Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki przy użyciu sondy fotoafinitywnej, która może wiązać się z celem w żywych komórkach, umożliwiając późniejszą izolację i identyfikację tego celu. Metoda ta może być wykorzystana do wyjaśnienia molekularnego mechanizmu działania leków lub innych małych cząsteczek. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i kowalencyjne znakowanie białek docelowych zachodzi w natywnym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko naruszenia natywnej struktury białek i warunków wiązania podczas lizy komórek.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania sterylnych sześciocentymetrowych naczyń do hodowli komórkowych w liczbie odpowiadającej pożądanej liczbie próbek. Zazwyczaj jedna szalka z komórkami jest wykorzystywana dla jednego stanu traktowania. Na potrzeby tej demonstracji przygotowane zostaną trzy szalki z komórkami: kontrola negatywna z samym DMSO, oznaczona jako D, traktowanie samą sondą, oznaczone jako P, oraz traktowanie sondą z konkurem, oznaczone jako C. Do każdego naczynia dodaj 3,5 miliona komórek HEK 293 T w czterech mililitrach pożywki hodowlanej.

Inkubować komórki przez noc. Przed podaniem leków przygotować odpowiednie porcje substancji w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. W przypadku wstępnej inkubacji z inhibitorem konkurencyjnym, do dwóch probówek dodać po 4 µL DMSO, a do jednej probówki dodać 4 µL inhibitora konkurencyjnego o stężeniu 10 mM.

W celu przygotowania traktowania sondą, do jednej probówki dodaj 16 µL DMSO, a do dwóch pozostałych probówek po 16 µL sondy fotoafinitycznej o stężeniu 15 µM. Przenieś naczynia z hodowlą komórkową do komory z laminarnym przepływem powietrza, aby dodać wcześniej odmierzone leki. Odsącz 1 mL pożywki hodowlanej z naczynia przeznaczonego do traktowania konkurencyjnego, przenieś ją do probówki do mikrowirówki zawierającej wcześniej odmierzony konkurent i resuspenduj lek w pożywce.

Powoli dodaj kroplami mieszaninę pożywki i leku z powrotem do szalki. W ten sam sposób dodaj DMSO zarówno do szalki kontroli negatywnej, jak i do szalki z sondą. Włóż szalki z powrotem do inkubatora na 30 minut.

Po 30 minutach przenieś naczynia z powrotem do dygestorium i przyciemnij światła. Do naczynia z kontrolą negatywną dodaj wcześniej odmierzone DMSO, a do naczyń z próbą (probe) i konkurencją (competition) dodaj odpowiednie sondy. Wstaw naczynia z powrotem do inkubatora na jedną godzinę.

Po godzinie należy umieścić płytki na lodzie. Komórki w każdej płytce należy delikatnie przemyć pięcioma mililitrami lodowatego PBS, aby usunąć nadmiar sondy. Następnie należy ponownie przykryć komórki czterema mililitrami lodowatego PBS.

Umieść naczynie z komórkami, wycentrowane trzy centymetry pod lampą UV na wkładzie chłodzącym, aby zminimalizować nagrzewanie przez lampę, i naświetlaj przez trzy minuty. Wyjmij naczynie i umieść je na lodzie. W ten sposób naświetl wszystkie próbki.

Po napromieniowaniu wszystkich próbek odessaj PBS z komórek i dodaj do każdej płytki 200 µL lodowatego PBS z inhibitorami proteaz. Oddziel komórki od płytki za pomocą gumowej skrobaczki i przenieś je do uprzednio oznakowanych probówek do mikrowirówki w lodzie. Dodaj SDS do każdej próbki do uzyskania stężenia końcowego 0,4%. Zlizuj komórki poprzez sonikację zawiesiny przez 10 impulsów, inkubację w lodzie przez jedną minutę, a następnie ponowną sonikację przez kolejne 10 impulsów.

Gotuj próbki na bloku grzewczym ustawionym na 95 °C przez pięć minut, aby dokończyć lizę komórek i zdenaturować wszystkie białka. Po zmierzeniu stężenia białka w każdej próbce, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, znormalizuj stężenie białka do 2,5 mg/mL, dodając w razie potrzeby PBS o pH 8,5 z dodatkiem 0,4% SDS. Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś 40 µL każdego lizatu komórkowego, przygotowanego w poprzednim segmencie, do nowej probówki do mikrocentryfugi.

Dodaj następujące odczynniki w tej kolejności: 0,2 µL flour-azide, 0,58 µL TCEP oraz 3,38 µL TBTA. Wymieszaj na wstrząsarce typu vortex. Dodaj 1,14 µL siarczanu miedzi(II) pięciowodzianu, aby rozpocząć reakcję.

Krótko wymieszaj w wirułce i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Dodaj 50 µL buforu do próbek 2X SDS, aby zatrzymać reakcję. Rozdziel próbki w żelu SDS-PAGE; gdy front barwnika dotrze do końca żelu, kontynuuj elektroforezę przez dodatkowe pięć minut, aby upewnić się, że cały nadmiar niezareagowanego flour-azidu całkowicie opuścił żel.

Po wypłukaniu nadmiaru fluorazydu, należy umieścić żel na szklanej płytce i zeskanować go za pomocą fluorescencyjnego skanera do żeli, zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku przyłączania znacznika biotyny należy użyć maksymalnej ilości lizatów komórkowych po normalizacji białek, tak aby wszystkie próbki miały taką samą objętość. Lizaty należy poddać wstępnemu oczyszczaniu (preclearing), dodając każdą próbkę do nowej probówki zawierającej 50 µL uprzednio wypłukanych wysokopojemnościowych kulek agarozy z streptawidyną.

Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy jednoczesnym rotowaniu. Skupić kuleczki poprzez wirowanie. Przenieść nadsącz do nowej probówki do mikrowirowania umieszczonej na lodzie, a kuleczki odrzucić.

Na każde 500 µL lizatu dodać następujące odczynniki: 1,38 µL biotyny-azydku, 5,5 µL TCEP oraz 32,5 µL TBTA. Wymieszać w wirówce wierzchołkowej (vortex). Dodać 11 µL pięciowodnego siarczanu miedzi na każde 500 µL lizatu i krótko wymieszać w wirówce wierzchołkowej.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodać cztery objętości próbki acetonu schłodzonego do 20 °C, wymieszać próbki na wortexie, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 80 °C, aby całkowicie wytrącić białka i usunąć niezwiązany azyd biotyny. Następnego dnia odwirować próbki przy 17 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia wytrąconych białek.

Całkowicie odessaj supernatant, dodaj 150 µL PBS pH 7,4 i 1% SDS do każdej próbki, a następnie zresolubilizuj białka za pomocą sonikacji. Dodaj 600 µL PBS do każdej próbki, aby rozcieńczyć stężenie SDS do 0,2%, a następnie przenieś próbkę do nowej probówki zawierającej 30 µL uprzednio przemytych wysokowydajnych kulek agarozy ze streptawidyną. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C przy jednoczesnym obracaniu.

Po godzinie odwiruj kuleczki przez wirowanie przy 1000 x g przez trzy minuty. Odessij i odrzuć supernatant zawierający niezwiązane białka. Dodaj do kuleczek jeden mililitr buforu do płukania i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej przy jednoczesnym rotowaniu.

Odwiruj próbkę w wirówce, odlej supernatant i ponownie przemyj buforem do mycia. Po ostatnim przemyciu całkowicie odessać bufor do mycia z kulek i dodać 30 µL 2X buforu do próbek SDS. Inkubuj przez pięć minut w bloku grzewczym o temperaturze 95 °C, aby uwolnić białka z kulek.

Odwiruj kuleczki przy 13000 x g w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Ostrożnie pobierz pipetą bufor z próbką zawierający białka zn zdjętych kuleczek do analizy SDS-PAGE. Wizualizacja białek po znakowaniu znacznikiem fluorescencyjnym jest przedstawiona na tym żelu zeskanowanym fluorescencyjnie.

Główny prążek swoistego białka wiążącego, o masie około 35 kilodaltonów, występuje wyłącznie w ścieżce z sondą i zostaje wyparty przez nadmiar związku macierzystego. Ten sam prążek o masie 35 kilodaltonów zrównoważono za pomocą barwienia srebrem po wyciąganiu biotyny, a następnie zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas jako białko błonowe VDAC1. Tożsamość białka została dodatkowo potwierdzona z użyciem swoistego przeciwciała przeciwko VDAC1.

Sygnał jest obecny w ścieżce z sondą i zmniejszony w ścieżce konkurencyjnej. Uwzględnienie frakcji wejściowej potwierdza, że przeciwciało działa, a białko zainteresowania może zostać wykryte w lizacie. Lekki wzrost masy cząsteczkowej w próbkach po wytrąceniu wynika z kowalencyjnie przyłączonej sondy.

Przedstawiono konsekwencje nieprawidłowego wykonania poszczególnych etapów protokołu. Niepełne usunięcie nadmiaru azydku fluoresceinowego skutkuje powstaniem dużych czarnych smug w dolnej części żelu skanowanego fluorescencyjnie, natomiast niewystarczające oczyszczanie wstępne lizatów i/lub niedostateczne przemywanie kulek prowadzi do uzyskania żelu barwionego srebrem z bardzo wysokim tłem. Cały eksperyment pulldown trwa od dwóch do trzech dni.

Po wyizolowaniu i zidentyfikowaniu białka docelowego za pomocą spektrometrii mas lub western blotingu, należy przeprowadzić dalsze eksperymenty walidacyjne specyficzne dla celu, aby ocenić istotność białka docelowego w kontekście fenotypu indukowanego lekiem.