płytce z podłożem agarowym trzy razy w trzech różnych pozycjach, a następnie utrzymuj komórki/rośliny w ciemności natychmiast po bombardowaniu. 
		Ostrzeżenie: Podczas obsługi systemu dostarczania cząstek należy nosić okulary ochronne ze względu na powiązanie z systemem gazu pod wysokim ciśnieniem i cząstek o dużej prędkości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzymaj bombardowane komórki/rośliny w ciemności w komorze wzrostu roślin przez 6 do 72 godzin przed obserwacją sygnałów fluorescencyjnych. Ustawić komorę wzrostu roślin na 24 godziny ciemności i 22 °C. 
	Ostrzeżenie: Skuteczność ekspresji i intensywność sygnału fluorescencyjnego są zależne od promotora, genu i rośliny/tkanki.</li>
</ol>
5. Generowanie stabilnego transgenicznego Arabidopsis z koekspresją wielu chimerycznych białek fluorescencyjnych przez transformację za pośrednictwem Agrobacterium.
<ol>
	<li>Rozmrozić kompetentne komórki Agrobacterium (PMP90) na lodzie i odczekać 30 minut, a następnie dodać 2 μl wektora binarnego (100 - 200 ng) (przygotowanego powyżej) do właściwych komórek. Pozostaw mieszaninę na lodzie na 10 minut.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę do wstępnie schłodzonej kuwety do elektroporacji o średnicy 0,1 cm. Włóż kuwetę do systemu elektroporacji i wykonaj elektroporację z następującymi ustawieniami: 1,6 kV, 600 omów, 25 μF.</li>
	<li>Dodać 1 ml płynnego podłoża SOC do kuwety natychmiast po elektroporacji, odpipetować komórki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze 28 °C w poziomej wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min przez 120 min.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze pokojowej 2,348 x g przez 5 minut, odrzucić większość supernatantu, delikatnie zawiesić ponownie granulowane komórki za pomocą końcówki pipety, rozprowadzić je na płytce LB zawierającej 50 mg/l higromycyny B i inkubować w temperaturze 28 °C przez 2-3 dni.</li>
	<li>Przekształć rośliny Arabidopsis thaliana Col-0 za pomocą Agrobacterium, który zawiera wektor binarny pCAMBIA1300 zintegrowany z wieloma kasetami ekspresji białek, metodą floral dip28, jak opisano wcześniej, w celu wygenerowania stabilnych roślin transgenicznych.</li>
	<li>Wysterylizuj powierzchnię transgenicznych nasion Arabidopsis, mieszając je z 70% (v/v) etanolem zawierającym 0,05% Tween 20. Wirować przez 10 minut. Odwiruj nasiona za pomocą wirówki stołowej z maksymalną prędkością przez 2 s, usuń supernatant i umyj nasiona 100% etanolem raz przez 30 sekund.</li>
	<li>Odpipetuj nasiona na sterylną bibułę filtracyjną w sterylnym kapturze. Następnie wysuszyć je na powietrzu i rozprowadzić na płytkach agarowych o pojemności 1/2 MS zawierających higromycynę B w celu badania przesiewowego dodatniego potomstwa.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 4 °C przez 2 dni. Następnie przenieś je do komory wzrostu roślin i kultury na 7 dni.</li>
	<li>Wybierz 7-dniowe młode rośliny, które przeżyły, sprawdzając sygnały fluorescencyjne pod mikroskopem fluorescencyjnym, a następnie przenieś rośliny do gleby w celu dalszego badania przesiewowego roślin homozygotycznych.</li>
</ol>
6. Zabiegi farmaceutyczne
<ol>
	<li>W przypadku leczenia farmakologicznego każdy lek należy rozcieńczyć w płynnym podłożu MS do odpowiednich stężeń roboczych przed inkubacją z komórkami lub roślinami.
	<ol>
		<li>Leczenie Wortmanninem: przygotować 1 mM roztwory podstawowe wortmanniny, rozpuszczając proszek wortmanniny w DMSO i przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C. Przenieść komórki roślinne lub młode rośliny do płynnej pożywki MS zawierającej 16,5 μM wortmamminy i inkubować przez 30 - 45 minut przed obrazowaniem.</li>
		<li>Leczenie preparatem Brefeldin A (BFA): przygotować 1 mM roztwory podstawowe BFA, rozpuszczając proszek BFA w DMSO i przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C. Przenieść komórki roślinne lub młode rośliny do płynnej pożywki MS zawierającej 10 μg/ml BFA przez 30 - 45 minut przed obrazowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Obrazowanie mikroskopem konfokalnym i analiza kolokalizacji subkomórkowej białek
<ol>
	<li>Przenieś młode rośliny lub komórki zawiesinowe na konwencjonalne szkiełko podstawowe i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na górze w celu obrazowania za pomocą standardowej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Użyj następujących ustawień: obiektyw wodny 63X (brak 1.4), tło 0, wzmocnienie 700, rozmiar piksela 0.168 mm i detektor fotopowielacza. Wzbudzaj białka znakowane GFP przy 485 nm i wykrywaj fluorescencję przy 525 nm. W przypadku białek oznaczonych RFP wzbudzić przy 514 nm i wykryć przy 575 nm.</li>
	<li>Oblicz współczynnik kolokalizacji sygnałów fluorescencyjnych za pomocą oprogramowania Image J (https://imagej.nih.gov/ij/) z wtyczką kolokalizacyjną korelacji Pearsona-Spearmana (PSC), jak opisano wcześniej8. Współczynniki korelacji Pearsona lub współczynniki korelacji rang Spearmana są pokazane w wynikach (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Wygenerowane wartości r będą wynosić od -1 do 1. 0 pokazuje brak wykrywalnej korelacji dwóch sygnałów, podczas gdy +1 i -1 pokazują pełną dodatnią i ujemną korelację, odpowiednio, dwóch sygnałów.</li>
</ol>

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Tsien, R. Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+machinery+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Seeing the machinery of live cells.</a> Science. 280 (5371), 1954-1955 (1998).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Plant+Cells+in+a+Brand+New+Way%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Visualizing Plant Cells in a Brand New Way.</a> Mol Plant. 9 (5), 633-635 (2016).</li>
<li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (6), 444-456 (2001).</li>
<li>Tse, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multivesicular+bodies+as+prevacuolar+compartments+in+Nicotiana+tabacum+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of multivesicular bodies as prevacuolar compartments in Nicotiana tabacum BY-2 cells.</a> Plant Cell. 16 (3), 672-693 (2004).</li>
<li>Wang, H., Zhuang, X., Cai, Y., Cheung, A. Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+F-actin-regulated+exocytic+targeting+of+NtPPME1+is+essential+for+construction+and+rigidity+of+the+pollen+tube+cell+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Apical F-actin-regulated exocytic targeting of NtPPME1 is essential for construction and rigidity of the pollen tube cell wall.</a> Plant J. 76 (3), 367-379 (2013).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Distinct+Pathway+for+Polar+Exocytosis+in+Plant+Cell+Wall+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A Distinct Pathway for Polar Exocytosis in Plant Cell Wall Formation.</a> Plant Physiol. 172 (2), 1003-1018 (2016).</li>
<li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Expression+Systems+in+Plants%3A+Potentialities+and+Constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Transient Expression Systems in Plants: Potentialities and Constraints.</a> Adv Exp Med Biol. 896, 287-301 (2016).</li>
<li>Ishida, Y., Hiei, Y., Komari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of maize.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1614-1621 (2007).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Front Plant Sci. 8, 246(2017).</li>
<li>Manavella, P. A., Chan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+sunflower+leaf+discs+via+an+Agrobacterium-mediated+method%3A+applications+for+gene+expression+and+silencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of sunflower leaf discs via an Agrobacterium-mediated method: applications for gene expression and silencing studies.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1699-1707 (2009).</li>
<li>Martin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+in+Nicotiana+benthamiana+fluorescent+marker+lines+provides+enhanced+definition+of+protein+localization%2C+movement+and+interactions+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient expression in Nicotiana benthamiana fluorescent marker lines provides enhanced definition of protein localization, movement and interactions in planta.</a> Plant J. 59 (1), 150-162 (2009).</li>
<li>Miao, Y., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+protoplasts+of+suspension+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transient expression of fluorescent fusion proteins in protoplasts of suspension cultured cells.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2348-2353 (2007).</li>
<li>Wang, H., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+and+analysis+of+fluorescent+reporter+proteins+in+plant+pollen+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transient expression and analysis of fluorescent reporter proteins in plant pollen tubes.</a> Nat Protoc. 6 (4), 419-426 (2011).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Candat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+determination+of+organelle+targeting-peptide+cleavage+sites+using+transient+expression+of+green+fluorescent+protein+translational+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Experimental determination of organelle targeting-peptide cleavage sites using transient expression of green fluorescent protein translational fusions.</a> Anal Biochem. 434 (1), 44-51 (2013).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Binder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+plasmid+assembly+kit+for+multigene+expression%2C+gene+silencing+and+silencing+rescue+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular plasmid assembly kit for multigene expression, gene silencing and silencing rescue in plants.</a> PLoS One. 9 (2), e88218(2014).</li>
<li>Engler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+golden+gate+modular+cloning+toolbox+for+plants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">A golden gate modular cloning toolbox for plants.</a> ACS Synth Biol. 3 (11), 839-843 (2014).</li>
<li>Forner, J., Binder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+red+fluorescent+protein+eqFP611%3A+Application+in+subcellular+localization+studies+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The red fluorescent protein eqFP611: Application in subcellular localization studies in higher plants.</a> BMC Plant Biol. 7, 28(2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+sorting+receptors+%28VSRs%29+and+secretory+carrier+membrane+proteins+%28SCAMPs%29+are+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Vacuolar sorting receptors (VSRs) and secretory carrier membrane proteins (SCAMPs) are essential for pollen tube growth.</a> Plant J. 61 (5), 826-838 (2010).</li>
<li>Wang, H., Zhuang, X. H., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+sorting+receptor+%28VSR%29+proteins+reach+the+plasma+membrane+in+germinating+pollen+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Vacuolar sorting receptor (VSR) proteins reach the plasma membrane in germinating pollen tubes.</a> Mol Plant. 4 (5), 845-853 (2011).</li>
<li>Chen, W. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vitro+splicing+of+coding+sequences+from+genomic+DNA+by+isothermal+recombination+reaction-based+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Biotechnological+Equipment%22%5BJournal%5D)">Rapid in vitro splicing of coding sequences from genomic DNA by isothermal recombination reaction-based PCR.</a> Biotechnology & Biotechnological Equipment. 30 (5), 864-868 (2016).</li>
<li>Zhu, Q. L., Yang, Z. F., Zhang, Q. Y., Chen, L. T., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+multi-type+plasmid+modifications+based+on+isothermal+in+vitro+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Robust multi-type plasmid modifications based on isothermal in vitro recombination.</a> Gene. 548 (1), 39-42 (2014).</li>
<li>Torella, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+construction+of+insulated+genetic+circuits+via+synthetic+sequence-guided+isothermal+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid construction of insulated genetic circuits via synthetic sequence-guided isothermal assembly.</a> Nucleic Acids Res. 42 (1), 681-689 (2014).</li>
<li>Siguret, V., Ribba, A. S., Cherel, G., Meyer, D., Pietu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+plasmid+size+on+transformation+efficiency+by+electroporation+of+Escherichia+coli+DH5+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of plasmid size on transformation efficiency by electroporation of Escherichia coli DH5 alpha.</a> Biotechniques. 16 (3), 422-426 (1994).</li>
<li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).</li>
<li>Lam, S. K., Cai, Y., Hillmer, S., Robinson, D. G., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCAMPs+highlight+the+developing+cell+plate+during+cytokinesis+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SCAMPs highlight the developing cell plate during cytokinesis in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Physiol. 147 (4), 1637-1645 (2008).</li>
<li>Lam, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+SCAMP1+defines+clathrin-coated%2C+trans-golgi-located+tubular-vesicular+structures+as+an+early+endosome+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Rice SCAMP1 defines clathrin-coated, trans-golgi-located tubular-vesicular structures as an early endosome in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Cell. 19 (1), 296-319 (2007).</li>
<li>Jiang, L., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+protein+sorting+to+vacuoles+in+plant+cells%3A+evidence+for+two+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integral membrane protein sorting to vacuoles in plant cells: evidence for two pathways.</a> J Cell Biol. 143 (5), 1183-1199 (1998).</li>
<li>Fernandez-Abalos, J. M., Fox, H., Pitt, C., Wells, B., Doonan, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-adapted+green+fluorescent+protein+is+a+versatile+vital+reporter+for+gene+expression%2C+protein+localization+and+mitosis+in+the+filamentous+fungus%2C+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant-adapted green fluorescent protein is a versatile vital reporter for gene expression, protein localization and mitosis in the filamentous fungus, Aspergillus nidulans.</a> Mol Microbiol. 27 (1), 121-130 (1998).</li>
<li>Bruening, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+gene+silencing+regularized%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plant gene silencing regularized.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13349-13351 (1998).</li>
<li>Wassenegger, M., Pelissier, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+RNA-mediated+gene+silencing+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants.</a> Plant Mol Biol. 37 (2), 349-362 (1998).</li>
<li>Dehio, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+plant+genetic+loci+involved+in+a+posttranscriptional+mechanism+for+meiotically+reversible+transgene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of plant genetic loci involved in a posttranscriptional mechanism for meiotically reversible transgene silencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (12), 5538-5542 (1994).</li>
<li>Zhong, G., Zhu, Q., Li, Y., Liu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Once+for+all%3A+A+novel+robust+system+for+co-expression+of+multiple+chimeric+fluorescent+fusion+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Once for all: A novel robust system for co-expression of multiple chimeric fluorescent fusion proteins in plants.</a> Front Plant Sci. 8, 1071(2017).</li>
<li>Li, X. T., Xie, Y. Y., Zhu, Q. L., Liu, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+genes+and+cis-regulatory+regions+improves+qualitative+and+quantitative+traits+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in genes and cis-regulatory regions improves qualitative and quantitative traits in crops.</a> Molecular Plant. 10 (11), 1368-1370 (2017).</li>
<li>Zhu, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+%26%2334%3Bpurple+endosperm+rice%27%27+by+engineering+anthocyanin+biosynthesis+in+the+endosperm+with+a+high-efficiency+transgene+stacking+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Development of &#34;purple endosperm rice'' by engineering anthocyanin biosynthesis in the endosperm with a high-efficiency transgene stacking system.</a> Molecular Plant. 10 (7), 918-929 (2017).</li>
<li>Tang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+formation%2C+evolution%2C+and+functionalization+of+new+cytoplasmic+male+sterility+genes+in+the+plant+mitochondrial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-step formation, evolution, and functionalization of new cytoplasmic male sterility genes in the plant mitochondrial genomes.</a> Cell Research. 27 (1), 130-146 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu zademonstrowaliśmy nowatorską metodę silnej koekspresji chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach. Może być stosowany zarówno do przejściowej ekspresji, jak i transformacji genetycznej i jest kompatybilny z obecnymi aplikacjami i technologiami bioobrazowania, molekularnymi i biochemicznymi opartymi na białkach fluorescencyjnych 9,10,13. Ponadto pokonuje trudności związane z konwencjonalnymi metod...

Chimeryczne fluorescencyjne białka fuzyjne zostały uznane za użyteczne narzędzia do badania dynamiki wewnątrzkomórkowej i lokalizacji subkomórkowej oraz dalszego zrozumienia ich funkcji fizjologicznych i mechanizmów działania1,2,3,4. Szczególnie korzystne jest współekspresja dobrze znanych białek reporterowych organelli z białkiem, o którym mowa, aby lepiej zilustrować jego czasoprzestrzenne uzasadnienie, rozmieszczenie i funkcję (funkcje) w systemie endomembranowym w komórkach4,5,6,7,8.
Chimeryczne fluorescencyjne białko fuzyjne może być wyrażane w roślinach poprzez przejściową ekspresję i stabilną transformację genetyczną, które mają swoje zalety i ograniczenia9,10,11. Przejściowa ekspresja białka jest wygodnym podejściem, które obejmuje przejściową ekspresję DNA za pośrednictwem bombardowania biolistycznego, glikolu polietylenowego (PEG) lub elektroporacji w protoplastach oraz infiltrację liści za pośrednictwem Agrobacterium w nienaruszonych komórkach roślinnych, jak pokazano w Rysunek 1A,B12,13,14,15,16. Jednak koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w jednej komórce roślinnej wymaga mieszaniny kilku niezależnych plazmidów ekspresyjnych. Tak więc, wadami stosowania wielu plazmidów do koekspresji białek w roślinach są niższe poziomy koekspresji ze względu na znacznie zmniejszone prawdopodobieństwo jednoczesnego wejścia kilku plazmidów do tych samych komórek w porównaniu z pojedynczym plazmidem oraz różnice w poziomach ekspresji białek spowodowane niekontrolowanie losową ilością każdego typu plazmidu przenoszonego do komórki17, 18. Ponadto technicznie trudne jest wprowadzenie kilku plazmidów o niezależnej ekspresji do jednego Agrobacterium dla koekspresji białka9,10,11. W związku z tym, przejściowa ekspresja białka za pośrednictwem Agrobacterium przez infiltrację liści tytoniu jest zdolna do ekspresji tylko jednego plazmidu na raz, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1B. W przeciwieństwie do tego, wytwarzanie roślin transgenicznych wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych jest zwykle osiągane przez Agrobacterium, które przenosi binarny wektor transformacji. Jednak wektor binarny, który pośredniczy w transferze genów i insercji do genomów roślin, jest zdolny do ekspresji tylko pojedynczego fluorescencyjnego białka fuzyjnego (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1B) 9,10,12. Wygenerowanie transgenicznej rośliny, która jednocześnie eksprymuje kilka chimerycznych białek fluorescencyjnych, wymaga wielu rund krzyżowania genetycznego i badań przesiewowych, które mogą trwać od miesięcy do lat, w zależności od liczby genów, które mają ulec koekspresji.
Zastosowanie pojedynczego wektora ekspresji do koekspresji wielu białek w roślinie zostało zgłoszone w kilku poprzednich badaniach19,20,21. Jednak wiele rund trawienia enzymatycznego i ligacji DNA cząsteczek DNA i wektorów szkieletowych jest zwykle wymaganych do wytworzenia końcowego plazmidu do koekspresji lub nadekspresji białka. W tym miejscu opracowaliśmy nową i solidną metodę koekspresji wielu chimerycznych białek fluorescencyjnych w roślinach. Jest to bardzo wydajna i wygodna metoda, która osiąga wielokrotną koekspresję białek w roślinach zarówno dla przejściowej ekspresji, jak i stabilnej transformacji w uświęcony tradycją sposób. Wykorzystuje pojedynczy wektor, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset ekspresji białek do koekspresji białek, pokonując w ten sposób wady konwencjonalnych metod. Co więcej, jest to bardzo wszechstronny system, w którym manipulacje i składanie DNA odbywa się za pomocą prostej, jednoetapowej, zoptymalizowanej reakcji bez dodatkowych etapów trawienia i ligacji DNA. Zasada działania jest zilustrowana na Rysunek 2. Co więcej, jest w pełni kompatybilny z obecnymi podejściami komórkowymi, molekularnymi i biochemicznymi, które opierają się na chimerycznych fluorescencyjnych białkach fuzyjnych.

<table><tbody><tr><td>Polimeraza KOD-FX</td><td>TOYOBO</td><td>KFX-101</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>NEB</td><td>R0141L/S/V</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>BBI</td><td>A600194-0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>BBI</td><td>A601336-0500</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>NEB</td><td>#N0447V</td><td></td></tr><tr><td>C4H10O2S2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>BBI</td><td>A100159-0500</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>BBI</td><td>A600641-0001</td><td></td></tr><tr><td>Epicentrum egzonukleazy T5</td><td></td><td>T5E4111K</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq</td><td>NEB</td><td>B9022S</td><td></td></tr><tr><td>Murashige i Skoog Mieszanina soli bazalnej (MS)</td> <td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>BBI</td><td>A500737-0500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BBI</td><td>A600560-0500</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BBI</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>BBI</td><td>A614270-0001</td><td></td></tr><tr><td>Złote cząstki mikronośnika</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2263</td><td>1,0 i mikro; m</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>BBI</td><td>CD0050-500</td><td></td></tr><tr><td>Makronośniki</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>Płytka bezpieczeństwa</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2329</td><td></td></tr><tr><td>Ekran zatrzymujący</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2336</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BBI</td><td>A610476-0001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BBI</td><td>A610440-0500</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>BBI</td><td>A600219-0001</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycyna B</td><td>Genview</td><td>AH169-1G</td><td></td></tr><tr><td>Wortmannin</td><td>Sigma</td><td>F9128</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>SML0975-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>BBI</td><td>A600163-0500</td><td></td></tr><tr><td>T100 Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Komora wzrostowa</td> System dostarczania cząstek <td>Panasonic</td><td>MLR-352H-PC</td><td></td></tr><tr><td>PSD-1000/He</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta</td><td>Bio-Rad</td><td>1652083</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5427000097</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 7 DUO (780& 7Live)</td></tr> <tr><td>NanoDrop 2000/2000c Spektrofotometry</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>EPS-300 Zasilacz</td><td>Tanon</td><td>EPS 300</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Mshot</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>Agroza</td><td>BBI</td><td>A600234</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>BBI</td><td>A100339</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>BBI</td><td>B300599</td><td></td></tr></tbody></table>

efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Co-expression of Multiple Chimeric Fluorescent Fusion Proteins in an Efficient Way in Plants

Informacje o czasoprzestrzennych lokalizacjach subkomórkowych białka są kluczowe dla zrozumienia jego fizjologicznych funkcji w komórkach. Białka fluorescencyjne i wytwarzanie fluorescencyjnych białek fuzyjnych są szeroko stosowane jako skuteczne narzędzie do bezpośredniej wizualizacji lokalizacji i dynamiki białek w komórkach. Szczególnie przydatne jest porównanie ich z dobrze znanymi markerami organelli po koekspresji z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Niemniej jednak klasyczne podejścia do koekspresji białek w roślinach zwykle obejmują wiele niezależnych plazmidów ekspresyjnych, a zatem mają wady, które obejmują niską wydajność koekspresji, zmienność na poziomie ekspresji i wysoki wydatek czasu na krzyżowanie genetyczne i badania przesiewowe. W tym badaniu opisujemy solidną i nowatorską metodę koekspresji wielu chimerycznych białek fluorescencyjnych w roślinach. Pokonuje ograniczenia konwencjonalnych metod dzięki zastosowaniu pojedynczego wektora wyrażenia, który składa się z wielu częściowo niezależnych kaset ekspresyjnych. Każda kaseta ekspresji białek zawiera własne funkcjonalne elementy ekspresji białek, dzięki czemu można ją elastycznie dostosowywać do różnych potrzeb związanych z ekspresją. Ponadto łatwo i wygodnie jest przeprowadzić montaż i manipulację fragmentami DNA w plazmidzie ekspresyjnym przy użyciu zoptymalizowanej jednoetapowej reakcji bez dodatkowych etapów trawienia i ligacji. Co więcej, jest w pełni kompatybilny z obecnymi technologiami i aplikacjami bioobrazowania pochodzącymi z białek fluorescencyjnych, takimi jak FRET i BiFC. W ramach walidacji metody zastosowaliśmy ten nowy system do koekspresji fluorescencyjnie połączonych receptorów sortowania wakuolarnego i wydzielniczych białek błony nośnikowej. Wyniki pokazują, że ich perspektywiczne lokalizacje subkomórkowe są takie same jak w poprzednich badaniach, zarówno pod względem przejściowej ekspresji, jak i transformacji genetycznej w roślinach.

Opracowaliśmy niezawodną i wysoce wydajną metodę koekspresji wielu chimerycznych białek fuzyjnych z białkami fluorescencyjnymi w roślinach. Metoda ta przełamuje ograniczenia konwencjonalnych podejść wykorzystujących wiele oddzielnych plazmidów do koekspresji białek, co pokazano w Rysunek 1A,B, poprzez zarówno ekspresję przejściową, jak i stabilną transformację genetyczną. W tej nowej metodzie tworzymy pojedynczy wektor ekspresyjny sk...

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Information about the spatiotemporal subcellular localization(s) of a protein is critical to understand its physiological functions in cells. Fluorescent ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii molekularnej roślin i komórki, takie jak: w jaki sposób możemy tworzyć białka w komórce. Główną zaletą tej techniki jest wysoka efektywność koekspresji komórkowych białek fuzyjnych w jednym wektorze ekspresyjnym. Procedurę zademonstruje Guitao Zhong, doktorant z naszego laboratorium.Na początek zaprojektuj startery do klonowania molekularnego fragmentów DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Amplifikacja fragmentów DNA, które są niezbędne do budowy częściowo niezależnych kaset ekspresji białek za pomocą standardowych reakcji PCR z odpowiadającymi im starterami i polimerazą o wysokiej wierności. Należą do nich promotor, reporter fluorescencyjny, gen docelowy i terminator.Zbadaj jakość produktów pierwszej rundy PCR, szukając degradacji i zanieczyszczenia DNA za pomocą elektroforezy DNA przy użyciu 1% żelu agarozowego. Określić ilościowo produkty PCR za pomocą spektrofotometru. Stosunek odczytów produktów PCR w 260 i 280 nanometrach powinien wynosić od 1,6 do 1,8.Wymieszaj fragmenty DNA przeznaczone dla tej samej kasety ekspresji białka w jednej probówce PCR do końcowej objętości pięciu mikrolitrów. Informacje o mieszaniu danych DNS z różnych danych kasety wyrażeń. Ponieważ równa zmniejsza wydajność składania DNA, ze względu na rosnącą liczbę cząsteczek DNA, które muszą być połączone.Teraz dodaj 15 mikrolitrów 2x głównej mieszaniny do 5 mikrolitrowej mieszaniny DNA i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 60 minut. Amplifikować całą częściowo niezależną kasetę ekspresji białek za pomocą drugiej rundy PCR. Użyć od 0,5 do jednego mikrolitra produktu z pierwszej rundy reakcji montażu izotermicznego jako szablon w najbardziej zewnętrznych starterach.Użyj jednej jednostki polimerazy o wysokiej wierności w objętości reakcyjnej 50 mikrolitrów przez 30 cykli, a następnie końcowego przedłużenia w temperaturze 68 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie zlinearyzuj końcowy wektor szkieletu ekspresji białka POC 18 i wektor CAMBIA 1300, dodając cztery jednostki małej do końcowej objętości reakcyjnej 10 mikrolitrów. Wektory te są przeznaczone do przejściowej ekspresji białek i transformacji genetycznej.Inkubować trawienie restrykcyjne przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po trawieniu dezaktywuj enzym restrykcyjny, inkubując w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie wymieszaj równomolowe cząsteczki DNA kaset ekspresji białek i zlinearyzowanego wektora końcowego w końcową objętość reakcji wynoszącą pięć mikrolitrów.Na koniec wykonaj drugą rundę rekombinacji DNA, mieszając reakcję z 15 mikrolitrami 2x buforu głównego i inkubując w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 60 minut. Aby przygotować komórki zawiesinowe tytoniu BY-2 do bombardowania, należy zebrać 30 mililitrów 3-dniowych komórek BY-2 z 3-dniowej hodowli na kawałku 70-mililitrowej autoklawowanej bibuły filtracyjnej za pomocą pompy próżniowej, ustawiając ciśnienie podciśnienia na 40 milibarów. W międzyczasie dodaj kilka kropli płynnej pożywki hodowlanej BY-2 do szalki Petriego.Przenieś bibułę filtracyjną z komórkami BY-2 na szalkę Petriego. Aby przygotować młode rośliny rzodkiewnika do bombardowania, należy przygotować siedmiodniowe próbki roślin, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie przenieś je do prostokąta pośrodku nowej płytki średniej MS o połowie mocy, aby zwiększyć skuteczność bombardowania.Uważaj, aby nie nakładać się na rośliny podczas przenoszenia i umieszczania ich na talerzu. Dodaj kilka kropli płynnego podłoża MS o połowie mocy na powierzchnię roślin lub tkanek, aby zachować wilgoć i zapobiec wysuszeniu roślin podczas pozostałych etapów. Aby pokryć cząsteczki złota plazmidowym DNA, najpierw dokładnie wiruj roztwór mikronośnika złota przez trzy minuty.Teraz dodaj 25 mikrolitrów cząsteczek złota do nowej 1,5-mililitrowej probówki i wiruj przez 10 sekund. Dodaj 10 mikrolitrów 25,46 miligrama na litr spermidyny i wiruj przez 10 sekund. Następnie dodaj pięć mikrolitrów jednego mikrograma na mikrolitr plazmidowego DNA i wiruj przez trzy minuty.Na koniec dodaj 25 mikrolitrów 277,5 miligramów na litr roztworu chlorku wapnia i wiruj przez jedną minutę. Obracaj złote mikronośniki za pomocą wirówki stołowej z maksymalną prędkością przez pięć sekund. Po odwirowaniu ostrożnie wyciśnij sklarat z supernatentu, nie naruszając osadu.Następnie umyj granulat 200 mikrolitrami absolutnego etanolu i ponownie zawiesij granulkę, wirując przez pięć do 10 sekund. Po wzmocnieniu wiruj złote mikronośniki z maksymalną prędkością przez pięć sekund i usuń etanol. Ponownie zawiesić cząsteczki złota w 18 mikrolitrach absolutnego etanolu.Następnie podnieś sześć mikrolitrów zawiesiny cząstek na środek trzech mikronośników i pozwól im wyschnąć na powietrzu. Aby przenieść DNA do komórek i roślin poprzez bombardowanie cząsteczkami, najpierw ustaw system dostarczania cząstek zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie trzykrotnie bombarduj komórki lub rośliny na płycie agropodłoża w trzech różnych pozycjach.Trzymaj bombardowane komórki i rośliny w ciemności w komorze wzrostu roślin przez sześć do 72 godzin przed obserwacją sygnałów fluorescencyjnych. Ustaw komorę wzrostu roślin na 24-godzinną ciemność i 22 stopnie Celsjusza. Przenieś młode rośliny lub komórki zawiesinowe na konwencjonalne szkiełko podstawowe i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na górze w celu obrazowania za pomocą standardowej konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.Korzystając z ustawień wymienionych w protokole tekstowym, wzbudz białka oznaczone GFP na 485 nanometrach i wykryj fluorescencję na 525 nanometrach. W przypadku białek oznaczonych RFP wzbudzić w 585 nanometrach i wykryć w 608 nanometrach. Na koniec oblicz współczynnik kolokacji sygnałów fluorescencyjnych zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Jednoczesna ekspresja Arabidopsy VSR-2 i Arabidopsy SCAMP4 w komórkach BY-2 tytoniu została osiągnięta poprzez bombardowanie cząstkami i wykazuje prawidłowe lokalizacje. RFP arabidopsis VSR-2 wykazuje punktowy wzór, który różnił się od lokalizacji arabidopsis SCAMP4-GFP w błonie plazmatycznej, z kilkoma cytozolowymi kropkami punktowymi. Co więcej, transgeniczne rośliny arabidopsy, które współwyrażają rzodkiewnik SCAMP4-GFP i RFP arabidopsis VSR-2, zostały wygenerowane w wyniku transformacji za pośrednictwem agrobakterii.Pokazano subkomórkowe lokalizacje koekspresji dwóch chimerycznych białek w komórkach rzęsaków korzeniowych i korzeniowych. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami, leczenie transgenicznej arabidopsi spowodowało znakowanie RFP arabidopsis VSR-2 przedziałów przedpróżniowych, tworząc małą strukturę przypominającą pierścień. Podczas gdy leczenie prefacyną A indukowało arabidopsę, SCAMP GFP znakował agregację sieci G transzłotu.Jako kontrolę negatywną, w komórkach BY-2 tytoniu oraz komórkach korzenia arabidopsis i komórek rzęsaków arabidopsji obserwuje się niewielki sygnał autofluorescencyjny przy zastosowaniu tych samych ustawień zbierania obrazów. Ta metoda może zapewnić wgląd w subkomórkową lokalizację białek. Może być również stosowany do badania białka w kierunku.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii komórek roślinnych. Aby wygodnie eksportować lokalizacje subkomórkowe i oddziaływanie przestrzenne białek w żywej komórce roślinnej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak transformacja za pośrednictwem PET i krzyżowanie genetyczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jak współekspresja kilku białek fuzyjnych w roślinach.Nie zapominaj, że praca z bombardowaniem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak osłony oczu.

co-expression-multiple-chimeric-fluorescent-fusion-proteins-an

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Ta praca opisuje nowatorską metodę selektywnego celowania w organelle subkomórkowe u roślin, testowaną za pomocą BioRad Gene Gun.

Przejściowa ekspresja genów w tytoniu przy użyciu zespołu Gibsona i pistoletu genowego

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Nielityczne systemy ekspresji komórek owadów są niedostatecznie wykorzystywane do produkcji, transportu/lokalizacji komórkowej i analizy funkcjonalnej białek rekombinowanych. W tym miejscu opisujemy metody generowania wektorów ekspresyjnych i późniejszej przejściowej ekspresji białek w dostępnych na rynku liniach komórkowych lepidoptera. Przedstawiono również kolokalizację akwaporyn Bemisia tabaci z subkomórkowymi białkami markerowymi fluorescencyjnymi.

Przejściowa ekspresja i lokalizacja komórkowa rekombinowanych białek w hodowanych komórkach owadów

Oparte na białkach fluorescencyjnych podejścia do monitorowania efektorów wydzielanych przez bakterie do komórek gospodarza są wyzwaniem. Wynika to z niezgodności między białkami fluorescencyjnymi a układem wydzielania typu III. W tym przypadku zoptymalizowany system GFP z dzielonym superfolderem służy do wizualizacji efektorów wydzielanych przez bakterie do komórki rośliny gospodarza.

Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji

Opisujemy tutaj prostą metodę ekspresji, ekstrakcji i oczyszczania rekombinowanej ludzkiej IgG połączonej z GFP u Nicotiana benthamiana. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie i wizualizację wielu białek, które wykorzystują chromatografię kolumnową. Co więcej, protokół można dostosować do osobistego i wirtualnego laboratorium dydaktycznego w college'u, zapewniając eksplorację opartą na projektach.

Wytwarzanie białek fuzyjnych IgG ulegających przejściowej ekspresji w Nicotiana benthamiana

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) to technika obrazowania służąca do wykrywania interakcji białek w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiono protokół FRET w celu zbadania związku enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi, które rekrutują je do docelowych promotorów w celu epigenetycznej regulacji ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

Poznaj efektywną metodę koekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach przy użyciu jednego wektora ekspresyjnego. Technika ta umożliwia badanie lokalizacji subkomórkowej i interakcji białek w żywych komórkach roślinnych.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Przeglądaj więcej filmów