Barwienie H&E skrawków tkanek zatopionych w parafinie: technika barwienia różnicowego do wizualizacji skrawków tkanki wątroby przy użyciu kombinacji barwników hematoksyliny i eozyny

Rozpocznij barwienie hematoksyliną i eozyną, biorąc szklane szkiełko zawierające wycinek tkanki zatopionej w parafinie. Zanurz szkiełko w roztworze deparafinowającym zawierającym ksylen - rozpuszczalnik organiczny, który rozpuszcza warstwę parafiny wokół tkanki, udostępniając ją plamom w kolejnych etapach.

Potraktuj wycinek tkanki alkoholem absolutnym, aby usunąć ksylen. Zanurz tkankę w zmniejszających się stężeniach alkoholu. Ten etap nawadnia tkankę, zastępując alkohol wodą w celu uzyskania lepszej kompatybilności z barwnikami rozpuszczalnymi w wodzie.

Zabarwić tkankę zasadową hematoksyliną, która w postaci utlenionej wiąże się z zaprawą - kationem metalu. Kompleks ten wiąże się elektrostatycznie z kwasami nukleinowymi w genomie, barwiąc jądro na fioletowo.

Zanurz wybarwiony fragment w kwaśnym roztworze różnicującym, aby usunąć nadmiar hematoksyliny z cytoplazmy, sprawiając, że jądro zatrzymujące barwnik wydaje się wyraźne. Potraktuj tkankę alkalicznym środkiem niebieszczącym, aby zneutralizować wolne kwasy. Powoduje to regresję koloru fioletowego barwnika do niebieskiego, uwydatniając szczegóły jądrowe.

Zanurz szkiełko w kwaśnym roztworze eozyny, aby wybarwić podstawowe składniki białkowe w cytoplazmie i włóknach tkanki łącznej w odcieniach od czerwonego do różowego. Potraktuj tkankę alkoholem, aby wyeliminować nadmiar eozyny. Stosuj rosnące stężenia etanolu, aby odwodnić tkankę. Zanurz szkiełko w ksylenie, aby usunąć wszelkie pozostałe odczynniki.

Po obrazowaniu komórki w sekcji tkankowej wykazują wyraźne niebieskie jądra i różowe obszary cytoplazmatyczne.

Odparafinować szkiełka, zanurzając je w 100% ksylenie, dwukrotnie, za każdym razem na 15 minut. Następnie ponownie nawodnij szkiełka przez gradient etanolu. Dla każdego roztworu zanurz od 8 do 10 razy, przez dwie sekundy na zanurzenie, aż płyn będzie czysto spływał z szkiełek. Umieść szkiełka w 100% przefiltrowanej hematoksylinie Harrisa na cztery minuty.

Po czterech minutach szybko przenieś je z powrotem do pojemnika z wodą dejonizowaną. Wlej wodę dejonizowaną do tylnego rogu pojemnika najbardziej oddalonego od sekcji. Okresowo opróżniaj pojemnik, aż woda przestanie być fioletowa.

Szybko sprawdź intensywność hematoksyliny pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą lamp na gęsiej szyi. Przywróć szkiełka do 100% hematoksyliny na jedną minutę, jeśli wymagane jest dalsze barwienie.

Po uzyskaniu pożądanego barwienia hematoksyliną zanurz szkiełka dwukrotnie w 0,05% kwasie solnym, a następnie natychmiast przenieś je z powrotem do pojemnika z czystą wodą dejonizowaną. Opróżnij pojemnik i dwukrotnie napełnij go wodą.

Przenieś szkiełka do dwóch pojemników zawierających 95% etanol na 30 sekund każdy. Umieścić szkiełka w roztworze flooksyny Y eozyny Y B na dwie minuty.

Po dwóch minutach przenieś szkiełka z powrotem do poprzedniego pojemnika na 95% etanolu, a następnie sprawdź intensywność koloru pod mikroskopem preparacyjnym. Jeśli barwienie nie jest wystarczające, wróć do roztworu eozyny na 30 sekund. Powtórz w razie potrzeby.

Po uzyskaniu barwienia o pożądanej intensywności przenieś szkiełka do 100% izopropanolu na 15 sekund. Zastąp świeżym 100% izopropanolem i umieść szkiełka z powrotem w izopropanolu na kolejne 15 sekund. Powtórz ten proces, w sumie sześć płukań izopropanolem.

Po zanurzeniu w 100% ksylenie na trzy minuty wyjmij jedno szkiełko, dodaj wystarczającą ilość materiału montażowego, aby pokryć sekcje, a następnie zanurz szkiełko w 100% ksylenie.

Nałóż szkiełko nakrywkowe na szkiełko podstawowe i zetrzyj nadmiar podłoża mocującego na ręczniku papierowym, aż będzie widoczna tylko cienka linia. Następnie zanurz chusteczkę w ksylenie i wytrzyj tylną część szkiełka, aby usunąć wszelkie medium, które kapało.

Umieść szkiełko płasko na stabilnej, ale ruchomej powierzchni, takiej jak kawałek kartonu, i pozwól ksylenowi odparować w okapie przez 10 minut. Pozostaw szkiełka w temperaturze pokojowej na noc, aby medium montażowe stwardniało przed obrazowaniem.