Test elektrochemiluminescencji do ilościowego oznaczania docelowych poziomów białka w lizacie mózgu

W celu ilościowego wykrywania określonego białka w lizacie mózgu myszy za pomocą elektrochemiluminescencji, ECL, testu immunologicznego, należy rozpocząć od płytki do testu wielodołkowego.

Studnie składają się z przewodzących elektrod roboczych i przeciwelektrod, które uzupełniają obwód elektryczny. Warstwa dielektryczna oddziela elektrody, poprawiając czułość testu.

Dodaj pierwotne mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko białku docelowemu do studzienek. Elektrody robocze, o większej zdolności wiązania, ułatwiają unieruchomienie na nich przeciwciał.

Inkubować z roztworem zawierającym białko, wiążąc się z pozostałymi powierzchniami wiążącymi studzienki, zmniejszając interferencję tła.

Dodaj lizat frakcji jądrowej mózgu myszy. Białko docelowe w lizacie wiąże się specyficznie z przeciwciałami monoklonalnymi.

Dodaj nieznakowane przeciwciała poliklonalne, rozpoznające i wiążące się z epitopami na białku, które jest związane z pierwszorzędowymi przeciwciałami monoklonalnymi na elektrodzie. Dodaj specyficzne przeciwciała drugorzędowe znakowane kompleksem rutenu, wiążące się z nieznakowanymi przeciwciałami. Dodać odpowiedni bufor zawierający środek powierzchniowo czynny — zapewniający odpowiednie środowisko wytwarzania ECL — oraz tripropyloaminę, TPA.

Umieścić płytkę wielodołkową w systemie detekcji ECL. Po przyłożeniu potencjału do elektrod kompleks rutenu związany z przeciwciałami ulega utlenieniu. W tym samym czasie TPA ulega utlenieniu i spontanicznie traci proton.

Powstały rodnik TPA redukuje utleniony kompleks rutenu do stanu wzbudzonego. Po relaksacji do stanu podstawowego, kompleks rutenu emituje foton wykryty przez fotodetektor.

Zmierzone natężenie światła jest reprezentatywne dla specyficznego stężenia białka w lizacie.

Wyjmij 96-dołkową płytkę z lodówki i usuń folię. Usunąć roztwór powlekający przeciwciała ze studzienek, wrzucając go do pojemnika na odpady. Następnie postukaj w talerz o ręcznik papierowy, aby usunąć pozostały roztwór.

Następnie dodaj 125 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej studzienki. Następnie ponownie uszczelnij płytkę folią samoprzylepną. Umieścić płytkę na orbitalnej wytrząsarce do mikropłytek, ustawionej na 800 obr./min i inkubować przez 90 minut w temperaturze pokojowej.

Rozmrozić na lodzie, jedną fiolkę roztworu podstawowego białka MeCP2 lub TAT-MeCP2, lizatów mózgu myszy i lizatów HDF. Rozcieńczyć podstawowy roztwór białka w czystych probówkach, jak opisano w Tabeli 2 manuskryptu.

Następnie rozcieńczyć próbki lizatu. W przypadku lizatów mózgu myszy użyj od 1 do 20 mikrogramów na 25 mikrolitrów buforu do lizy. W przypadku lizatu HDF dodać 0,25 do 1 mikrograma na 25 mikrolitrów buforu do lizy.

Po 90 minutach inkubacji 96-dołkowej płytki należy usunąć roztwór blokujący z dołków, wrzucając go do pojemnika na odpady. Następnie postukaj w talerz o ręcznik papierowy, aby usunąć pozostały roztwór. Następnie umyj płytkę 3 razy 150 mikrolitrami roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając.

Dodać 25 mikrolitrów wzorców i próbek do dołków 96-dołkowej płytki. Uszczelnij płytkę i inkubuj ją przez kolejne cztery godziny w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając z prędkością 800 obr./min.

Rozmrozić nieznakowane przeciwciało wykrywające, poliklonalne królicze anty-MeCP2, na lodzie. Używając roztworu rozcieńczalnika do oznaczania, rozcieńczyć przeciwciało w stosunku 1:6000. Gdy 96-dołkowa płytka zakończy inkubację na wytrząsarce, usunąć wzorce i próbki, wrzucając płytkę do pojemnika na odpady. Następnie postukaj w talerz o ręcznik papierowy, aby usunąć pozostały roztwór.

Umyj płytkę 3 razy 150 mikrolitrami roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając. Dodać 25 mikrolitrów nieznakowanego roztworu przeciwciała detekcyjnego do każdej studzienki za pomocą pipetera wielokanałowego. Uszczelnić płytkę i inkubować ją przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając przy 800 obr./min.

Pobrać specyficzne przeciwciało drugorzędowe z lodówki i umieścić je na lodzie. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w roztworze rozcieńczalnika do oznaczania i delikatnie wymieszać.

Aby usunąć wolne, nieoznakowane przeciwciało wykrywające z płytki 96-dołkowej, wrzuć je do pojemnika na odpady, a następnie postukaj w płytkę o ręcznik papierowy. Po 3-krotnym umyciu płytki, jak opisano wcześniej, dodać 25 mikrolitrów przeciwciała wtórnego do każdej studzienki za pomocą pipetora wielokanałowego. Uszczelnić płytkę i inkubować ją przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając przy 800 obr./min.

Usunąć wolne przeciwciało drugorzędowe, wrzucając je do pojemnika na odpady i stukając płytką w ręcznik papierowy, a następnie umyć płytkę trzy razy, jak opisano wcześniej.

Do każdego dołka płytki dodaj 150 mikrolitrów buforu do odczytu 1X Gold na bazie trisu ze środkiem powierzchniowo czynnym, zawierającym tripropyloaminę jako koreagent do wytwarzania światła.

Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, należy stosować techniki pipetowania odwrotnego. Umieść 96-dołkową płytkę na platformie mikropłytki z systemem detekcji elektrochemiluminescencji.

Korzystając z wbudowanej kamery CCD, natychmiast rozpocznij przechwytywanie danych. Rejestruj liczbę sygnałów, które odpowiadają względnym jednostkom światła i są wprost proporcjonalne do natężenia światła.