Barwienie srebrem fluorescencyjnym: technika wizualizacji białka całkowitego w żelach poliakrylamidowych

Fluorescencyjne barwienie białek w żelach poliakrylamidowych srebrem wykorzystuje sondy fluorogenne do wykrywania i ilościowego oznaczania białek.

Zacznij od żelu poliakrylamidowego z białkami, podzielonymi na pasma za pomocą elektroforezy. Namocz w utrwalającej mieszaninie etanolu i kwasu octowego, która zapobiega dyfuzji prążków poprzez denaturację białek.

Umyj żel, aby usunąć resztki kwasu octowego i etanolu. Zanurz żel w plamie z azotanu srebra. Jony srebra silnie wiążą się z ujemnie naładowanymi grupami w białkach.

Wysiaduj w ciemności. Wypłucz żel w ultraczystej wodzie, aby usunąć niezwiązane kompleksy jonów srebra.

Zanurz żel w roztworze rozwijającym zawierającym wieloskładnikową sondę fluorogeniczną - TPE-4TA. Ta anionowa sonda celuje w jony srebra związane z białkiem, tworząc nierozpuszczalne agregaty, które aktywują właściwości fluorogeniczne sondy, nadając w ten sposób fluorescencję.

Ponieważ aktywacja fluorescencji jest zależna od agregacji, niezwiązane sondy nie emitują żadnego sygnału, umożliwiając całkowite barwienie białek przy zmniejszonej emisji tła.

Inkubować żel w ciemności, delikatnie mieszając, zapewniając pełny rozwój fluorogeniczny. Przenieś żel do buforu do odbarwiania, aby usunąć niezwiązane sondy. Na koniec zobrazuj żel, aby uzyskać intensywność sygnału pasma. Wykreślić intensywność sygnału fluorescencji w stosunku do krzywej białka wzorcowego, aby obliczyć całkowitą ilość białek w próbce.

Po elektroforezie zanurzyć żel w 100-mililitrowym roztworze zawierającym etanol i kwas octowy na wytrząsarce orbitalnej i inkubować dwukrotnie po 30 minut w temperaturze pokojowej, wytrząsając z prędkością 50 obr./min. Następnie umyj żel trzykrotnie ultraczystą wodą w czystym pojemniku, przy czym każde mycie trwa 10 minut.

Najpierw rozpuść 0,01 grama azotanu srebra w 10 mililitrach ultraczystej wody, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 0,1%. Dodaj 100 mikrolitrów tego roztworu podstawowego do 100 mililitrów ultraczystej wody, aby uzyskać roztwór roboczy azotanu srebra. W dygestorium zanurzyć żel w 100 mililitrach roztworu roboczego azotanu srebra w szczelnie zamkniętej szklanej komorze.

Użyj folii aluminiowej, aby chronić żel przed światłem podczas impregnacji i inkubuj przez 1 godzinę, wstrząsając z prędkością 50 obr./min na wytrząsarce orbitalnej. Następnie umyj żel dwukrotnie ultraczystą wodą w czystym pojemniku, przy czym każde mycie przy użyciu około 100 mililitrów wody trwa 60 sekund.

Ważne jest, aby używać ultraczystej wody do czyszczenia żelu po etapie impregnacji srebrem, aby zminimalizować plamy tła.

Najpierw dodaj 50 mililitrów ultraczystej wody do 3 miligramów barwnika TPE-4TA. Sonikować roztwór przez 3 minuty i dodawać 5 mikrolitrów 1 molowego roztworu wodorotlenku sodu pomiędzy każdą sesją sonikacji, aby pomóc rozpuścić barwnik, zwykle do trzech razy. Następnie sprawdź fluorescencję roztworu pod lampą UV 365 nanometrów, aby upewnić się, że barwnik jest całkowicie rozpuszczony. Tylko słabe lub nieemisyjne roztwory wskazują na całkowite rozpuszczenie.

Aby przygotować fluorogeniczny roztwór wywołujący, dodaj 10 mililitrów roztworu podstawowego TPE-4TA do 90 mililitrów ultraczystej wody. Użyj pH-metru, aby sprawdzić pH roztworu. Dostosuj roztwór do pH między 7 a 9, używając rozcieńczonego roztworu wodorotlenku sodu lub kwasu octowego, jeśli pH jest poza zakresem.

Następnie przenieś żel do czystego i zamykanego pojemnika ze 100 mililitrami fluorogenicznego roztworu rozwijającego i upewnij się, że żel jest całkowicie zanurzony. Zamknij pojemnik i przykryj go, aby chronić go przed światłem. Wstrząsnąć pojemnikiem przez noc na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min i w temperaturze pokojowej.

Przenieś żel do czystego pojemnika i odplam go w 100 mililitrach 10% etanolu przez 30 minut. Następnie płucz żel w ultraczystej wodzie przez 5 minut. Żel może być wizualizowany na stacjonarnym trans-iluminatorze lub zobrazowany na maszynie do dokumentacji żelu w kanale 365-nanometrowym lub 302-nanometrowym.