Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki za pomocą sondy fotopowinowactwa, która może wiązać się ze swoim celem w żywych komórkach, umożliwiając późniejszą izolację i identyfikację celu. Metoda ta może być wykorzystana do wyjaśnienia molekularnego mechanizmu działania leków lub innych małych cząsteczek. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w natywnym środowisku komórkowym, eliminując ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Rozpocznij tę procedurę, przygotowując sterylne sześciocentymetrowe szalki do hodowli komórkowych dla pożądanej liczby próbek. Zazwyczaj stosuje się jedno naczynie z komórkami na każdy warunek leczenia. Do tej demonstracji zostaną przygotowane trzy szalki komórek, a kontrola ujemna tylko za pomocą DMSO, oznaczona D, tylko leczenie sondą, oznaczone P i sonda plus konkurent, oznaczone C.To każdej szalce hodowlanej, dodadzą 3,5 miliona limfocytów T HEK 293 w czterech mililitrach pożywki hodowlanej.

Inkubuj komórki przez noc. Przed poddaniem ich działaniu należy wstępnie podsycić potrzebne leki do 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych. W przypadku konkurencyjnej obróbki wstępnej dodaj cztery mikrolitry DMSO do każdej z dwóch probówek i cztery mikrolitry 10-milimolowego konkurenta do jednej probówki.

Do leczenia sondą dodaj 16 mikrolitrów DMSO do jednej probówki i 16 mikrolitrów 15 mikromolowej sondy fotopowinowactwa do każdej z dwóch probówek. Wprowadzić szalki z hodowli komórkowych do okapu do hodowli komórkowych w celu dodania wstępnie podawanych leków. Odessać jeden mililitr pożywki hodowlanej z czaszy do leczenia konkursowego, przenieść ją do probówki mikrowirówki, która zawiera wstępnie zawartościowanego konkurenta, i ponownie zawiesić lek w pożywce.

Delikatnie dodaj pożywkę i mieszaninę leków kroplami z powrotem do naczynia. W ten sam sposób dodaj DMSO zarówno do naczynia kontroli ujemnej, jak i do naczynia z sondą. Włóż naczynia do inkubatora na 30 minut.

Po 30 minutach włóż naczynia z powrotem do okapu hodowlanego i przyciemnij światła. Dodać wstępnie podymimulowany DMSO do szalki kontroli ujemnej, a sondę do sondy i szalek konkurencji. Włóż naczynia do inkubatora na godzinę.

Po godzinie ułóż naczynia na lodzie. Delikatnie umyj komórki w każdym naczyniu pięcioma mililitrami lodowatego PBS, aby usunąć nadmiar sondy. Ponownie przykryj komórki czterema mililitrami lodowatego PBS.

Umieść naczynie z komórkami, wyśrodkowane trzy centymetry pod lampą UV na wierzchu okładu z lodu, aby zminimalizować nagrzewanie się lampy i naświetlaj przez trzy minuty. Wyjmij naczynie i połóż je na lodzie. W ten sposób należy napromienić wszystkie próbki.

Po napromienieniu wszystkich próbek, odessać PBS z komórek i dodać 200 mikrolitrów lodowatego PBS z inhibitorami proteazy do każdej potrawy. Odłącz komórki od naczynia za pomocą gumowego skrobaka i przenieś do wstępnie oznakowanych probówek mikrowirówek na lodzie. Dodaj SDS do każdej próbki do końcowego stężenia 0,4%Zlizuj komórki, sonikując zawiesinę przez 10 impulsów, inkubując na lodzie przez jedną minutę, a następnie sonikując przez kolejne 10 impulsów.

Gotuj próbki na bloku grzewczym ustawionym na 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zakończyć lizę komórek i denaturację wszystkich białek. Po zmierzeniu stężenia białka w każdej próbce, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, znormalizuj stężenie białka do 2,5 miligrama na mililitr, dodając PBS PH 8,5 plus 0,4% SDS w razie potrzeby. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś 40 mikrolitrów każdego lizatu komórkowego, przygotowanego w poprzednim segmencie, do nowej probówki do mikrowirówki.

Dodaj następujące odczynniki w tej kolejności: 0,2 mikrolitra azydku mąki, 0,58 mikrolitra TCEP i 3,38 mikrolitra TBTA. Wirować do mieszania. Dodaj 1,14 mikrolitra pięciowodnego siarczanu miedzi, aby rozpocząć reakcję.

Krótko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Dodaj 50 mikrolitrów buforu do próbek 2X SDS, aby wygasić reakcję. Uruchom próbki na żelu SDS-PAGE, a gdy przód barwnika dotrze do końca żelu, kontynuuj uruchamianie żelu przez dodatkowe pięć minut, aby upewnić się, że cały nadmiar nieprzereagowanego azydku mąki całkowicie opuścił żel.

Po zmyciu całego nadmiaru azydku mąki należy umieścić żel na szklanej płytce i zeskanować żel za pomocą skanera do żelu fluorescencyjnego, zgodnie z instrukcją producenta. Do zamocowania znacznika biotyny należy użyć maksymalnej ilości lizatów komórkowych po normalizacji białek, tak aby wszystkie próbki miały tę samą objętość. Wstępnie oczyść lizaty, dodając każdą próbkę do nowej probówki, zawierającej 50 mikrolitrów wstępnie umytych kulek agarozy streptawidyny o dużej pojemności.

Inkubować przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją. Granulki osadzać przez odwirowanie. Usunąć supernatant do nowej probówki do mikrowirówki na lodzie i wyrzucić kulki.

Na 500 mikrolitrów lizatu dodaj następujące odczynniki: 1,38 mikrolitra azydku biotyny, 5,5 mikrolitra TCEP i 32,5 mikrolitra TBTA. Wirować do mieszania. Dodać 11 mikrolitrów pięciowodnego siarczanu miedzi na 500 mikrolitrów lizatu i krótko odwirować.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodać cztery objętości próbki acetonu, schłodzonej do 20 stopni Celsjusza, zagłodzić próbki i inkubować przez noc w temperaturze 80 stopni Celsjusza, aby całkowicie wytrącić białka i usunąć nieprzereagowany azydek biotyny. Następnego dnia odwirować próbki o masie 17 000 x g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu osadzenia wytrąconych białek.

Całkowicie odessać supernatant, dodać 150 mikrolitrów PBS PH 7,4 i 1% SDS do każdej próbki i ponownie rozpuścić białka przez sonikację. Dodaj 600 mikrolitrów PBS do każdej próbki, aby rozcieńczyć stężenie SDS do 0,2%, następnie dodaj próbkę do nowej probówki zawierającej 30 mikrolitrów wstępnie umytych kulek agarozy streptawidyny o dużej pojemności. Inkubować przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza z rotacją.

Po godzinie granulki osadzać przez odwirowanie przy 1000 x g przez trzy minuty. Odessać i odrzucić supernatant zawierający niezwiązane białka. Dodaj jeden mililitr buforu do płukania do kulek i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej z rotacją.

Odwirować, wyrzucić supernatant i ponownie przemyć buforem do płukania. Po ostatnim płukaniu całkowicie odessać bufor do płukania z kulek i dodać 30 mikrolitrów buforu do próbek 2X SDS. Inkubuj przez pięć minut w bloku grzewczym o temperaturze 95 stopni Celsjusza, aby uwolnić białka z kulek.

Odwirować kulki o sile 13000 x g w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Ostrożnie odpipetować bufor próbki, zawierający białka z kulek, dla SDS-PAGE. Wizualizacja białek po znakowaniu znacznikiem fluorescencyjnym, jest zilustrowana przez ten fluorescencyjny zeskanowany żel.

Główne specyficzne pasmo białka wiążącego, o wielkości około 35 kilodaltonów, jest obecne tylko w torze sondy i jest konkurowane przez nadmiar związku macierzystego. To samo pasmo 35 kilodaltonów zostało uwidocznione przez barwienie srebrem po usunięciu biotyny, a następnie zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas jako białko błonowe VDAC1. Tożsamość białka poddano dalszej walidacji przy użyciu specyficznego przeciwciała przeciwko VDAC1.

Sygnał jest obecny na torze sondy i osłabiony na torze zawodów. Włączenie frakcji wejściowej zapewnia, że przeciwciało działa, a białko będące przedmiotem zainteresowania może zostać wykryte w lizacie. Niewielki wzrost masy cząsteczkowej próbek pulldown jest spowodowany gęsto przymocowaną sondą.

Zilustrowano konsekwencje nieprawidłowego wykonania niektórych kroków w protokole. Niepełne usunięcie nadmiaru azydku mąki powoduje powstawanie dużych czarnych smug na dnie zeskanowanego żelu fluorescencyjnego, podczas gdy niewystarczające wstępne usunięcie lizatów i/lub mycie kulek skutkuje powstaniem srebrzystego żelu o bardzo wysokim zabarwieniu tła. Od początku do końca eksperyment rozwijany trwa od dwóch do trzech dni.

Po wyizolowaniu białka docelowego i zidentyfikowaniu go za pomocą spektrometrii mas lub western blot, należy przeprowadzić dalsze eksperymenty walidacyjne specyficzne dla celu, aby ocenić znaczenie celu dla fenotypu wywołanego lekiem.