Name: Kwantyfikacja subkomórkowej aktywności ubikwityny-proteasomu w mózgu gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji aktywności ubikwityny-proteasomu w synaptycznych, cytoplazmatycznych i jądrowych frakcjach mózgu gryzoni. Protokół umożliwia porównania wewnątrzobiektowe i redukuje liczbę zwierząt potrzebnych do badań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze startowe z College of Agricultural and Life Sciences oraz College of Science at Virginia Tech. T.M. jest wspierany przez George Washington Carver Program w Virginia Tech.

<ol><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Akutsu, M., Dikic, I., Bremm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+chain+diversity+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin chain diversity at a glance.</a> Journal of Cell Science. 129 (5), 875-880 (2016).</li>
<li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (9), 679-690 (2008).</li>
<li>Erpapazoglou, Z., Walker, O., Haguenauer-Tsapis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+roles+of+k63-linked+ubiquitin+chains+in+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Versatile roles of k63-linked ubiquitin chains in trafficking.</a> Cells. 3 (4), 1027-1088 (2014).</li>
<li>Iwai, K., Fujita, H., Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ubiquitin+chains%3A+NF-kappaB+signalling%2C+cell+death+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear ubiquitin chains: NF-kappaB signalling, cell death and beyond.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 15 (8), 503-508 (2014).</li>
<li>Rieser, E., Cordier, S. M., Walczak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+ubiquitination%3A+a+newly+discovered+regulator+of+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Linear ubiquitination: a newly discovered regulator of cell signalling.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (2), 94-102 (2013).</li>
<li>Collins, G. A., Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Logic+of+the+26S+Proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Logic of the 26S Proteasome.</a> Cell. 169 (5), 792-806 (2017).</li>
<li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Molecular Immunology. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li>
<li>Ezhkova, E., Tansey, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasomal+ATPases+link+ubiquitylation+of+histone+H2B+to+methylation+of+histone+H3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteasomal ATPases link ubiquitylation of histone H2B to methylation of histone H3.</a> Molecular Cell. 13 (3), 435-442 (2004).</li>
<li>Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+system+as+a+critical+regulator+of+synaptic+plasticity+and+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome system as a critical regulator of synaptic plasticity and long-term memory formation.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 105, 107-116 (2013).</li>
<li>Hegde, A. N., Upadhya, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+pathway+in+health+and+disease+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome pathway in health and disease of the nervous system.</a> Trends in Neuroscience. 30 (11), 587-595 (2007).</li>
<li>Adori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+components+of+the+ubiquitin-proteasome+system+in+non-diseased+human+and+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of components of the ubiquitin-proteasome system in non-diseased human and rat brain.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 54 (2), 263-267 (2006).</li>
<li>Upadhya, S. C., Ding, L., Smith, T. K., Hegde, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+proteasome+activity+in+the+nucleus+and+the+synaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals.</a> Neurochemistry International. 48 (4), 296-305 (2006).</li>
<li>Enenkel, C., Lehmann, A., Kloetzel, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+proteasomes+implicates+a+major+location+of+protein+degradation+in+the+nuclear+envelope-ER+network+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of proteasomes implicates a major location of protein degradation in the nuclear envelope-ER network in yeast.</a> EMBO Journal. 17 (21), 6144-6154 (1998).</li>
<li>Jarome, T. J., Kwapis, J. L., Ruenzel, W. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII%2C+but+not+protein+kinase+A%2C+regulates+Rpt6+phosphorylation+and+proteasome+activity+during+the+formation+of+long-term+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CaMKII, but not protein kinase A, regulates Rpt6 phosphorylation and proteasome activity during the formation of long-term memories.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 7, 115(2013).</li>
<li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349(2011).</li>
<li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li>
<li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavior+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150(2013).</li>
<li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li>
<li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li>
<li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li>
<li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li>
<li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li>
<li>Dunah, A. W., Standaert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D1+receptor-dependent+trafficking+of+striatal+NMDA+glutamate+receptors+to+the+postsynaptic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine D1 receptor-dependent trafficking of striatal NMDA glutamate receptors to the postsynaptic membrane.</a> Journal of Neuroscience. 21 (15), 5546-5558 (2001).</li>
<li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li>
<li>Mengual, E., Arizti, P., Rodrigo, J., Gimenez-Amaya, J. M., Castano, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+distribution+and+electron+microscopic+subcellular+localization+of+the+proteasome+in+the+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical distribution and electron microscopic subcellular localization of the proteasome in the rat CNS.</a> Journal of Neuroscience. 16 (20), 6331-6341 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu demonstrujemy skuteczną metodę ilościowego określania zmian w aktywności ubikwityny-proteasomu w różnych przedziałach subkomórkowych u tego samego zwierzęcia. Obecnie większość prób pomiaru subkomórkowych zmian w aktywności układu ubikwityna-proteasom ogranicza się do jednego przedziału na próbkę, co skutkuje koniecznością powtórzenia eksperymentów. Prowadzi to do znacznych kosztów i utraty życia zwierząt. Nasz protokół łagodzi ten problem poprzez podział półkul, umożliwiając pobranie różnych frakcji komórk...

System ubikwityna-proteasom (UPS) to złożona sieć połączonych ze sobą struktur białkowych i ligaz, która kontroluje degradację większości krótkożyciowych białek w komórkach1. W tym systemie białka są oznaczane do degradacji lub innych procesów/losów komórkowych przez mały modyfikator ubikwitynę. Białko docelowe może nabywać 1-7 modyfikacji ubikwityny, które mogą łączyć się ze sobą w jednym z siedmiu miejsc lizyny (K) (K6, K11, K27, K29, K33, K48 i K63) lub N-końcowej metioniny (M1; znanej jako liniowa) w poprzedniej klasie ubikwityny2. Niektóre z tych znaczników poliubikwityny są specyficzne dla degradacji (K48)3, podczas gdy inne są w dużej mierze niezależne od procesu degradacji białka (M1)4,5,6. W związku z tym proces ubikwitynacji białek jest niezwykle złożony, a zdolność do ilościowego określenia zmian w określonym znaczniku poliubikwityny ma kluczowe znaczenie dla ostatecznego zrozumienia roli tej modyfikacji w funkcjonowaniu komórki. Badanie tego układu dodatkowo komplikuje fakt, że proteasom, który jest strukturą katalityczną klasy UPS<sup="xref">7, zarówno degraduje białka, jak i może być zaangażowany w inne procesy nieproteolityczne8,9. Nic więc dziwnego, że od czasu pierwszego odkrycia, normalna i nieprawidłowa aktywność ubikwityny-proteasomu jest zaangażowana w tworzenie pamięci długotrwałej i różne stany chorobowe, w tym wiele zaburzeń neurologicznych, neurodegeneracyjnych i psychiatrycznych10,11. W rezultacie, metody, które mogą skutecznie i wydajnie określić ilościowo aktywność UPS w mózgu, mają kluczowe znaczenie dla ostatecznego zrozumienia, w jaki sposób system ten jest rozregulowany w stanach chorobowych i ostatecznego opracowania opcji leczenia ukierunkowanego na funkcjonowanie ubikwityny i/lub proteasomu.
Istnieje wiele problemów w ilościowym określaniu aktywności ubikwityny-proteasomu w tkance mózgowej szczurów i myszy, które są najczęstszymi systemami modelowymi używanymi do badania funkcji UPS, w tym 1) różnorodność modyfikacji ubikwityny, oraz 2) dystrybucja i różnicowa regulacja funkcjonowania UPS w przedziałach subkomórkowych12,13,14. Na przykład, wiele wczesnych demonstracji funkcji ubikwityny i proteasomu w mózgu podczas tworzenia pamięci wykorzystywało lizaty całych komórek i wskazywało na zależny od czasu wzrost zarówno ubikwitynacji białek, jak i aktywności proteasomów15,16,17,18,19,20. Jednak niedawno odkryliśmy, że aktywność ubikwityny-proteasomu różniła się znacznie w przedziałach subkomórkowych w odpowiedzi na uczenie się, z jednoczesnym wzrostem w niektórych regionach i spadkiem w innych, wzorzec, który znacznie różni się od tego, co wcześniej zgłaszano w lizatach całych komórek21. Jest to zgodne z ograniczeniem podejścia obejmującego całą komórkę, ponieważ nie może ono dysocjować wkładu zmian w aktywności UPS w różnych przedziałach subkomórkowych. Chociaż nowsze badania wykorzystały protokoły frakcji synaptycznej do zbadania UPS w szczególności w synapsach w odpowiedzi na uczenie się22,23,24, zastosowane metody uniemożliwiają pomiar zmian jądrowych i cytoplazmatycznych ubikwityny-proteasomu u tego samego zwierzęcia. Powoduje to niepotrzebną konieczność wielokrotnego powtarzania eksperymentów, zbierając w każdym z nich inną frakcję subkomórkową. Powoduje to nie tylko większą utratę życia zwierząt, ale także eliminuje możliwość bezpośredniego porównywania aktywności UPS w różnych przedziałach subkomórkowych w odpowiedzi na dane zdarzenie lub podczas określonego stanu chorobowego. Biorąc pod uwagę, że cele białkowe ubikwityny i proteasomu różnią się znacznie w całej komórce, zrozumienie, w jaki sposób sygnalizacja ubikwityna-proteasom różni się w odrębnych przedziałach subkomórkowych, ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji funkcjonalnej roli UPS w mózgu podczas tworzenia pamięci i zaburzeń neurologicznych, neurodegeneracyjnych i psychiatrycznych.
Aby zaspokoić tę potrzebę, niedawno opracowaliśmy procedurę, w której frakcje jądrowe, cytoplazmatyczne i synaptyczne mogą być pobierane dla danego regionu mózgu od tego samego zwierzęcia21. Dodatkowo, aby uwzględnić ograniczoną ilość białka, którą można uzyskać z zebrania wielu frakcji subkomórkowych z tej samej próbki, zoptymalizowaliśmy wcześniej ustalone protokoły do oznaczania in vitro aktywności proteasomu i ubikwitynacji białek specyficznych dla wiązania w lizowanych komórkach pobranych z tkanki mózgowej gryzoni. Korzystając z tego protokołu, byliśmy w stanie zebrać i bezpośrednio porównać zależne od uczenia się zmiany w aktywności proteasomu, K48, K63, M1 i ogólnych poziomach poliubikwitynacji białek w jądrze i cytoplazmie oraz w synapsach w bocznym ciele migdałowatym szczurów. W tym miejscu szczegółowo opisujemy naszą procedurę (Rysunek 1), która może znacznie poprawić naszą wiedzę na temat tego, w jaki sposób UPS jest zaangażowany w tworzenie pamięci długotrwałej i różne stany chorobowe. Należy jednak zauważyć, że aktywność proteasomu in vitro omówiona w naszym protokole, choć szeroko stosowana, nie mierzy bezpośrednio aktywności kompletnych kompleksów proteasomów 26S. Test ten mierzy raczej aktywność rdzenia 20S, co oznacza, że może służyć jedynie jako wskaźnik zastępczy do zrozumienia aktywności samego rdzenia, w przeciwieństwie do całego kompleksu proteasomu 26S.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Fisher</td><td>15575020</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Zestaw do aktywności proteasomu 20S</td><td>Millipore Sigma</td><td>APT280</td><td>Inni dostawcy oferują różne wersje</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher</td><td>FERR1441</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Przeciwciało beta-aktyny</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4967S</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Komórka przeciwciała beta-tubuliny</td><td> sygnalizacja</td><td>2128T</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Czytnik płytek BioTek Synergy H1</td><td>BioTek</td><td>VATECHH1MT3</td><td>Inni dostawcy oferują różne wersje</td></tr><tr><td>B-merkaptoetanol</td><td>Fisher</td><td>ICN19024280</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Clasto laktacystyna b-lakton</td><td>Millipore Sigma</td><td>L7035</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Kubek kriogeniczny</td><td>Fisher</td><td>033377B</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>DMSO</td><td>D8418</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Millipore Sigma</td><td>D0632</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5516</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Przeciwciało H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Fisher</td><td>SA48</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>IGEPAL (NP-40)</td><td>Millipore Sigma</td><td>I3021</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>K48 Przeciwciało ubikwityny</td><td>Abcam</td><td>ab140601</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>K63 Ubikwityna Przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab179434</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9541</td><td>Różne inni dostawcy</td></tr><tr><td>Młynek do tkanek KONTES</td><td>VWR</td><td>KT885300-0002</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Bufor do próbek Laemmli</td><td>Bio-rad</td><td>161-0737</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr>Liniowe <td>czujniki żywotności</td><td>przeciwciał ubikwityny</td><td>AB-0130-0100</td><td>Tylko przeciwciało M1</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>442611</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>2231000213</td><td>Różni inni producenci/modele</td></tr><tr><td>myr-AIP</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-P212-0500</td><td>Przenoszone przez Millipore-Sigma</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3014</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>System obrazowania Odyssey Fc</td><td>LiCor</td><td>2800-02</td><td>Inni dostawcy oferują różne wersje</td></tr><tr><td>Inhibitor fosfatazy</td><td>Millipore Sigma</td><td>524625</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard</td><td>Bio-rad</td><td>161-0373</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8340</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Przeciwciało PSD95</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>3450T</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3771</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher</td><td>SS255</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0389</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>TBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62938</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-100</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr><tr><td>Ubikwityna Przeciwciało</td><td>Enzo Nauki przyrodnicze</td><td>BML-PW8810</td><td>Różni inni dostawcy</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja subkomórkowej aktywności ubikwityny-proteasomu w mózgu gryzoni

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

System ubikwityna-proteasom jest kluczowym regulatorem degradacji białek i wielu innych procesów komórkowych u eukariontów. W mózgu wzrost aktywności ubikwityny-proteasomu ma kluczowe znaczenie dla plastyczności synaptycznej i tworzenia pamięci, a nieprawidłowe zmiany w tym systemie są związane z różnymi zaburzeniami neurologicznymi, neurodegeneracyjnymi i psychiatrycznymi. Jednym z problemów w badaniu funkcjonowania ubikwityny-proteasomu w mózgu jest to, że jest on obecny we wszystkich przedziałach komórkowych, w których cele białkowe, rola funkcjonalna i mechanizmy regulacji mogą się znacznie różnić. W rezultacie, możliwość bezpośredniego porównania ukierunkowania na białko ubikwityny w mózgu i aktywności katalitycznej proteasomu w różnych przedziałach subkomórkowych u tego samego zwierzęcia ma kluczowe znaczenie dla pełnego zrozumienia, w jaki sposób UPS przyczynia się do plastyczności synaptycznej, pamięci i choroby. Opisana tutaj metoda pozwala na pobranie jądrowych, cytoplazmatycznych i surowych frakcji synaptycznych z tego samego mózgu gryzonia (szczura), a następnie jednoczesne określenie ilościowe aktywności katalitycznej proteasomu (pośrednio, zapewniając aktywność tylko rdzenia proteasomu) i znakowanie białka ubikwityny specyficzne dla wiązania. W związku z tym metoda ta może być wykorzystana do bezpośredniego porównania subkomórkowych zmian w aktywności ubikwityny-proteasomu w różnych regionach mózgu u tego samego zwierzęcia podczas plastyczności synaptycznej, tworzenia pamięci i różnych stanów chorobowych. Metoda ta może być również stosowana do oceny subkomórkowej dystrybucji i funkcji innych białek w tym samym zwierzęciu.

Stosując opisaną tutaj procedurę, pobrano frakcje jądrowe, cytoplazmatyczne i synaptyczne z bocznego jądra ciała migdałowatego mózgu szczura (Rysunek 1). Czystość poszczególnych frakcji potwierdzono za pomocą techniki Western blotting, wykorzystując przeciwciała przeciwko białkom, których stężenie powinno być podwyższone lub obniżone w danym lizacie. W pierwszej półkuli, z której pobrano surową frakcję synaptyczną, białko gęstości postsynaptycznej 95 (PSD95) ...

Ten protokół ma na celu efektywne ilościowe określanie aktywności systemu ubikwityna-proteasom (UPS) w różnych przedziałach komórkowych mózgu gryzoni. Użytkownicy mogą badać działanie UPS we frakcjach jądrowych, cytoplazmatycznych i synaptycznych u tego samego zwierzęcia, co skraca czas i liczbę zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia tych złożonych analiz.

Kwantyfikacja subkomórkowej aktywności ubikwityny-proteasomu w mózgu gryzoni

The ubiquitin-proteasome system is a key regulator of protein degradation and a variety of other cellular processes in eukaryotes. In the brain, increases ...

Protokół ten mierzy poziomy ubikwitynacji białek subkomórkowych i aktywność proteasomu w mózgu gryzoni, umożliwiając badanym porównanie, jak zmienia się aktywność ubikwityny-proteasomu w odpowiedzi na aktywność komórkową, uczenie się lub chorobę. Protokół umożliwia pobieranie frakcji synaptycznych, cytoplazmatycznych i jądrowych z tego samego mózgu gryzonia. Minimalizując straty, można to zrobić przy użyciu małych ilości tkanek i podstawowego sprzętu laboratoryjnego.Procedurę zademonstruje Taylor McFadden, doktorant z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od pobrania i wypreparowania tkanki mózgowej gryzonia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Upewnij się, że użyta półkula jest zrównoważona w różnych warunkach ekstrakcji dla każdej grupy eksperymentalnej.Wyjmij 1,5-mililitrową mikroprobówkę wirówkową zawierającą jedną półkulę obszaru zainteresowania z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Za pomocą skalpela przenieś zamrożoną tkankę mózgową do dwumililitrowego szklanego homogenizatora teflonowego. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy do probówki teflonowej.Za pomocą tłuczka B homogenizuj tę samą tkankę za pomocą 15 pociągnięć, aż nie będzie widocznej ilości materiału stałego. Używaj ruchu obrotowego podczas każdego pociągnięcia. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów przenieś homogenizowaną próbkę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.Umieść probówkę na mokrym lodzie i inkubuj przez 30 minut. Umieść probówkę w mikrowirówce i wiruj przez 10 minut w temperaturze 845 razy g w czterech stopniach Celsjusza. Po zakończeniu ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie i umieścić w nowej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.To jest frakcja cytoplazmatyczna. Dodać 50 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do powstałego osadu i ponownie zawiesić przez pipetowanie. Nie wirować granulki.Umieścić probówkę zawierającą zawieszony osad na lodzie i inkubować przez 30 minut. Następnie odwirować probówkę przez 20 minut w temperaturze 21 456 razy g w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipetowania i umieścić w nowej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.To jest frakcja jądrowa. Homogenizuj jedną półkulę obszaru zainteresowania, tak jak poprzednio, z wyjątkiem użycia 500 mikrolitrów buforu TEVP zamiast buforu do lizy. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów przenieś homogenizowaną próbkę do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.Odwirować próbkę o masie 1 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Odwirować próbkę o masie 10 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wyrzuć oryginalną osadkę, która zawiera jądra i duże szczątki. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. To jest frakcja cytozolowa.Dodać 50 mikrolitrów buforu homogenizacyjnego do osadu i zawiesić ponownie przez pipetowanie, aż nie będzie widoczny żaden materiał stały. Odwirować próbkę w temperaturze 20 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.Jest to surowa frakcja błony synaptosomalnej. Aby skonfigurować test, rozgrzej czytnik płytek do 37 stopni Celsjusza i przytrzymaj przez cały przebieg. Ustaw wzbudzenie na 360 nanometrów, a emisję na 460 nanometrów.Jeśli użyta płytka 96-dołkowa jest przezroczysta, ustaw optykę w pozycji dolnej. Jeśli używana jest ciemna płytka 96-dołkowa, ustaw pozycję optyki na górę. Zaprogramuj bieg kinetyczny z czasem skanowania dwóch godzin co 30 minut.Rozpuść bufor testowy 20S 10X dostarczony w zestawie z 13,5 mililitrami ultraczystej wody. Dodaj 14 mikrolitrów 100 milimolowego ATP do teraz bufora 1X. To znacznie zwiększa aktywność proteasomu w próbkach i poprawia wiarygodność testu.Rozpuść wzorzec AMC dostarczony w zestawie za pomocą 100 mikrolitrów DMSO. Wykonuj czynności przy użyciu standardu AMC w ciemności lub przy słabym oświetleniu, ponieważ standard jest wrażliwy na światło. Utwórz standardową krzywą AMC z serii wysokich i niskich stężeń AMC.Krzywa ta zostanie wykorzystana do kalibracji czytnika płytek i analizy aktywności proteasomu w homogenizowanych próbkach. Rozpuść subtrat proteasomu dostarczony w zestawie z 65 mikrolitrami DMSO. Wykonaj ten krok również w ciemności lub przy słabym oświetleniu, ponieważ podłoże jest wrażliwe na światło.Następnie utwórz rozcieńczenie substratu proteasomu od jednego do 20 w nowej 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej za pomocą buforu testowego 20S. Dodaj znormalizowaną ilość żądanych próbek do płytki 96-dołkowej. Uruchom każdą próbkę w dwóch egzemplarzach.Ilość potrzebnej próbki różni się w zależności od przygotowania tkanki. Ogólnie rzecz biorąc, 10 do 20 mikrogramów jest wystarczające dla każdej frakcji subkomórkowej. Doprowadzić objętość studzienki próbki do 80 mikrolitrów za pomocą ultraczystej wody.Dodana ilość zależy od objętości dodanej próbki. W dwóch oddzielnych studzienkach dodaj 80 mikrolitrów samej wody. Będą to ślepe próby testowe.Dodaj 10 mikrolitrów buforu testowego 20S do każdej studzienki, w tym ślepych prób testowych. Użyj repeatera lub automatycznej pipety, aby zapewnić stałą objętość testu we wszystkich studzienkach. Wyłącz światła lub wejdź do ciemnego pokoju.Dodaj wszystkie 100 mikrolitrów rozcieńczonych wzorców AMC do nowej studzienki, używając jednego dołka dla każdego wzorca. W ciemności użyj repeatera lub automatycznej pipety, aby dodać 10 mikrolitrów rozcieńczonego substratu proteasomu do studzienek zawierających ślepe próby próbki i testy, ale nie wzorzec AMC. Umieść płytkę w czytniku płytek i rozpocznij bieg kinetyczny.Przeprowadzić kwantyfikację różnych znaczników poliubikwityny w różnych frakcjach subkomórkowych pobranych z tkanki mózgowej gryzoni przy użyciu różnych standardowych protokołów Western blot w połączeniu z unikalnymi przeciwciałami poliubikwityny specyficznymi dla wiązania. Niektóre obrazy wszechobecnej Western blot będą zawierać kolumny z wyraźnymi pasmami, podczas gdy inne tworzą wzór podobny do rozmazu z kilkoma lub żadnymi wyraźnymi liniami. W celu ilościowego określenia obrazowanych zachodnich plam ubikwityny, narysuj ramkę wokół kolumny, która rozciąga całą drabinę wzorców molekularnych.Wyreguluj pudełko, jeśli barwienie ubikwityną rozciąga się na całą drabinę. Jest to powszechne w przypadku modyfikacji lizyny 48 i różni się znacznie w zależności od przedziałów subkomórkowych. Na koniec odejmij tło, które jest obliczane jako średnia gęstość optyczna tła bezpośrednio otaczającego kolumnę ze wszystkich stron.Pokazano tutaj kwantację aktywności proteasomu w różnych frakcjach pobranych z bocznego ciała migdałowatego tego samego zwierzęcia. Podczas badania aktywności proteasomu in vitro wykryte względne jednostki fluorescencyjne wzrosły od początku do końca testu we frakcji synaptycznej, frakcji cytoplazmatycznej i frakcji jądrowej. Inhibitor proteasomu beta-lac zapobiegał zmianie RFU w trakcie sesji.Zaobserwowano subkomórkowe różnice w aktywności proteasomu w bocznym ciele migdałowatym tego samego zwierzęcia. U wyszkolonych zwierząt wykryto wzrost aktywności proteasomu jądrowego w porównaniu z grupą kontrolną, co odpowiadało spadkowi aktywności we frakcji synaptycznej. Aktywność proteasomu cytoplazmatycznego pozostała na poziomie wyjściowym.Pokazano tutaj subkomórkowe różnice w ubikwitynacji białek specyficznych dla wiązania w bocznym ciele migdałowatym tego samego zwierzęcia po uczeniu się. Po poznaniu nastąpił wzrost ogólnej ubikwitynacji frakcji jądrowej, który korelował ze spadkiem frakcji cytoplazmatycznej. Po nauczeniu się, liniowa ubikwitynacja wzrosła we frakcji jądrowej, ale nie we frakcjach cytoplazmatycznych lub synaptycznych.Co ciekawe, ubikwitynacja K63 wzrosła we frakcji jądrowej po nauczeniu się, co korelowało ze spadkiem frakcji synaptycznej. Natomiast unikwitynacja K48 zwiększyła się we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych po uczeniu się, ale nie we frakcji synaptycznej. Protokół ten może być również wykorzystany do zrozumienia subkomórkowej dystrybucji i funkcji innych białek w tym samym zwierzęciu.

quantifying-subcellular-ubiquitin-proteasome-activity-rodent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film pokazuje, jak mierzyć aktywność proteasomu w różnych subkomórkowych przedziałach bocznego ciała migdałowatego z mózgów szczurów kondycjonowanych strachem i kontrolnych za pomocą testu peptydów fluorogennych. Proteasom rozszczepia substrat peptydu fluorogenicznego, uwalniając cząsteczki fluorescencyjne, które są oznaczane ilościowo za pomocą czytnika płytek w celu oceny aktywności proteasomu we frakcjach białek jądrowych i synaptycznych. Zwiększona aktywność jądrowa sugeruje zmiany w...

Pomiar aktywności proteasomu w różnych subkomórkowych przedziałach mózgu szczura

Source: Kimmelmann-Shultz, B., et. al. Używanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni.J. Vis. Exp. (2019) Ten film demonstruje metodę fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzonia.

Pomiar ekspresji białek w mózgu gryzoni za pomocą fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości 

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

Synteza białek jest krytycznym procesem biologicznym dla komórek. W mózgu jest niezbędna do zmian adaptacyjnych. Pomiar tempa syntezy białek w nienaruszonym mózgu wymaga starannych rozważań metodologicznych. W tym artykule przedstawiono ilościową metodę autoradiograficzną L-[1-14C]-leucyny do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek mózgowych in vivo.

Ilościowa metoda autoradiograficzna do oznaczania regionalnych szybkości syntezy białek mózgowych in vivo

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Ten protokół wyjaśnia, jak mierzyć wpływ zmienności genetycznej związanej z zaburzeniami neurorozwojowymi na aktywność enzymu deubikwitylizującego, łącząc oczyszczanie rekombinowanych białek z testami rozszczepienia łańcucha ubikwityny.

Pomiar aktywności enzymatycznej enzymów deubikwitytylacyjnych związanych z zaburzeniami neurorozwojowymi za pomocą testu rozszczepienia łańcucha ubikwityny in vitro

Poznaj metodę kwantyfikacji aktywności ubikwityny-proteasomu w synaptycznych, cytoplazmatycznych i jądrowych frakcjach mózgu gryzoni. Protokół umożliwia porównania wewnątrzobiektowe i redukuje liczbę zwierząt potrzebnych do badań.

Kwantyfikacja subkomórkowej aktywności ubikwityny-proteasomu w mózgu gryzoni

Przeglądaj więcej filmów