Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patologii nowotworów poprzez ilościowe określenie białek biomarkerowych z rutynowo przetwarzanego materiału biopsyjnego. Głównymi zaletami tej techniki w stosunku do konwencjonalnej immunohistochemii jest to, że jest obiektywna, ma szeroki zakres dynamiki i pozwala na ilościowe oznaczanie białek w określonych typach komórek. Obecność lub brak pewnych tak zwanych białek biomarkerowych, a w szczególności względna obfitość tych białek w próbkach biopsji nowotworu może być bardzo przydatna w postawieniu specyficznej diagnozy patologicznej określonych rodzajów nowotworów.

Ale może być również przydatna w przewidywaniu odpowiedzi na leczenie raka, dlatego ta technika jest istotna zarówno w diagnostyce, jak i leczeniu pacjentów z rakiem. Protokół ten dotyczy głównie sposobu wykorzystania kwantyfikacji białek w unieśmiertelnionych liniach komórkowych w celu walidacji ilościowego charakteru testu opartego na immunofluorescencji. Należy jednak zauważyć, że immunofluorescencję można łatwo włączyć do podejścia multipleksowego i zastosować do próbek z biopsji pierwotnej.

Asystować i demonstrować tę procedurę będą Lee Boudreau, technik, i Shakeel Virk, dyrektor operacyjny. Oba z Queen's Laboratory for Molecular Pathology. Na początek odwiruj wcześniej zebrane komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów o sile 225 G przez pięć minut.

Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach PBS. Następnie odwirować zawieszone komórki w temperaturze 225 g przez pięć minut. Zawieś osad komórkowy za pomocą 10 mililitrów 10% NBF.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej na rockerze z prędkością 24 obr./min przez noc. Po utrwaleniu komórek odwirować komórki w temperaturze 225 G przez pięć minut. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach PBS.

Przenieś komórki do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej i osadź komórki przez odwirowanie. Następnie odessać supernatant. Dodaj około 500 mikrolitrów 1% roztworu agarozy do każdej probówki zawierającej komórki.

Następnie odpipetuj mieszaninę w górę i w dół, aby wymieszać. Po stwardnieniu roztworu komórek agarozy dodaj jeden mililitr 10% NBF do probówek. Później usuń NBF z próbek.

Użyj żyletki, aby wyjąć zatyczkę komórkową i umieść zatyczkę w plastikowej kasecie na chusteczki. Przetwarzaj próbki przez noc za pomocą automatycznego procesora tkanek. Następnie zanurz próbki w wosku parafinowym, stosując standardowe metody histologiczne.

Za pomocą przyrządu do układania tkanek zbierz zduplikowane 6-milimetrowe rdzenie z bloku parafiny i włóż je do pustego bloku parafinowego. Następnie za pomocą mikrotomu przygotuj dwie sekcje histologiczne nowo utworzonej linii komórkowej, TMA. Następnie zamontuj skrawki na szkiełku histologicznym i odparafinowaj je.

Najpierw załaduj dwa szkiełka linii komórkowej TMA do automatycznego systemu barwienia. Zabarwić jedną stronę optymalnym rozcieńczeniem przeciwciał pierwotnych, pozostawiając drugą jako szkiełko kontroli ujemnej. Na obu szkiełkach nałóż przeciwbarwnik jądrowy i przeciwciało wtórne.

Po procesie barwienia dodać odczynniki wzmacniające sygnał tyramidu. Następnie zeskanuj preparaty wybarwione immunologicznie, używając odpowiednich długości fal wzbudzenia i detekcji dla użytych fluoroforów. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby zidentyfikować interesujący przedział komórkowy, niezależnie od tego, czy jest to jądro, czy cytoplazma, i określić ilościowo średnią intensywność fluorescencji lub MFI dla każdej linii.

Aby określić, która linia komórkowa ma największą obfitość białka docelowego, należy podwielokrotnie przygotowany lizat komórkowy do probówek do mikrowirówek. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra 6x buforu laemly i wystarczającą ilość buforu do lizy RIPA, aby zwiększyć całkowitą objętość do 15 mikrolitrów. Następnie załaduj żel do strony SDS z drabinką białkową i wcześniej przygotowanymi próbkami.

Następnie załaduj laemly bufor do pustych studzienek. Uruchom żel, aż niebieski barwnik dotrze do dna płytki. Po wykonaniu półsuchego transferu białka, użyj żyletki, aby przeciąć błonę poziomo, aby oddzielić białko będące przedmiotem zainteresowania od białka kontrolnego.

Wykonaj inkubacje blokujące i przeciwciała zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie umieść paski membrany w przezroczystej plastikowej torbie. Za pomocą pipety P1000 pokryć membrany mieszaniną ECL.

Następnie zamknij worek i inkubuj błony w temperaturze pokojowej w ciemności przez jedną do dwóch minut. Następnie umieść plastikową torbę zawierającą membrany na cyfrowej platformie obrazowania. Użyj chetekcji chemiluminescencji i markerów kolorymetrycznych, aby uchwycić różne ekspozycje membrany.

Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu lub obserwacji wizualnej, określ, która linia komórkowa wykazuje największą ekspresję białka docelowego. Po immunoblottingu seryjnego rozcieńczenia tej linii komórkowej otwórz obrazy ekspozycji za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Użyj narzędzia do zaznaczania prostokątnego, aby wybrać pierwszy pas żelu.

Następnie przejdź do analizy, żeli i wybierz pierwszy pas. Powtórz ten proces, przesuwając narzędzie do zaznaczania prostokątnego na następny pas, a następnie przejdź do opcji Analizuj, żeluje i wybierz następny pas. Następnie przejdź do analizy, żeli i wykreśl pasy.

Użyj narzędzia Linia prosta, aby narysować linie u podstawy każdego szczytu, aby usunąć szum tła. Następnie użyj narzędzia różdżki, aby wybrać każdy szczyt i uzyskać intensywność pasma każdego piku z okna wyników. Utwórz wykres rozrzutu intensywności pasma w funkcji ilości całkowitego białka załadowanego dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego, korzystając z danych wyjściowych densytometrii.

Następnie użyj linii najlepszego dopasowania i obserwacji wizualnej, aby określić lokalizację liniowego zakresu dynamicznego każdego przeciwciała. Wybierz stężenie białka, które daje intensywność pasma w zakresie liniowym, i wykonaj immunoblot wszystkich lizatów linii komórkowej o tym stężeniu białka, jak pokazano wcześniej. Następnie wykonaj densytometrię na skanach cyfrowych, wybierając ekspozycje, które dają sygnały w wcześniej zidentyfikowanych zakresach liniowych dla każdego przeciwciała.

Następnie oblicz stosunek intensywności pasma białka docelowego do intensywności pasma kontrolnego obciążenia dla każdej linii komórkowej. Na koniec użyj oprogramowania statystycznego, aby wykonać test korelacji Pearsona między wartościami uzyskanymi z analizy obrazu barwienia IF a wartościami uzyskanymi z immunoblottingu. Protokół ten został wykorzystany do potwierdzenia zdolności IF do określenia względnej ilości białka antyapoptotycznego Bcl-2.

Różne rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego testowano na ludzkiej tkance migdałków za pomocą barwnika immunohistologicznego. W tym eksperymencie ustalono, że rozcieńczenie od 1 do 50 jest optymalnym rozcieńczeniem, które daje silny sygnał z niewielkim szumem tła. To rozcieńczenie wykorzystano do barwienia linii komórkowej TMA za pomocą immunofluorescencji, a analizę obrazu wykorzystano do ilościowego określenia cytoplazmatycznego sygnału Cy5 przypisywanego Bcl-2.

Opierając się na immunoblot dla wszystkich badanych linii komórkowych, Granta-519 miała największą obfitość Bcl-2. Następnie wykorzystano immunoblot seryjnego rozcieńczenia lizatu Granta-519 w celu znalezienia liniowego zakresu dynamicznego Bcl-2 i białka kontrolnego GAPDH. Zakres dynamiki dla Bcl-2 w tym teście wahał się od intensywności pasma prawie 0 do 7500 jednostek.

Zakres dynamiki dla GAPDH wahał się od 3000 do 6500 jednostek. Immunoblot powtórzono z ekspozycjami w tym liniowym zakresie. Stosunek Bcl-2 do GAPDH obliczono dla każdej linii komórkowej.

Test korelacji Pearsona wykazał, że współczynniki intensywności z immunoblottingu były silnie i dodatnio skorelowane z odczytami intensywności z ilościowego IF. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o naświetleniu końcowej membrany przez wiele punktów czasowych, aby znaleźć optymalną ekspozycję, w której wszystkie pasma znajdują się w odpowiednich zakresach liniowych. Po zweryfikowaniu ilościowego charakteru protokołu IF, można go zmodyfikować pod kątem multipleksu IF w rutynowo przetwarzanych próbkach tkanek w celu udzielenia odpowiedzi na pytania kliniczne, takie jak miejsce ekspresji białka docelowego.