Kwantyfikacja subkomórkowej aktywności ubikwityny-proteasomu w mózgu gryzoni

Protokół ten mierzy poziomy ubikwitynacji białek subkomórkowych i aktywność proteasomu w mózgu gryzoni, umożliwiając badanym porównanie, jak zmienia się aktywność ubikwityny-proteasomu w odpowiedzi na aktywność komórkową, uczenie się lub chorobę. Protokół umożliwia pobieranie frakcji synaptycznych, cytoplazmatycznych i jądrowych z tego samego mózgu gryzonia. Minimalizując straty, można to zrobić przy użyciu małych ilości tkanek i podstawowego sprzętu laboratoryjnego.

Procedurę zademonstruje Taylor McFadden, doktorant z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od pobrania i wypreparowania tkanki mózgowej gryzonia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Upewnij się, że użyta półkula jest zrównoważona w różnych warunkach ekstrakcji dla każdej grupy eksperymentalnej.

Wyjmij 1,5-mililitrową mikroprobówkę wirówkową zawierającą jedną półkulę obszaru zainteresowania z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Za pomocą skalpela przenieś zamrożoną tkankę mózgową do dwumililitrowego szklanego homogenizatora teflonowego. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy do probówki teflonowej.

Za pomocą tłuczka B homogenizuj tę samą tkankę za pomocą 15 pociągnięć, aż nie będzie widocznej ilości materiału stałego. Używaj ruchu obrotowego podczas każdego pociągnięcia. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów przenieś homogenizowaną próbkę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra.

Umieść probówkę na mokrym lodzie i inkubuj przez 30 minut. Umieść probówkę w mikrowirówce i wiruj przez 10 minut w temperaturze 845 razy g w czterech stopniach Celsjusza. Po zakończeniu ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie i umieścić w nowej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.

To jest frakcja cytoplazmatyczna. Dodać 50 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do powstałego osadu i ponownie zawiesić przez pipetowanie. Nie wirować granulki.

Umieścić probówkę zawierającą zawieszony osad na lodzie i inkubować przez 30 minut. Następnie odwirować probówkę przez 20 minut w temperaturze 21 456 razy g w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipetowania i umieścić w nowej 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.

To jest frakcja jądrowa. Homogenizuj jedną półkulę obszaru zainteresowania, tak jak poprzednio, z wyjątkiem użycia 500 mikrolitrów buforu TEVP zamiast buforu do lizy. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów przenieś homogenizowaną próbkę do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.

Odwirować próbkę o masie 1 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant i przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Odwirować próbkę o masie 10 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wyrzuć oryginalną osadkę, która zawiera jądra i duże szczątki. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. To jest frakcja cytozolowa.

Dodać 50 mikrolitrów buforu homogenizacyjnego do osadu i zawiesić ponownie przez pipetowanie, aż nie będzie widoczny żaden materiał stały. Odwirować próbkę w temperaturze 20 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra.

Jest to surowa frakcja błony synaptosomalnej. Aby skonfigurować test, rozgrzej czytnik płytek do 37 stopni Celsjusza i przytrzymaj przez cały przebieg. Ustaw wzbudzenie na 360 nanometrów, a emisję na 460 nanometrów.

Jeśli użyta płytka 96-dołkowa jest przezroczysta, ustaw optykę w pozycji dolnej. Jeśli używana jest ciemna płytka 96-dołkowa, ustaw pozycję optyki na górę. Zaprogramuj bieg kinetyczny z czasem skanowania dwóch godzin co 30 minut.

Rozpuść bufor testowy 20S 10X dostarczony w zestawie z 13,5 mililitrami ultraczystej wody. Dodaj 14 mikrolitrów 100 milimolowego ATP do teraz bufora 1X. To znacznie zwiększa aktywność proteasomu w próbkach i poprawia wiarygodność testu.

Rozpuść wzorzec AMC dostarczony w zestawie za pomocą 100 mikrolitrów DMSO. Wykonuj czynności przy użyciu standardu AMC w ciemności lub przy słabym oświetleniu, ponieważ standard jest wrażliwy na światło. Utwórz standardową krzywą AMC z serii wysokich i niskich stężeń AMC.

Krzywa ta zostanie wykorzystana do kalibracji czytnika płytek i analizy aktywności proteasomu w homogenizowanych próbkach. Rozpuść subtrat proteasomu dostarczony w zestawie z 65 mikrolitrami DMSO. Wykonaj ten krok również w ciemności lub przy słabym oświetleniu, ponieważ podłoże jest wrażliwe na światło.

Następnie utwórz rozcieńczenie substratu proteasomu od jednego do 20 w nowej 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej za pomocą buforu testowego 20S. Dodaj znormalizowaną ilość żądanych próbek do płytki 96-dołkowej. Uruchom każdą próbkę w dwóch egzemplarzach.

Ilość potrzebnej próbki różni się w zależności od przygotowania tkanki. Ogólnie rzecz biorąc, 10 do 20 mikrogramów jest wystarczające dla każdej frakcji subkomórkowej. Doprowadzić objętość studzienki próbki do 80 mikrolitrów za pomocą ultraczystej wody.

Dodana ilość zależy od objętości dodanej próbki. W dwóch oddzielnych studzienkach dodaj 80 mikrolitrów samej wody. Będą to ślepe próby testowe.

Dodaj 10 mikrolitrów buforu testowego 20S do każdej studzienki, w tym ślepych prób testowych. Użyj repeatera lub automatycznej pipety, aby zapewnić stałą objętość testu we wszystkich studzienkach. Wyłącz światła lub wejdź do ciemnego pokoju.

Dodaj wszystkie 100 mikrolitrów rozcieńczonych wzorców AMC do nowej studzienki, używając jednego dołka dla każdego wzorca. W ciemności użyj repeatera lub automatycznej pipety, aby dodać 10 mikrolitrów rozcieńczonego substratu proteasomu do studzienek zawierających ślepe próby próbki i testy, ale nie wzorzec AMC. Umieść płytkę w czytniku płytek i rozpocznij bieg kinetyczny.

Przeprowadzić kwantyfikację różnych znaczników poliubikwityny w różnych frakcjach subkomórkowych pobranych z tkanki mózgowej gryzoni przy użyciu różnych standardowych protokołów Western blot w połączeniu z unikalnymi przeciwciałami poliubikwityny specyficznymi dla wiązania. Niektóre obrazy wszechobecnej Western blot będą zawierać kolumny z wyraźnymi pasmami, podczas gdy inne tworzą wzór podobny do rozmazu z kilkoma lub żadnymi wyraźnymi liniami. W celu ilościowego określenia obrazowanych zachodnich plam ubikwityny, narysuj ramkę wokół kolumny, która rozciąga całą drabinę wzorców molekularnych.

Wyreguluj pudełko, jeśli barwienie ubikwityną rozciąga się na całą drabinę. Jest to powszechne w przypadku modyfikacji lizyny 48 i różni się znacznie w zależności od przedziałów subkomórkowych. Na koniec odejmij tło, które jest obliczane jako średnia gęstość optyczna tła bezpośrednio otaczającego kolumnę ze wszystkich stron.

Pokazano tutaj kwantację aktywności proteasomu w różnych frakcjach pobranych z bocznego ciała migdałowatego tego samego zwierzęcia. Podczas badania aktywności proteasomu in vitro wykryte względne jednostki fluorescencyjne wzrosły od początku do końca testu we frakcji synaptycznej, frakcji cytoplazmatycznej i frakcji jądrowej. Inhibitor proteasomu beta-lac zapobiegał zmianie RFU w trakcie sesji.

Zaobserwowano subkomórkowe różnice w aktywności proteasomu w bocznym ciele migdałowatym tego samego zwierzęcia. U wyszkolonych zwierząt wykryto wzrost aktywności proteasomu jądrowego w porównaniu z grupą kontrolną, co odpowiadało spadkowi aktywności we frakcji synaptycznej. Aktywność proteasomu cytoplazmatycznego pozostała na poziomie wyjściowym.

Pokazano tutaj subkomórkowe różnice w ubikwitynacji białek specyficznych dla wiązania w bocznym ciele migdałowatym tego samego zwierzęcia po uczeniu się. Po poznaniu nastąpił wzrost ogólnej ubikwitynacji frakcji jądrowej, który korelował ze spadkiem frakcji cytoplazmatycznej. Po nauczeniu się, liniowa ubikwitynacja wzrosła we frakcji jądrowej, ale nie we frakcjach cytoplazmatycznych lub synaptycznych.

Co ciekawe, ubikwitynacja K63 wzrosła we frakcji jądrowej po nauczeniu się, co korelowało ze spadkiem frakcji synaptycznej. Natomiast unikwitynacja K48 zwiększyła się we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych po uczeniu się, ale nie we frakcji synaptycznej. Protokół ten może być również wykorzystany do zrozumienia subkomórkowej dystrybucji i funkcji innych białek w tym samym zwierzęciu.