Name: Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa w żywych komórkach HEK 293 T. Technika ta pozwala zachować natywną strukturę białek podczas badania mechanizmów działania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Benowi Nacev za porady dotyczące projektu protokołu znakowania fotopowinowactwa, dr Wei Shi za zsyntetyzowanie sondy fotopowinowactwa itrakonazolu, dr Yongjun Dang za porady dotyczące eksperymentów z powinowactwem i innym członkom laboratorium J.O.L. za pomocne komentarze i wsparcie. Praca ta była częściowo wspierana przez stypendium Fundacji PhRMA w dziedzinie farmakologii/toksykologii (dla S.A.H.); Grant Narodowego Instytutu Raka R01CA184103; Instytut Medyczny Stewardesy i Stewardesy; Fundacja na rzecz Walki z Rakiem Prostaty (J.O.L.); oraz Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research, który jest częściowo finansowany przez Grant UL1 TR 001079 z National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS).

UWAGA: Ten protokół został zaadaptowany z MacKinnon i Taunton10 do użytku w żywych komórkach.
1. Przygotowanie hodowanych komórek
<ol>
	<li>Przygotować sterylne 6-centymetrowe naczynia do hodowli komórkowych dla żądanej liczby próbek (patrz poniżej). 
	UWAGA: Na każdy warunek leczenia stosuje się jedno naczynie z komórkami, ale jeśli wymagana jest większa ilość białka, można przygotować 2 lub 3 naczynia na warunek i połączyć je po naświetlaniu promieniowaniem UV.
	<ol>
		<li>Przygotuj co najmniej 3 naczynia z komórek; Kontrola ujemna tylko z DMSO (D), tylko leczenie sondą (P) i sonda + konkurent (C).</li>
		<li>Opcjonalnie przygotuj4-te danie jako kontrolę UV, które ma być traktowane sondą, ale nie poddawane działaniu światła UV. 
		UWAGA: Jeśli ma być testowanych wiele cząsteczek konkurencyjnych, takich jak różne analogi małej cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania, w razie potrzeby przygotuj dodatkowe płytki konkurencyjne</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać HEK293T komórek do szalek hodowlanych w 4 ml pożywki hodowlanej. Użyj 3,5 miliona komórek na płytkę. 
	UWAGA: Liczba komórek powinna być określona dla każdego typu komórki tak, aby komórki były prawie w 100% zlewające się na początku eksperymentu, w celu osiągnięcia maksymalnej wydajności białka. W przypadku HUVEC użyj 0,3 miliona komórek na płytkę. Dobre przybliżenie to 1/10 komórek w zlewającym się naczyniu o średnicy 15 cm. HEK293T komórki powinny być hodowane w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Modified Eagles Medium uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.</li>
	<li>Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze hodowli (37 °C, 5% CO2 ) na noc.</li>
</ol>
2. Leczenie komórek i fotosieciowanie
<ol>
	<li>Następnego dnia należy wstępnie podacznie podaczkować następujące leki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml:
	<ol>
		<li>Do pierwszego zabiegu dodaj 4 μl DMSO do 2 probówek i 4 μl konkurenta 10 mM (tj. niezmodyfikowanego związku macierzystego) do 1 probówki.</li>
		<li>W przypadku drugiego zabiegu dodaj 16 μl DMSO do 1 probówki i 16 μl sondy fotopowinowactwa 50 μM do 2 probówek. 
		UWAGA: Optymalne stężenie może być różne dla różnych sond (patrz dyskusja), ale dobrym punktem wyjścia jest zakres 200-500 nM (tutaj używamy 200 nM). Stężenie konkurenta powinno przekraczać stężenie sondy co najmniej 20-krotnie (tutaj używamy 10 μM). Końcowe stężenie DMSO powinno być równe we wszystkich płytkach i nie powinno przekraczać 0,5% (objętość 20 μl).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić płytki komórkowe w kapturze do hodowli komórkowej i dodać wstępnie podymilizowane leki z kroku 2.1.1 w następujący sposób: Odessać 1 ml pożywki hodowlanej, ponownie zawiesić wstępnie podany lek w pożywce i delikatnie dodawać go z powrotem do płytki kroplami. Dodaj DMSO do płytki DMSO (D) i płytki sondy (P), a następnie dodaj konkurenta do płytki konkurencji (C). Włóż płytki do inkubatora hodowli na 30 minut.</li>
	<li>Przy przyciemnionych światłach w okapie hodowlanym dodać wstępnie podtrzymaną sondę z kroku 2.1.2 do płytek sondy (P) i konkurencji (C) i dodać DMSO do płytki DMSO (D), jak powyżej. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze hodowlanym na 1 godzinę.</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotuj następujące elementy; Taca z lodem, która zmieści wszystkie talerze; lodowaty bufor do lizy (PBS [pH 8,5] + 1x koktajl inhibitorów proteazy [kompletny wolny od EDTA, rozcieńczony z 50x roztworu podstawowego przygotowanego w wodzie]; 200 μl/płytkę); probówki wirówkowe oznaczone jako D, P lub C dla każdego z różnych warunków obróbki, na lodzie.</li>
	<li>Na 15 minut przed końcem 1 godzinnej inkubacji ustaw lampę UV (365 nm) w chłodni i włącz ją, aby rozgrzać żarówkę.</li>
	<li>Po 1 godzinie inkubacji z sondą umieść naczynia na lodzie. Delikatnie umyj komórki 5 ml lodowatego PBS (pH 7,4), aby usunąć nadmiar sondy. Ponownie przykryj komórki 4 ml lodowatego PBS.</li>
	<li>Umieść naczynie z komórkami wyśrodkowanymi 3 cm pod lampą UV na opakowaniu z lodem, aby zminimalizować nagrzewanie się lampy. Naświetlać przez 3 min. Wyjmij naczynie na tackę z lodem i powtórz tę czynność dla wszystkich próbek.</li>
	<li>Po napromieniowaniu odessać PBS z komórek i dodać 200 μl lodowatego PBS (pH 8,5) z inhibitorami proteazy do każdej płytki. Oderwij komórki od płytki za pomocą gumowego skrobaka i przenieś do wstępnie oznakowanych probówek do mikrowirówek na lodzie.</li>
	<li>Dodać SDS do końcowego stężenia 0,4% (10 μl 10% SDS do 250 μl próbki). 
	UWAGA: Proszek SDS jest niebezpieczny. Unikaj wdychania proszku SDS, zakładając maskę na nos i usta.</li>
	<li>Poddać komórki lizie przez sonikację zawiesiny przez 10 impulsów (wyjście 1, cykl pracy 30%) i inkubować na lodzie przez 1 minutę przed drugą rundą 10 impulsów.</li>
	<li>W razie potrzeby usuń 2 μl zawiesiny i sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby zapewnić całkowitą lizę komórek.</li>
	<li>Gotować próbki na gorącej płycie ustawionej na 95 °C przez 5 minut, aby zakończyć lizę komórek i denaturację wszystkich białek.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie białka w każdej próbce za pomocą spektrofotometrycznego testu białkowego kompatybilnego z detergentem, takiego jak test białka Dc19, zgodnie z instrukcjami producenta, za pomocą spektrofotometru ustawionego do pomiaru absorbancji przy 750 nm.</li>
	<li>Znormalizować stężenie białka do 2,5 mg/ml (lub jeśli stężenia są niższe niż 2,5 mg/ml, znormalizować do próbki o najniższym stężeniu białka), dodając PBS pH 8,5 + 0,4% SDS w razie potrzeby (na przykład, jeśli próbki mają 5 mg/ml w 250 μl, dodaj 250 μl PBS pH 8,5 + 0,4% SDS, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5 mg/ml).</li>
</ol>
3. Dołączanie znacznika fluorescencyjnego za pomocą kliknięcia chemii do wizualizacji znakowanych białek
<ol>
	<li>Usunąć 40 μl lizatu komórkowego i przenieść do nowej probówki do mikrowirówki. Zachowaj pozostałe lizaty do reakcji z azydkiem biotyny (krok 4).</li>
	<li>Dodaj kolejno następujące odczynniki: 0,2 μl fluor-azydku (1 mM roztwór podstawowy w DMSO), 0,58 μl TCEP (100 mM zapasu w wodzie z dodatkiem 4 równoważników NaOH, przygotowany na świeżo) i 3,38 μl TBTA (1,7 mM zapas w stosunku 4:1 t-butanolu do DMSO). Wirować do mieszania.</li>
	<li>Dodać 1,14 μl CuSO4-5H 2O (50 mM w wodzie), aby rozpocząć reakcję. Krótko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności.</li>
	<li>Dodać 50 μl 2x buforu próbki SDS w celu wygaszenia reakcji. W tym momencie należy umieścić próbki bezpośrednio na żelu SDS-PAGE20, aby uzyskać najlepsze wyniki, lub przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc, jeśli to konieczne.</li>
	<li>W przypadku zamrożenia próbek, podgrzewać ponownie przez 5 minut w temperaturze 95 °C przed załadowaniem do żelu. 
	UWAGA: Ponieważ masa cząsteczkowa docelowego białka zazwyczaj nie jest znana na tym etapie, zaleca się stosowanie 2 żeli o różnych stężeniach akrylamidu (tj. 8% i 15%) lub żelu gradientowego o szerokim zakresie mas cząsteczkowych (tj. 4-15%), aby zapewnić pełne pokrycie masy cząsteczkowej.</li>
	<li>Gdy przód barwnika dotrze do końca żelu, kontynuuj uruchamianie żelu przez dodatkowe 5 minut, aby upewnić się, że cały nadmiar nieprzereagowanego azydku fluoru całkowicie opuścił żel.</li>
	<li>Wyjąć żel do pojemnika zddH2O i inkubować przez 10 minut, delikatnie mieszając, aby zmyć nadmiar azydku fluoru.</li>
	<li>Umieść żel na szklanej płytce i zeskanuj żel za pomocą skanera fluorescencyjnego do żelu Typhoon zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
4. Dołączanie znacznika biotyny za pomocą kliknięcia Chemia do oczyszczania powinowactwa znakowanych białek
<ol>
	<li>Spośród pozostałych lizatów z kroku 3.1 należy użyć maksymalnej ilości po normalizacji białka, tak aby wszystkie próbki miały tę samą objętość (na przykład, jeśli po normalizacji do 2,5 mg/ml otrzymane objętości próbki wynoszą 500, 550 i 600 μl, należy użyć 500 μl każdego z nich).</li>
	<li>Wstępnie oczyść lizaty, dodając do 50 μl granulek agarozy streptawidyny o dużej pojemności, wstępnie umytych 2x PBS (pH 7,4). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z rotacją.</li>
	Granulki osadzać <li>przez odwirowanie w stężeniu 1 000 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant do nowej probówki do mikrowirówki na lodzie i wyrzucić kulki.</li>
	<li>Usuń 1-2% próbki DMSO do nowej probówki oznaczonej jako "wejście". Dodać równoważną objętość 2 próbek SDS i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Na 500 μl lizatu dodać następujące odczynniki: 1,38 μl azydku biotyny (10 mM zapasu w DMSO), 5,5 μl TCEP i 32,5 μl TBTA. Wirować do mieszania.</li>
	<li>Dodać 11 μl CuSO4-5H 2O na 500 μl lizatu i krótko odwirować. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać 4 objętości próbki acetonu schłodzonego do temperatury -20 °C. Próbki należy przemieszać wirowo i inkubować przez noc w temperaturze -80 °C, aby całkowicie wytrącić białka i usunąć nieprzereagowany azydek biotyny.</li>
	<li>Odwirować próbki w temperaturze 17 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia wytrąconych białek.</li>
	<li>Całkowicie odessać supernatant i rozpuścić białka przez sonikację w 150 μl PBS (pH 7,4) + 1% SDS.</li>
	<li>Dodać 600 μl PBS (pH 7,4), aby rozcieńczyć stężenie SDS do 0,2%.</li>
	<li>Dodać próbki do 30 μl, wstępnie umytych, wysokopojemnych kulek agarozy streptawidyny i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C z rotacją.</li>
	Granulki osadzać <li>przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 3 minuty. Odessać supernatant zawierający niezwiązane białka i odrzucić.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do przemywania (400 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,2% SDS, pH 7,4) do kulek i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej z rotacją.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.12 i 4.13 3 razy.</li>
	<li>Całkowicie odessać bufor płuczący z kulek i dodać 30 μl 2x buforu do próbek SDS.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut na bloku grzewczym o temperaturze 95 °C, aby uwolnić białka z kulek.</li>
	<li>Odwirowywać kulki przez 1 minutę w temperaturze 13 000 x g w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą gotowe do uruchomienia SDS-PAGE. W przypadku zamrażania próbek przed użyciem należy ponownie podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Ostrożnie odpipetować bufor próbki zawierający białka z kulek i załadować na kartę charakterystyki na stronie20 (patrz ważne uwagi poniżej). W razie potrzeby kulki można zachować do późniejszego ponownego wgotowania. 
	UWAGA: W przypadku wykrywania białek za pomocą barwienia srebrem lepsze wyniki uzyskuje się przy użyciu żelu o grubości 1 mm. Jeżeli z barwionego srebrem żelu ma zostać wycięta prążek do analizy metodą spektrometrii mas (MS), należy przygotować wszystkie odczynniki świeże ze sterylnych roztworów i pozostawić pustą studzienkę między próbkami na żelu. Dla każdego pasma wyciętego z toru sondy, należy pobrać równoległy wycinek z toru DMSO, aby można było odjąć białka tła. W celu walidacji identyfikacji białka za pomocą western blot ważne jest, aby podczas uruchamiania żelu SDS-PAGE załadować również próbkę wejściową z kroku 4.4.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem dla barwienia srebrem21 lub Western blot22, aby wykryć docelowe białko (białka).</li>
</ol>

<ol><li>Schenone, M., Dančìk, V., Wagner, B. K., Clemons, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+and+mechanism+of+action+in+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Target identification and mechanism of action in chemical biology and drug discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (4), 232-240 (2013).</li>
<li>Cook, D., Brown, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+the+fate+of+AstraZeneca%27s+drug+pipeline%3A+a+five-dimensional+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (6), 419-431 (2014).</li>
<li>Titov, D. V., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+validation+of+protein+targets+of+bioactive+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and validation of protein targets of bioactive small molecules.</a> Bioorg Med Chem. 20 (6), 1902-1909 (2012).</li>
<li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules%3A+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Arch Pharm Res. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li>
<li>Sumranjit, J., Chung, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+Target+Characterization+and+Identification+by+Photoaffinity+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in Target Characterization and Identification by Photoaffinity Probes.</a> Molecules. 18 (9), 10425-10451 (2013).</li>
<li>Robles, O., Romo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemo-+and+site-selective+derivatizations+of+natural+products+enabling+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prod+Rep%22%5BJournal%5D)">Chemo- and site-selective derivatizations of natural products enabling biological studies.</a> Nat Prod Rep. 31 (3), 318-334 (2014).</li>
<li>Zhou, Q., Gui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconjugation+by+Native+Chemical+Tagging+of+C-H+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioconjugation by Native Chemical Tagging of C-H Bonds.</a> J Am Chem Soc. 135 (35), (2013).</li>
<li>Li, Z., Hao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Synthesis+of+Minimalist+Terminal+Alkyne-Containing+Diazirine+Photo-Crosslinkers+and+Their+Incorporation+into+Kinase+Inhibitors+for+Cell-+and+Tissue-Based+Proteome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Design and Synthesis of Minimalist Terminal Alkyne-Containing Diazirine Photo-Crosslinkers and Their Incorporation into Kinase Inhibitors for Cell- and Tissue-Based Proteome Profiling.</a> Angew Chem Int Edit. 52 (33), 8551-8556 (2013).</li>
<li>Chamni, S., He, Q. L., Dang, Y., Bhat, S., Liu, J. O., Romo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazo+reagents+with+small+steric+footprints+for+simultaneous+arming%2FSAR+studies+of+alcohol-containing+natural+products+via+O-H+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chem+biol%22%5BJournal%5D)">Diazo reagents with small steric footprints for simultaneous arming/SAR studies of alcohol-containing natural products via O-H insertion.</a> ACS chem biol. 6 (11), 1175-1181 (2011).</li>
<li>Mackinnon, A. L., Taunton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+Identification+by+Diazirine+Photo-Cross-linking+and+Click+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Target Identification by Diazirine Photo-Cross-linking and Click Chemistry.</a> Curr Protoc Chem Biol. 1, 55-73 (2009).</li>
<li>Smith, E., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoaffinity+labeling+in+target-+and+binding-site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Future+med+chem%22%5BJournal%5D)">Photoaffinity labeling in target- and binding-site identification.</a> Future med chem. 7 (2), 159-183 (2015).</li>
<li>Huisgen, R., Szeimies, G., Möbius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1.3-Dipolare+Cycloadditionen%2C+XXXII.+Kinetik+der+Additionen+organischer+Azide+an+CC-Mehrfachbindungen%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Ber%22%5BJournal%5D)">1.3-Dipolare Cycloadditionen, XXXII. Kinetik der Additionen organischer Azide an CC-Mehrfachbindungen.</a> Chem Ber. 100 (8), 2494-2507 (1967).</li>
<li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry%3A+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40 (11), 2004-2021 (2001).</li>
<li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process%3A+copper%28I%29-catalyzed+regioselective+%26%2334%3Bligation%26%2334%3B+of+azides+and+terminal+alkynes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective &#34;ligation&#34; of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41 (14), 2596-2599 (2002).</li>
<li>Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+Solid+Phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-Triazoles+by+Regiospecific+Copper%28I%29-Catalyzed+1%2C3-Dipolar+Cycloadditions+of+Terminal+Alkynes+to+Azides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides.</a> J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).</li>
<li>Head, S. A., Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+drug+itraconazole+targets+VDAC1+to+modulate+the+AMPK%2FmTOR+signaling+axis+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Antifungal drug itraconazole targets VDAC1 to modulate the AMPK/mTOR signaling axis in endothelial cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (52), E7276-E7285 (2015).</li>
<li>Shi, W., Nacev, B. A., Aftab, B. T., Head, S., Rudin, C. M., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itraconazole+Side+Chain+Analogues%3A+Structure-Activity+Relationship+Studies+for+Inhibition+of+Endothelial+Cell+Proliferation%2C+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor+2+%28VEGFR2%29+Glycosylation%2C+and+Hedgehog+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Itraconazole Side Chain Analogues: Structure-Activity Relationship Studies for Inhibition of Endothelial Cell Proliferation, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 (VEGFR2) Glycosylation, and Hedgehog Signaling.</a> J Med Chem. 54 (20), 7363-7374 (2011).</li>
<li>Shi, W., Nacev, B. A., Bhat, S., Liu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Absolute+Stereochemistry+on+the+Antiangiogenic+and+Antifungal+Activities+of+Itraconazole%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Impact of Absolute Stereochemistry on the Antiangiogenic and Antifungal Activities of Itraconazole.</a> ACS Med Chem Lett. 1 (4), 155-159 (2010).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Bioph+Res+Co%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Bioph Res Co. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+silver+stain+for+detecting+proteins+and+peptides+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels.</a> Anal Biochem. 98 (1), 231-237 (1979).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> P Natl Acad Sci USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Różne podejścia do identyfikacji celów małych cząsteczek można ogólnie podzielić na dwie kategorie: odgórne, w których fenotyp komórkowy leku jest wykorzystywany do zawężenia jego potencjalnych celów na podstawie ich znanych funkcji, lub oddolne, w których cel jest identyfikowany bezpośrednio za pomocą środków chemicznych lub genetycznych3. Badania odgórne lub fenotypowe mogą zidentyfikować pewne procesy komórkowe, na które wpływa lek (np. transkrypcja/translacja/synteza DNA, blok cyklu komórkowego, a...

Bioaktywne małe cząsteczki zasadniczo działają poprzez interakcję i zmianę funkcji jednej lub więcej "docelowych" cząsteczek, najczęściej białek, w komórce. W procesie odkrywania leków, gdy związek aktywny jest odkrywany w wyniku fenotypowych badań przesiewowych, identyfikacja celu molekularnego (celów) molekularnych tego związku ma kluczowe znaczenie nie tylko dla zrozumienia mechanizmu działania i potencjalnych skutków ubocznych związku, ale także dla potencjalnego odkrycia nowej biologii leżącej u podstaw modelu choroby i utorowania drogi do opracowania nowych mechanistycznych klas terapeutycznych1. Chociaż identyfikacja celu nie jest wymagana, aby lek mógł być stosowany terapeutycznie, w ostatnich latach coraz częściej uznaje się, że nowi kandydaci na leki mają większe szanse na sukces w badaniach klinicznych, a tym samym przynoszą lepszy zwrot z inwestycji, jeśli znany jest zatwierdzony cel2. W związku z tym rośnie zainteresowanie metodami identyfikacji małocząsteczkowych białek docelowych.
Klasyczny eksperyment z identyfikacją celu zazwyczaj opiera się na oczyszczaniu powinowactwa, gdzie mała cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest immobilizowana na żywicy i inkubowana z całymi lizatami komórkowymi, po czym niezwiązane białka są wypłukiwane, a pozostałe białka są eluowane i identyfikowane3. Chociaż technika ta została wykorzystana do identyfikacji celów wielu małych cząsteczek 4, nie nadaje się jako uniwersalna metoda identyfikacji celuz kilku powodów. Po pierwsze, białko docelowe musi zachować swoją natywną konformację podczas lizy komórki, aby zachować zdolność do wiązania się z małą cząsteczką. Może to być szczególnie problematyczne w przypadku białek błonowych, które często ulegają zmianom konformacyjnym po usunięciu z ich naturalnego środowiska lub po prostu agregują się i wytrącają z roztworu. Po drugie, mała cząsteczka musi zostać chemicznie zmodyfikowana w taki sposób, aby mogła zostać unieruchomiona na żywicy, zachowując jednocześnie jej zdolność do wiązania docelowego białka. Głębokie kieszenie wiążące mogą zatem stać się niedostępne dla małej cząsteczki po jej związaniu z żywicą. Po trzecie, powinowactwo wiązania musi być na tyle wysokie, aby interakcja była utrzymywana podczas etapów mycia, co utrudnia identyfikację oddziaływań o niższym powinowactwie. Po czwarte, warunki środowiskowe, takie jak pH, stężenie jonów lub obecność innych cząsteczek endogennych, mogą zmieniać się przestrzennie w komórce i czasami są warunkiem wstępnym interakcji lek-cel. W związku z tym znalezienie odpowiednich warunków umożliwiających i utrzymujących wiązanie na zewnątrz komórki może wymagać znacznej ilości prób i błędów.
Oznaczanie fotopowinowactwa pozwala obejść te problemy, umożliwiając kowalencyjne wiązanie małej cząsteczki i jej celu w natywnym kontekście komórki. Zamiast unieruchamiać małą cząsteczkę do dużej, masywnej żywicy, cząsteczka jest chemicznie modyfikowana w celu zainstalowania dwóch małych grup funkcyjnych: fotoaktywowanej części, która umożliwia kowalencyjne sieciowanie z białkiem docelowym po napromieniowaniu określoną długością fali światła, oraz grupy reporterowej, która umożliwia wykrycie białka docelowego, a następnie wyizolowanie. Żywe komórki są traktowane sondą fotopowinowactwa, sonda wiąże się i kowalencyjnie sieciuje krzyżowo z białkiem docelowym, a następnie kompleks sonda-białko jest izolowany w stanie nienaruszonym. Specyficzność wiązania sondy z celem jest wykazywana poprzez równoległe przeprowadzanie eksperymentu konkurencji, w którym nadmiar związku macierzystego jest używany do konkurowania o wiązanie sondy z białkiem docelowym.
Konstrukcja i synteza sond fotopowinowactwa różni się znacznie w zależności od małej cząsteczki i nie będzie omówiona w tym protokole; jednak kilka doskonałych dyskusji na ten temat zostało opublikowanych5-9. Główną kwestią jest to, że sonda zachowuje bioaktywność związku macierzystego, a zatem przypuszczalnie wiąże się z tym samym celem (celami). Należy przeprowadzić badania zależności struktura-aktywność (SAR) w celu określenia, które części cząsteczki mogą być modyfikowane bez utraty bioaktywności. Jako fotoaktywowane środki sieciujące zastosowano wiele różnych grup chemicznych, w tym diazyrynę, benzofenon i azydek arylu, z których każda ma zalety i wady10. Podobnie, istnieje wiele znaczników reporterowych, które zostały użyte do wyizolowania białek wiążących sondę. Grupy reporterowe mogą funkcjonować samodzielnie, takie jak powszechnie stosowana biotyna lub znaczniki fluorescencyjne, lub mogą być prekursorami, które wymagają dalszej funkcjonalizacji po etapie fotosieciowania, które mają tę zaletę, że są mniejsze, a tym samym mniej prawdopodobne, że zagrozi bioaktywności11.
W tym protokole użyliśmy sondy fotopowinowactwa zawierającej grupę fotosieciującą diazyrynę oraz końcowej alkinu do przyłączenia grupy reporterowej poprzez katalizowaną Cu(I) reakcję cykloaddycji (lub kliknięcia) Azide-Alkine Sharplessa-Hüisgena12-15. Badania SAR, projekt i synteza sondy oraz wyniki tych badań zostały opublikowane w innych miejscach16-18.

<table><tbody><tr><td>Tris(2-karboksetylo)fosfina (TCEP)</td><td>Life Technologies</td><td>20490</td><td>Spraw, aby dzień użytkowania był świeży. Przygotuj 100 mM zapasu w wodzie z 4 eq NaOH.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]amina (TBTA)</td><td>AnaSpec</td><td>63360-50&nbsp;</td><td>Przygotuj 1,7 mM zapas w proporcji 4:1 t-butanolu do DMSO, przechowuj w temperaturze -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (CuSO4&#8226; 5H2O)</td><td>LabChem, Inc.</td><td>LC13440-1</td><td>Przygotuj 50 mM bulionu w wodzie, przechowuj w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Biotyno-azydek</td><td>Kliknij Narzędzia chemiczne</td><td>AZ104-100</td><td>Przygotuj 10 mM zapasu w DMSO, przechowuj w temperaturze -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-azydek&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10277</td><td>Przygotuj 1 mM zapasu w DMSO, przechowuj w temperaturze -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Lampa UV 365 nm</td><td>Spectroline</td><td>FC100</td><td>Okulary blokujące promieniowanie UV powinny być noszone podczas pracy.</td></tr><tr><td>Tabletki z inhibitorem proteazy, wolne od EDTA</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>Przygotuj 50x roztwór w wodzie i przechowuj w temperaturze -20&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>Sonifier 250</td><td>Ustawiony na wyjście 1, praca 30%.&nbsp;</td></tr><tr><td>Skaner fluorescencyjny żelowy</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>FLA 9500</td><td>Użyj czerwonego lasera do wykrywania Alexa-fluor 647.</td></tr><tr><td>Kompatybilny z detergentem zestaw do oznaczania białka Dc</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna o dużej pojemności Koraliki agarozowe&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium, niski poziom glukozy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>roztwór penicyliny/streptomycyny</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Scharakterystyka (2x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2676</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identyfikacja molekularnych celów małych cząsteczek jest trudnym, ale koniecznym krokiem w kierunku zrozumienia ich mechanizmu działania. Chociaż opracowano i wykorzystano kilka metod identyfikacji celów, aby skutecznie wyjaśnić białka wiążące różne małe cząsteczki, techniki te mają wady, które sprawiają, że nie nadają się do wykrywania niektórych typów interakcji małych cząsteczek z celem. W szczególności interakcje niekowalencyjne, które zależą od natywnych warunków komórkowych, takie jak te białek błonowych, których struktury mogą być zaburzone podczas lizy komórki, często nie są podatne na metody identyfikacji docelowej oparte na powinowactwie. Tutaj demonstrujemy metodę, w której sonda zawierająca grupę fotolabilną jest używana do kowalencyjnego sieciowania z białkiem wiążącym małą cząsteczkę w środowisku żywej komórki, umożliwiając wykrycie i izolację białka docelowego bez konieczności utrzymywania interakcji po lizie komórki. Technika ta jest cennym narzędziem do badania interesujących biologicznie małych cząsteczek o nieznanych mechanizmach, zarówno w kontekście biologii podstawowej, jak i odkrywania leków.

Przedstawione tutaj wyniki uzyskano przy użyciu sondy foto-powinowactwa leku przeciwgrzybiczego itrakonazolu, której zastosowanie zostało opublikowane wcześniej16. Wyniki te demonstrują wykorzystanie techniki znakowania foto-powinowactwa w żywych komórkach do skutecznej identyfikacji głównego białka wiążącego itrakonazol, którym jest 35 kDa białko błonowe Voltage-Dependent Anion Channel 1 (VDAC1).
Powyższy protokół pr...

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki przy użyciu sondy fotoafinitywnej, która może wiązać się z celem w żywych komórkach, umożliwiając późniejszą izolację i identyfikację tego celu. Metoda ta może być wykorzystana do wyjaśnienia molekularnego mechanizmu działania leków lub innych małych cząsteczek. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i kowalencyjne znakowanie białek docelowych zachodzi w natywnym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko naruszenia natywnej struktury białek i warunków wiązania podczas lizy komórek.Rozpocznij tę procedurę od przygotowania sterylnych sześciocentymetrowych naczyń do hodowli komórkowych w liczbie odpowiadającej pożądanej liczbie próbek. Zazwyczaj jedna szalka z komórkami jest wykorzystywana dla jednego stanu traktowania. Na potrzeby tej demonstracji przygotowane zostaną trzy szalki z komórkami: kontrola negatywna z samym DMSO, oznaczona jako D, traktowanie samą sondą, oznaczone jako P, oraz traktowanie sondą z konkurem, oznaczone jako C. Do każdego naczynia dodaj 3,5 miliona komórek HEK 293 T w czterech mililitrach pożywki hodowlanej.Inkubować komórki przez noc. Przed podaniem leków przygotować odpowiednie porcje substancji w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. W przypadku wstępnej inkubacji z inhibitorem konkurencyjnym, do dwóch probówek dodać po 4 µL DMSO, a do jednej probówki dodać 4 µL inhibitora konkurencyjnego o stężeniu 10 mM.W celu przygotowania traktowania sondą, do jednej probówki dodaj 16 µL DMSO, a do dwóch pozostałych probówek po 16 µL sondy fotoafinitycznej o stężeniu 15 µM. Przenieś naczynia z hodowlą komórkową do komory z laminarnym przepływem powietrza, aby dodać wcześniej odmierzone leki. Odsącz 1 mL pożywki hodowlanej z naczynia przeznaczonego do traktowania konkurencyjnego, przenieś ją do probówki do mikrowirówki zawierającej wcześniej odmierzony konkurent i resuspenduj lek w pożywce.Powoli dodaj kroplami mieszaninę pożywki i leku z powrotem do szalki. W ten sam sposób dodaj DMSO zarówno do szalki kontroli negatywnej, jak i do szalki z sondą. Włóż szalki z powrotem do inkubatora na 30 minut.Po 30 minutach przenieś naczynia z powrotem do dygestorium i przyciemnij światła. Do naczynia z kontrolą negatywną dodaj wcześniej odmierzone DMSO, a do naczyń z próbą (probe) i konkurencją (competition) dodaj odpowiednie sondy. Wstaw naczynia z powrotem do inkubatora na jedną godzinę.Po godzinie należy umieścić płytki na lodzie. Komórki w każdej płytce należy delikatnie przemyć pięcioma mililitrami lodowatego PBS, aby usunąć nadmiar sondy. Następnie należy ponownie przykryć komórki czterema mililitrami lodowatego PBS.Umieść naczynie z komórkami, wycentrowane trzy centymetry pod lampą UV na wkładzie chłodzącym, aby zminimalizować nagrzewanie przez lampę, i naświetlaj przez trzy minuty. Wyjmij naczynie i umieść je na lodzie. W ten sposób naświetl wszystkie próbki.Po napromieniowaniu wszystkich próbek odessaj PBS z komórek i dodaj do każdej płytki 200 µL lodowatego PBS z inhibitorami proteaz. Oddziel komórki od płytki za pomocą gumowej skrobaczki i przenieś je do uprzednio oznakowanych probówek do mikrowirówki w lodzie. Dodaj SDS do każdej próbki do uzyskania stężenia końcowego 0,4%. Zlizuj komórki poprzez sonikację zawiesiny przez 10 impulsów, inkubację w lodzie przez jedną minutę, a następnie ponowną sonikację przez kolejne 10 impulsów.Gotuj próbki na bloku grzewczym ustawionym na 95 °C przez pięć minut, aby dokończyć lizę komórek i zdenaturować wszystkie białka. Po zmierzeniu stężenia białka w każdej próbce, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, znormalizuj stężenie białka do 2,5 mg/mL, dodając w razie potrzeby PBS o pH 8,5 z dodatkiem 0,4% SDS. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś 40 µL każdego lizatu komórkowego, przygotowanego w poprzednim segmencie, do nowej probówki do mikrocentryfugi.Dodaj następujące odczynniki w tej kolejności: 0,2 µL flour-azide, 0,58 µL TCEP oraz 3,38 µL TBTA. Wymieszaj na wstrząsarce typu vortex. Dodaj 1,14 µL siarczanu miedzi(II) pięciowodzianu, aby rozpocząć reakcję.Krótko wymieszaj w wirułce i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Dodaj 50 µL buforu do próbek 2X SDS, aby zatrzymać reakcję. Rozdziel próbki w żelu SDS-PAGE; gdy front barwnika dotrze do końca żelu, kontynuuj elektroforezę przez dodatkowe pięć minut, aby upewnić się, że cały nadmiar niezareagowanego flour-azidu całkowicie opuścił żel.Po wypłukaniu nadmiaru fluorazydu, należy umieścić żel na szklanej płytce i zeskanować go za pomocą fluorescencyjnego skanera do żeli, zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku przyłączania znacznika biotyny należy użyć maksymalnej ilości lizatów komórkowych po normalizacji białek, tak aby wszystkie próbki miały taką samą objętość. Lizaty należy poddać wstępnemu oczyszczaniu (preclearing), dodając każdą próbkę do nowej probówki zawierającej 50 µL uprzednio wypłukanych wysokopojemnościowych kulek agarozy z streptawidyną.Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy jednoczesnym rotowaniu. Skupić kuleczki poprzez wirowanie. Przenieść nadsącz do nowej probówki do mikrowirowania umieszczonej na lodzie, a kuleczki odrzucić.Na każde 500 µL lizatu dodać następujące odczynniki: 1,38 µL biotyny-azydku, 5,5 µL TCEP oraz 32,5 µL TBTA. Wymieszać w wirówce wierzchołkowej (vortex). Dodać 11 µL pięciowodnego siarczanu miedzi na każde 500 µL lizatu i krótko wymieszać w wirówce wierzchołkowej.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodać cztery objętości próbki acetonu schłodzonego do 20 °C, wymieszać próbki na wortexie, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 80 °C, aby całkowicie wytrącić białka i usunąć niezwiązany azyd biotyny. Następnego dnia odwirować próbki przy 17 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia wytrąconych białek.Całkowicie odessaj supernatant, dodaj 150 µL PBS pH 7,4 i 1% SDS do każdej próbki, a następnie zresolubilizuj białka za pomocą sonikacji. Dodaj 600 µL PBS do każdej próbki, aby rozcieńczyć stężenie SDS do 0,2%, a następnie przenieś próbkę do nowej probówki zawierającej 30 µL uprzednio przemytych wysokowydajnych kulek agarozy ze streptawidyną. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C przy jednoczesnym obracaniu.Po godzinie odwiruj kuleczki przez wirowanie przy 1000 x g przez trzy minuty. Odessij i odrzuć supernatant zawierający niezwiązane białka. Dodaj do kuleczek jeden mililitr buforu do płukania i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy jednoczesnym rotowaniu.Odwiruj próbkę w wirówce, odlej supernatant i ponownie przemyj buforem do mycia. Po ostatnim przemyciu całkowicie odessać bufor do mycia z kulek i dodać 30 µL 2X buforu do próbek SDS. Inkubuj przez pięć minut w bloku grzewczym o temperaturze 95 °C, aby uwolnić białka z kulek.Odwiruj kuleczki przy 13000 x g w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Ostrożnie pobierz pipetą bufor z próbką zawierający białka zn zdjętych kuleczek do analizy SDS-PAGE. Wizualizacja białek po znakowaniu znacznikiem fluorescencyjnym jest przedstawiona na tym żelu zeskanowanym fluorescencyjnie.Główny prążek swoistego białka wiążącego, o masie około 35 kilodaltonów, występuje wyłącznie w ścieżce z sondą i zostaje wyparty przez nadmiar związku macierzystego. Ten sam prążek o masie 35 kilodaltonów zrównoważono za pomocą barwienia srebrem po wyciąganiu biotyny, a następnie zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas jako białko błonowe VDAC1. Tożsamość białka została dodatkowo potwierdzona z użyciem swoistego przeciwciała przeciwko VDAC1.Sygnał jest obecny w ścieżce z sondą i zmniejszony w ścieżce konkurencyjnej. Uwzględnienie frakcji wejściowej potwierdza, że przeciwciało działa, a białko zainteresowania może zostać wykryte w lizacie. Lekki wzrost masy cząsteczkowej w próbkach po wytrąceniu wynika z kowalencyjnie przyłączonej sondy.Przedstawiono konsekwencje nieprawidłowego wykonania poszczególnych etapów protokołu. Niepełne usunięcie nadmiaru azydku fluoresceinowego skutkuje powstaniem dużych czarnych smug w dolnej części żelu skanowanego fluorescencyjnie, natomiast niewystarczające oczyszczanie wstępne lizatów i/lub niedostateczne przemywanie kulek prowadzi do uzyskania żelu barwionego srebrem z bardzo wysokim tłem. Cały eksperyment pulldown trwa od dwóch do trzech dni.Po wyizolowaniu i zidentyfikowaniu białka docelowego za pomocą spektrometrii mas lub western blotingu, należy przeprowadzić dalsze eksperymenty walidacyjne specyficzne dla celu, aby ocenić istotność białka docelowego w kontekście fenotypu indukowanego lekiem.

identification-small-molecule-binding-proteins-native-cellular

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Systemy znakowania białek SNAP-tag i CLIP-tag umożliwiają specyficzne, kowalencyjne przyłączanie cząsteczek, w tym barwników fluorescencyjnych, do białka docelowego w żywych komórkach. Po sklonowaniu i ekspresji białko z tagiem może być stosowane z różnymi substratami w wielu dalszych zastosowaniach bez konieczności ponownego klonowania.

Fluorescencyjne znakowanie linii COS-7 wykazujących ekspresję białek fuzyjnych SNAP-tag w celu obrazowania żywych komórek

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Opisano nowatorską technikę wykrywania endogennych receptorów o niskiej liczebności obecnych w zarodkach danio pręgowanego. Nazwaliśmy go AFLIP, ponieważ polega na znakowaniu powinowactwa receptora przez jego ligand związany z immunoprecypitacją.

Oznaczanie powinowactwa Wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Udostępniamy krok po kroku protokół dla split-BioID, testu komplementacji fragmentów białek opartego na technice znakowania zbliżeniowego BioID. Aktywowany w wyniku interakcji dwóch podanych białek, umożliwia analizę proteomiczną zależnych od kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym. Metoda jest prosta, opłacalna i wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Split-BioID — Analiza proteomiczna specyficznych dla kontekstu kompleksów białkowych w ich natywnym środowisku komórkowym

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Protokół ten opisuje znakowanie pojedynczych przeciwciał (SAL) w celu rozwiązywania nanoskalowej organizacji przestrzennej białek błony plazmatycznej. Wykorzystując skumulowane interakcje przeciwciał-epitop na poziomie pojedynczych cząsteczek, błonowy SAL (mSAL) mapuje lokalne rozkłady epitopów, jednocześnie rejestrując zachowanie wiązania przeciwciał w natywnym środowisku komórkowym.

Mikroskopia lokalizacyjna pojedyncząsteczkowych białek błonowych z wykorzystaniem znakowania pojedynczych przeciwciał

Poznaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa w żywych komórkach HEK 293 T. Technika ta pozwala zachować natywną strukturę białek podczas badania mechanizmów działania leków.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Przeglądaj więcej filmów