JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Techniki biologiczne
0 wyświetleń • 5:03 min. • July 8th, 2025
Fluorescencyjne barwienie białek w żelach poliakrylamidowych srebrem wykorzystuje sondy fluorogenne do wykrywania i ilościowego oznaczania białek.
Zacznij od żelu poliakrylamidowego z białkami, podzielonymi na pasma za pomocą elektroforezy. Namocz w utrwalającej mieszaninie etanolu i kwasu octowego, która zapobiega dyfuzji prążków poprzez denaturację białek.
Umyj żel, aby usunąć resztki kwasu octowego i etanolu. Zanurz żel w plamie z azotanu srebra. Jony srebra silnie wiążą się z ujemnie naładowanymi grupami w białkach.
Wysiaduj w ciemności. Wypłucz żel w ultraczystej wodzie, aby usunąć niezwiązane kompleksy jonów srebra.
Zanurz żel w roztworze rozwijającym zawierającym wieloskładnikową sondę fluorogeniczną - TPE-4TA. Ta anionowa sonda celuje w jony srebra związane z białkiem, tworząc nierozpuszczalne agregaty, które aktywują właściwości fluorogeniczne sondy, nadając w ten sposób fluorescencję.
Ponieważ aktywacja fluorescencji jest zależna od agregacji, niezwiązane sondy nie emitują żadnego sygnału, umożliwiając całkowite barwienie białek przy zmniejszonej emisji tła.
Inkubować żel w ciemności, delikatnie mieszając, zapewniając pełny rozwój fluorogeniczny. Przenieś żel do buforu do
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych