Name: Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj ilościowy immunoblotting linii komórkowych jako metodę walidacji immunofluorescencji do określania biomarkerów białkowych w próbkach FFPE. Technika ta wspiera precyzyjną diagnostykę onkologiczną i personalizację terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez Fredrick Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarship (A.M.).

Zgodę na użycie pierwotnych próbek tkanek ludzkich uzyskano od Rady Etyki Badań Nauk o Zdrowiu i Stowarzyszonych Szpitali Klinicznych (HSREB) na Queen's University.
1. Budowa mikromacierzy tkankowej linii komórkowej (TMA)
<ol>
	<li>Zbierz i umyj komórki. 
	UWAGA: Protokół ten został przetestowany na różnych uwiecznionych liniach komórkowych (np. HeLa, Jurkat, RCH-ACV).
	<ol>
		<li>W przypadku komórek przylegających zbierz około 1,3 x 107 komórek, gdy osiągną około 80% konfluencji. Odłącz komórki za pomocą odczynnika odpowiedniego dla tej linii komórkowej. 
		UWAGA: Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) jest ogólnie preferowany w stosunku do trypsyny w celu zmniejszenia ryzyka degradacji białek powierzchniowych. Jeśli używasz trypsyny, zneutralizuj trypsynę za pomocą płodowej surowicy bydlęcej (FBS) natychmiast po pobraniu komórek.</li>
		<li>W przypadku komórek zawiesinowych należy zebrać około 8 x 107 komórek w fazie logarytmicznej wzrostu.</li>
		<li>Zebrać zebrane/oderwane komórki, wirując przez 5 minut przy 225 x g w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). Wirować przez 5 minut przy 225 x g i zdekantować supernatant. 
		UWAGA: 1X PBS składa się z 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 w wodzie destylowanej; dostosować pH do 7,4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umocuj komórki w formalinie i zapakuj je.
	<ol>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w stożkowej probówce w 10 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny (NBF). 
		UWAGA: NBF można przygotować, rozcieńczając 1 ml 37% roztworu podstawowego formaldehydu w 9 ml 1X PBS. 
		UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z formaliną i formaldehydem. Użyj dygestorium do kroków związanych z formaliną i formaldehydem.</li>
		<li>Inkubować komórki na kołysku z prędkością 24 obr./min w temperaturze pokojowej przez noc (około 17 godzin).</li>
		<li>Przygotować 1% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w PBS (0,01 g agarozy na 1 ml PBS).
		<ol>
			<li>Przygotować wystarczającą ilość na 500 μl roztworu agarozy na próbkę linii komórkowej.</li>
			<li>Rozpuścić agarozę w łaźni wodnej o temperaturze 80 °C lub bloku grzewczym, od czasu do czasu mieszając przez 2-5 minut. Po rozpuszczeniu roztwór należy przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub bloku grzewczym, aby zapobiec stwardnieniu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Osadzać utrwalone komórki z kroku 1.2.2 przez odwirowywanie przez 5 minut przy 225 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl 1x PBS.</li>
		<li>Przenieść komórki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i osadzać przez odwirowywanie przez 5 minut przy 290 x g. Odessać cały supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odlać komórki w agarozie.
	<ol>
		<li>Dodać ~500 μl 1% roztworu agarozy (z kroku 1.2.3) do każdej probówki zawierającej komórki. Delikatnie, ale szybko, pipetuj mieszaninę w górę i w dół za pomocą mikropipety P-1000 do mieszania. 
		UWAGA: Odetnij koniec końcówki pipety, aby powiększyć otwór i uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Roztwór agarozy roboczej należy przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby zapobiec stwardnieniu.</li>
		<li>Pozostawić roztwór agarozy do stwardnienia (5-10 min) w temperaturze pokojowej. Dodać 1 ml 10% NBF do każdej probówki mikrowirówki zawierającej próbkę i przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu zatopienia parafiny (do 24 godzin).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj korek agarozowy do zatopienia w parafinie.
	<ol>
		<li>Odessać NBF z próbki.</li>
		<li>Wyjmij zatyczkę komórkową za pomocą żyletki, aby przeciąć probówkę mikrowirówki, umieść zatyczkę w plastikowej kasecie na chusteczki. Kasety należy przechowywać w 10% NBF w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki należy przetwarzać przez noc ręcznie lub za pomocą automatycznego procesora tkanek i zatapiać w wosku parafinowym przy użyciu standardowych metod histologicznych. 
	UWAGA: Patrz Fischer i wsp. 19 dla przykładowego protokołu.</li>
	<li>Za pomocą specjalistycznego przyrządu do tworzenia matryc tkankowych należy pobrać zduplikowane rdzenie o średnicy 0,6 mm z bloku parafinowego z każdej linii komórkowej i umieścić je w rzędach w pustym bloku parafiny biorcy w celu utworzenia linii komórkowej TMA. 
	UWAGA: Należy stosować standardowe metody, takie jak te opisane w Fedor i De Marzo20.</li>
	<li>Włączyć rdzenie z próbek pierwotnych reprezentujących 2-3 dodatkowe typy tkanek (np. migdałki, okrężnicę, jądra itp.) jako kontrole dodatnie lub ujemne do TMA. Wybierz tkanki, które są odpowiednie dla interesującego Cię białka.</li>
	<li>Za pomocą mikrotomu przygotować dwa skrawki histologiczne linii komórkowej TMA o grubości około 4 do 6 μm. Zamontuj wycinek na szkiełku histologicznym, wysusz go i odparafinowaj (zgodnie z opisem w Fedor i De Marzo20).</li>
</ol>
2. Barwienie próbki metodą immunofluorescencji
<ol>
	<li>Zoptymalizuj rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego. 
	UWAGA: Istnieją standardowe protokoły optymalizacji IHC lub IF dla skrawków tkanek FFPE, takich jak w Kajimura i wsp.21. Krótki opis tego podejścia znajduje się tutaj.
	<ol>
		<li>Przygotuj 4-5 rozcieńczeń pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białemu będącemu przedmiotem zainteresowania, kierując się instrukcjami producenta.</li>
		<li>Zidentyfikuj typ tkanki kontrolnej ze źródła zwierzęcego lub ludzkiego, który wyraża białko będące przedmiotem zainteresowania w morfologicznie rozpoznawalnych populacjach komórek. Przygotuj skrawki tkanki i zamontuj je na szkiełku podstawowym zgodnie ze standardową procedurą immunohistochemiczną, taką jak w Fedor i De Marzo20. 
		UWAGA: Wymagana liczba sekcji to liczba rozcieńczeń przeciwciał pierwszorzędowych plus jedno dodatkowe.</li>
		<li>Korzystając z automatycznego lub ręcznego systemu immunohistologicznego, należy przetestować rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych z kroku 2.1.1 na szkiełku podstawowym z kroku 2.1.2. Pomiń aplikację przeciwciała pierwszorzędowego z dodatkowego szkiełka i użyj go jako kontroli negatywnej.</li>
		<li>Podczas procesu barwienia wybarwić wszystkie szkiełka 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) jako przeciwbarwnikiem jądrowym i fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem drugorzędowym. Jeśli wymagana jest większa czułość, należy użyć sprzężonego z HRP (peroksydaza chrzanowa) przeciwciała drugorzędowego i systemu wzmacniania sygnału opartego na tyramidzie (patrz Stack i wsp.<klasa sup="odnośnik">13). 
		UWAGA: Podczas multipleksowania przeciwciał pierwszorzędowych dla każdego białka stosuje się inny znacznik fluorescencyjny.</li>
		<li>Zeskanuj preparaty wybarwione immunologicznie za pomocą odpowiedniego przyrządu zdolnego do wygenerowania cyfrowego pliku obrazu przy użyciu długości fal wzbudzenia i detekcji odpowiednich dla użytych fluoroforów.</li>
		<li>Użyj odpowiedniego oprogramowania, aby wyświetlić obrazy cyfrowe i empirycznie wybrać pierwotne rozcieńczenie przeciwciała, które optymalizuje intensywność sygnału w stosunku do fluorescencji tła. 
		UWAGA: W razie potrzeby optymalizacja ta może nastąpić przy użyciu przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z HRP, 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) i mikroskopii jasnego pola.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj barwienie IF na linii komórkowej TMA.
	<ol>
		<li>Użyj automatycznego lub ręcznego systemu immunohistologicznego, aby wybarwić szkiełko linii komórkowej TMA za pomocą zoptymalizowanego rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych (jak określono w kroku 2.1). Pomiń stosowanie przeciwciała pierwszorzędowego z drugiego szkiełka i użyj go jako kontroli ujemnej.</li>
		<li>Podczas procesu barwienia wybarwić wszystkie szkiełka 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) jako przeciwbarwieniem jądrowym oraz przeciwciałem drugorzędowym i tyramidem, jak w kroku 2.1.4.</li>
		<li>Zeskanuj preparaty wybarwione immunologicznie za pomocą odpowiedniego przyrządu zdolnego do wygenerowania cyfrowego pliku obrazu przy użyciu długości fal wzbudzenia i detekcji odpowiednich dla użytych fluoroforów.</li>
		<li>Użyj pakietu oprogramowania do analizy obrazu, aby zidentyfikować interesujący przedział komórkowy (tj. cytoplazmę w porównaniu z jądrem) i określić ilościowo średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla każdej linii komórkowej. 
		UWAGA: W tym celu można używać różnych pakietów oprogramowania, a wiele z nich omówiono w Stack i wsp.13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ilościowe immunoblotting linii komórkowych
<ol>
	<li>Przygotuj lizaty komórek.
	<ol>
		<li>Zbierz 2 miliony komórek z każdej linii komórkowej, zgodnie z opisem w krokach od 1.1.1 do 1.1.3.</li>
		<li>Wiruj komórki przez 5 minut w temperaturze 650 x g w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zdekantować supernatant.</li>
		<li>Umyj komórki 10 ml lodowatego PBS. Zawiesić ponownie w 1 ml lodowatego PBS i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować zgodnie z krokiem 3.1.2, zdekantować i pozostawić komórki na lodzie.</li>
		<li>Dodać około 200 μl zimnego buforu do lizy radioimmunoprecypitacji (RIPA) z inhibitorami proteazy (10 μl 100-krotnych inhibitorów na ml buforu do lizy RIPA) do komórek, wirować i inkubować na lodzie przez 15 min. 
		UWAGA: Ilość buforu do lizy wymagana do skutecznej lizy różni się w zależności od linii komórkowej i można ją określić empirycznie. Bufor RIPA składa się ze 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, 1,0% NP-40, 0,5% deoksycholanu sodu, 0,1% SDS w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Aby zapewnić względnie równomierne obciążenie immunoblotów, należy określić ilościowo całkowite białko w próbce 20 μl z każdego lizatu przy użyciu odpowiedniej metody, takiej jak test Bradforda. Dodać około 40 μl buforu do lizy 6X Laemmli do reszty (około 180 μl) każdego lizatu komórkowego i gotować w temperaturze 100 °C w bloku grzewczym lub łaźni wodnej przez 5 min. 
		UWAGA: Bufor 6X Laemmli składa się z 300 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w/v) SDS, 60% glicerolu, 0,6% (w/v) błękitu bromofenolowego, 50 mM ditiotreitolu (DTT) w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do dwóch tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj immunoblot wszystkich linii komórkowych, aby określić, która linia komórkowa ma najliczniejsze białko będące przedmiotem zainteresowania. 
	UWAGA: Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w Mahmood, T. i Yang, PC. 22, z następującymi modyfikacjami.
	<ol>
		<li>Podwielokrotny lizat komórkowy (przygotowany w kroku 3.1) zawierający 10-50 μg białka (w zależności od obfitości białka będącego przedmiotem zainteresowania) do probówek do mikrowirówek. Dodać 2,5 μl buforu 6X Laemmli i wystarczającą ilość buforu do lizy RIPA, aby uzyskać objętość do 15 μl.</li>
		<li>Załadować 5% układanie w stos i odpowiednie stężenie rozdzielcze (np. 10% dla białek między 15-100 kDa) żel SDS-PAGE z drabinką białkową i próbkami z kroku 3.2.1. Załaduj 1X bufor Laemmli do pustych studzienek. Uruchom zasilacz przy odpowiednich ustawieniach, zwykle 125 V, na 80 minut lub do momentu, gdy niebieski barwnik bromofenolowy dotrze do dna płytki.</li>
		<li>Wykonać półsuchy transfer białka zgodnie z opisem w Wiedemann i wsp.23. 
		UWAGA: W celu uzyskania reprezentatywnych wyników zastosowano membranę nitrocelulozową (która nie musi być moczona w metanolu) oraz zimny bufor transferowy Bjerrum Schafer-Nielsen (BSN). Bufor BSN składa się z 48 mM Tris, 39 mM glicyny, 20% metanolu w wodzie destylowanej.</li>
		<li>Po przeniesieniu użyj żyletki, aby przeciąć błonę poziomo, aby oddzielić część zawierającą białko będące przedmiotem zainteresowania od odpowiedniego białka kontroli wewnętrznej, takiego jak GAPDH.</li>
		<li>Przystąpić do inkubacji blokującej i inkubacji przeciwciał przy użyciu buforu blokującego zalecanego przez producenta przeciwciał pierwszorzędowych. 
		UWAGA: Optymalne rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych mogą się znacznie różnić w zależności od obfitości i wrażliwości białka. Aby uzyskać reprezentatywne wyniki poniżej, przeciwciało przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania wymagało rozcieńczenia 1:1,000, podczas gdy kontrola GAPDH wymagała rozcieńczenia 1:40,000. Rozcieńczenie zastosowanych przeciwciał drugorzędowych wynosiło 1:3 000.</li>
		<li>Po inkubacji przeciwciał i umyciu błony należy umieścić paski membrany w przezroczystej plastikowej osłonce, takiej jak torebka na kanapki.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę ze wzmocnioną chemiluminescencją (ECL) zgodnie z instrukcjami producenta. Za pomocą pipety P-1000 pokryć membranę mieszaniną ECL, zamknąć osłonę i inkubować paski membrany z mieszaniną w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty.</li>
		<li>Umieść osłonę membrany na cyfrowej platformie obrazowania. Użyj chemagluminescencji i detekcji markerów kolorymetrycznych, aby uchwycić różne ekspozycje membrany. 
		UWAGA: Czasy ekspozycji będą się różnić w zależności od ilości załadowanego białka, obfitości białka docelowego, powinowactwa przeciwciał itp. Rozpocznij od automatycznej ekspozycji (zwykle kilka sekund) i przetestuj czasy ekspozycji powyżej i poniżej w krokach co kilka sekund.</li>
		<li>Empirycznie lub za pomocą oprogramowania do analizy obrazu określ, która linia komórkowa wykazuje największą ekspresję białka docelowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znajdź liniowy zakres dynamiczny każdego przeciwciała pierwszorzędowego za pomocą rozcieńczenia szeregowego.
	<ol>
		<li>Wykonać kroki 3.2.1-3.2.8, stosując serię seryjnych rozcieńczeń z linii komórkowej, która wyraża najwyższe stężenie białka docelowego (zidentyfikowane w kroku 3.2.9).</li>
		<li>Użyj oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ, aby wykonać densytometrię na obrazach ekspozycji.
		<ol>
			<li>Na przykład, korzystając z ImageJ, użyj narzędzia Prostokątne zaznaczenia, aby wybrać pierwszy pas żelu do określenia ilościowego. Przejdź do Analizy| Żele| Wybierz pierwszy pas. Użyj myszy, aby przesunąć powstały prostokąt na następny pas ruchu. Przejdź do Analizy| Żele| Wybierz pozycję Następny pas. Kilkakrotnie przesuwaj prostokąt na następny pas ruchu i wybierz pas dla pozostałych pasów.</li>
			<li>Przejdź do Analizy| Żele| Działka: Pasy ruchu. Użyj narzędzia Linia prosta, aby narysować linie u podstaw każdego szczytu, aby usunąć szum tła. Użyj narzędzia Różdżka, aby wybrać każdy pik i zebrać gęstość każdego piku, odtąd nazywaną intensywnością pasma, w oknie Wyniki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj danych wyjściowych densytometrii, aby utworzyć wykres rozrzutu intensywności pasma w funkcji ilości całkowitego białka załadowanego dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego. Korzystając z linii najlepszego dopasowania i kontroli wzrokowej, określ lokalizację (zakres intensywności) liniowego zakresu dynamiki każdego przeciwciała.</li>
		<li>Wybierz stężenie białka, które generuje wartość na górnym końcu zakresu liniowego, która ma być stężeniem poruszającym się naprzód dla wszystkich linii komórkowych. 
		UWAGA: Ponieważ stężenie to jest poniżej poziomu nasycenia w linii komórkowej największą ilością tego białka, nie powinno być niebezpieczeństwa prześwietlenia prążków dla innych linii komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać immunoblot przy użyciu stężenia białka wybranego w kroku 3.3.4 dla wszystkich linii komórkowych i powtórzyć kroki 3.2.1-3.2.8.
	<ol>
		<li>Wykonaj densytometrię na skanach cyfrowych, jak w kroku 3.3.2. Wybierz obrazy ekspozycji, które dają sygnały w zakresach liniowych dla każdego przeciwciała zidentyfikowanego w kroku 3.3.3.</li>
		<li>Korzystając z sygnałów intensywności pasma z idealnych ekspozycji z ppkt 3.4.1, obliczyć stosunek intensywności pasma białka docelowego do intensywności pasma kontrolnego obciążenia dla każdej linii komórkowej. Te wartości współczynnika wskazują względną obfitość docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania.</li>
		<li>Wykonaj test korelacji Pearsona (można go wykonać przy użyciu pakietu oprogramowania statystycznego), aby skorelować wartości uzyskane z analizy obrazu barwienia IF (krok 2.2) z wartościami uzyskanymi z immunoblottingu (krok 3.4.2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Khoury, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+Immunohistochemical+Assays+for+Integral+Biomarkers+in+the+NCI-MATCH+EAY131+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of Immunohistochemical Assays for Integral Biomarkers in the NCI-MATCH EAY131 Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 24 (3), 521-531 (2018).</li>
<li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G. L., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+insights%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomarker insights. 5, 9-20 (2010).</li>
<li>Seidal, T., Balaton, A. J., Battifora, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+and+quantification+of+immunostains%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+surgical+pathology%22%5BJournal%5D)">Interpretation and quantification of immunostains.</a> The American journal of surgical pathology. 25 (9), 1204-1207 (2001).</li>
<li>Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+brown+cannot+do+for+you%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">What brown cannot do for you.</a> Nature Biotechnology. 24 (8), 914-916 (2006).</li>
<li>Bokhart, M. T., Rosen, E., Thompson, C., Sykes, C., Kashuba, A. D. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+imaging+of+emtricitabine+in+cervical+tissue+model+using+infrared+matrix-assisted+laser+desorption+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry imaging of emtricitabine in cervical tissue model using infrared matrix-assisted laser desorption electrospray ionization.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (8), 2073-2084 (2015).</li>
<li>Porta, T., Lesur, A., Varesio, E., Hopfgartner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+in+MALDI-MS+imaging%3A+what+can+we+learn+from+MALDI-selected+reaction+monitoring+and+what+can+we+expect+for+imaging%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification in MALDI-MS imaging: what can we learn from MALDI-selected reaction monitoring and what can we expect for imaging?</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (8), 2177-2187 (2015).</li>
<li>Rzagalinski, I., Volmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+low+molecular+weight+compounds+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry+%E2%80%93+A+tutorial+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantification of low molecular weight compounds by MALDI imaging mass spectrometry – A tutorial review.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1865 (7), 726-739 (2017).</li>
<li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Western+blots%3A+Pitfalls+of+densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">Quantifying Western blots: Pitfalls of densitometry.</a> ELECTROPHORESIS. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Burgess, M. W., Keshishian, H., Mani, D. R., Gillette, M. A., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+efficient+quantification+of+low-abundance+proteins+at+very+high+multiplex+via+targeted+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (4), 1137-1149 (2014).</li>
<li>Carr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+peptide+measurements+in+biology+and+medicine%3A+best+practices+for+mass+spectrometry-based+assay+development+using+a+fit-for-purpose+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 13 (3), 907-917 (2014).</li>
<li>Denburg, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Two+ELISA+Methods+and+Mass+Spectrometry+for+Measurement+of+Vitamin+D-Binding+Protein%3A+Implications+for+the+Assessment+of+Bioavailable+Vitamin+D+Concentrations+Across+Genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of Two ELISA Methods and Mass Spectrometry for Measurement of Vitamin D-Binding Protein: Implications for the Assessment of Bioavailable Vitamin D Concentrations Across Genotypes.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 31 (6), 1128-1136 (2016).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+A+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Peck, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+tumor+protein+marker+quantification+by+two+independent+automated+immunofluorescence+image+analysis+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+pathology%3A+an+official+journal+of+the+United+States+and+Canadian+Academy+of+Pathology%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">Validation of tumor protein marker quantification by two independent automated immunofluorescence image analysis platforms.</a> Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 29 (10), 1143-1154 (2016).</li>
<li>Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+of+the+quantitative+potential+of+immunofluorescence+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry.</a> Laboratory Investigation. 97 (3), 329-334 (2017).</li>
<li>AlJohani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+expression+of+BMI1+in+follicular+lymphoma+is+associated+with+reduced+overall+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+and+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Abundant expression of BMI1 in follicular lymphoma is associated with reduced overall survival.</a> Leukemia and Lymphoma. 59 (9), 2211-2219 (2018).</li>
<li>Wood, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+expression+of+interleukin-21+receptor+in+follicular+lymphoma+cells+is+associated+with+more+aggressive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+and+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Abundant expression of interleukin-21 receptor in follicular lymphoma cells is associated with more aggressive disease.</a> Leukemia and Lymphoma. 54 (6), 1212-1220 (2013).</li>
<li>Weberpals, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+application+of+the+Automated+QUantitative+Analysis+%28AQUA%29+technique+to+quantify+PTEN+protein+expression+in+ovarian+cancer%3A+A+correlative+study+of+NCIC+CTG+OV.16%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">First application of the Automated QUantitative Analysis (AQUA) technique to quantify PTEN protein expression in ovarian cancer: A correlative study of NCIC CTG OV.16.</a> Gynecologic Oncology. 140 (3), 486-493 (2016).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+embedding+tissue+samples+for+sectioning%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Paraffin embedding tissue samples for sectioning.</a> CSH protocols. , (2008).</li>
<li>Fedor, H. L., Marzo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Practical+Methods+for+Tissue+Microarray+Construction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">De Practical Methods for Tissue Microarray Construction.</a> Methods in Molecular Medicine. , 89-101 (2005).</li>
<li>Kajimura, J., Ito, R., Manley, N. R., Hale, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Single-+and+Dual-Color+Immunofluorescence+Protocols+for+Formalin-Fixed%2C+Paraffin-Embedded+Archival+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of Single- and Dual-Color Immunofluorescence Protocols for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (2), 112-124 (2016).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+journal+of+medical+sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American journal of medical sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Wiedemann, M., Lee, S. J., da Silva, R. C., Visweswaraiah, J., Soppert, J., Sattlegger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+semi-dry+electrophoretic+transfer+of+a+wide+range+of+differently+sized+proteins+for+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Simultaneous semi-dry electrophoretic transfer of a wide range of differently sized proteins for immunoblotting.</a> Nature Protocol Exchange. , (2013).</li>
<li>Delbridge, A. R. D., Grabow, S., Strasser, A., Vaux, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty+years+of+BCL-2%3A+translating+cell+death+discoveries+into+novel+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Thirty years of BCL-2: translating cell death discoveries into novel cancer therapies.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (2), 99-109 (2016).</li>
<li>Bosch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioclinical+prognostic+model+using+MYC+and+BCL2+predicts+outcome+in+relapsed%2Frefractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">A bioclinical prognostic model using MYC and BCL2 predicts outcome in relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Haematologica. 103 (2), 288-296 (2018).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL2+mRNA+or+protein+abundance+is+superior+to+gene+rearrangement+status+in+predicting+clinical+outcomes+in+patients+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematological+Oncology%22%5BJournal%5D)">BCL2 mRNA or protein abundance is superior to gene rearrangement status in predicting clinical outcomes in patients with diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematological Oncology. 35, 288-289 (2017).</li>
<li>Choi, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+Bcl-2+predicts+poor+outcome+in+diffuse+large+B-cell+lymphoma+patients+with+low+international+prognostic+index+receiving+R-CHOP+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">High expression of Bcl-2 predicts poor outcome in diffuse large B-cell lymphoma patients with low international prognostic index receiving R-CHOP chemotherapy.</a> International Journal of Hematology. 103 (2), 210-218 (2016).</li>
<li>The Human Protein Atlas BCL2. , 
 <a target="_blank" href="https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna">https://www.proteinatlas.org/ENSG00000171791-BCL2/cell#rna</a> (2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Modern+Quantitative+Fluorescent+Western+Blotting+with+Troubleshooting+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099(2014).</li>
<li>Zellner, M., Babeluk, R., Diestinger, M., Pirchegger, P., Skeledzic, S., Oehler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22ELECTROPHORESIS%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> ELECTROPHORESIS. 29 (17), 3621-3627 (2008).</li>
<li>Parra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Platforms+of+Multiplexed+Immunofluorescence+for+Study+of+Paraffin+Tumor+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+%26+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Novel Platforms of Multiplexed Immunofluorescence for Study of Paraffin Tumor Tissues.</a> Journal of Cancer Treatment & Diagnostics. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunofluorescence+labelling+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue.</a> BMC Cell Biology. 9 (1), 13(2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisaliśmy metodę, która wykorzystuje ilościowe immunoblotting (IB) w celu wykazania użyteczności immunofluorescencji (IF) do ustalenia względnej obfitości białka docelowego w próbkach tkanek FFPE. Obecne metody oznaczania ilościowego białek są ograniczone ze względu na ich kategoryczny charakter, taki jak chromogenny IHC 2,3, lub ze względu na konieczność homogenizacji próbek, co uniemożliwia badanie struktury próbki i populacji komórek, jak w przypadku IB i spe...

Potrzeba ilościowego oznaczania białek w próbkach biopsji tkanek z użyciem utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie (FFPE) istnieje w wielu dziedzinach klinicznych. Na przykład, kwantyfikacja białek biomarkerów w rutynowych próbkach biopsyjnych jest wykorzystywana do wyjaśnienia rokowania i informowania o leczeniu pacjentów z rakiem1. Jednak obecne metody są zazwyczaj subiektywne i nie mają walidacji.
Immunohistochemia (IHC) jest rutynowo stosowana w laboratoriach patologicznych i zazwyczaj zależy od pierwszorzędowego przeciwciała skierowanego na docelowe białko i drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z etykietą enzymatyczną, taką jak peroksydaza chrzanowa2. Konwencjonalny IHC jest czuły, może wykorzystywać drobne próbki i zachowuje integralność morfologiczną próbek tkanek, umożliwiając w ten sposób ocenę ekspresji białka w odpowiednim kontekście histologicznym. Ponieważ jednak sygnał chromogeniczny generowany przez IHC jest subtraktywny, cierpi z powodu stosunkowo wąskiego zakresu dynamiki i oferuje ograniczony potencjał multipleksowania2,3,4. Obrazowanie metodą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-MSI) zachowuje integralność morfologiczną. Jednak ta rozwijająca się technologia wiąże się ze skromną rozdzielczością morfologiczną i wymaga znacznej kalibracji i normalizacji, co pogarsza jej wykonalność do rutynowego użytku klinicznego5,6,7. Alternatywne techniki ilościowego oznaczania białka w próbkach tkanek obejmują immunoblotting8, spektrometria mas9,10,11 oraz test immunoenzymatyczny (ELISA)12, z których każdy rozpoczyna się od homogenizowanego lizatu próbki tkanki. Pierwotne próbki tkanek są niejednorodne, ponieważ zawierają wiele typów komórek. W związku z tym techniki, które pociągają za sobą homogenizację próbek, nie pozwalają na ilościowe określenie białka w określonej populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania, takich jak komórki rakowe.
Podobnie jak IHC, IF ma zastosowanie do małych próbek FFPE i pozwala na zachowanie integralności histologicznej13. Jednak dzięki addytywnemu charakterowi sygnałów fluorescencyjnych, IF jest podatny na stosowanie wielu przeciwciał pierwszorzędowych i znaczników fluorescencyjnych. W związku z tym białko będące przedmiotem zainteresowania może być względnie określone ilościowo w określonych komórkach lub przedziałach komórkowych (na przykład jądro kontra cytoplazma) zdefiniowanych przy użyciu innych przeciwciał. Sygnały fluorescencyjne mają również tę zaletę, że mają większy zakres dynamiki13,14. Wykazano wyższość, odtwarzalność i potencjał multipleksowania IF zastosowanego do próbek FFPE13,14,15.
Tutaj opisujemy użycie ilościowego immunoblottingu przy użyciu ustalonych linii komórkowych jako złotego standardu do ustalenia ilościowego charakteru IF w połączeniu z komputerowo wspomaganą analizą obrazu w określaniu względnej obfitości interesującego białka w histologicznych skrawkach z próbek tkanek FFPE. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę w podejściu multipleksowym do ilościowego oznaczania białek biomarkerów w próbkach biopsji klinicznej16,17,18.

<table><tbody><tr><td>697</td><td>DSMZ</td><td>ACC 42</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>JeKo-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>RCH-ACV</td><td>DSMZ</td><td>ACC 548</td><td>Linia</td></tr><tr><td>komórkowa Granta-519</td><td>DSMZ</td><td>ACC 342</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>REH</td><td>DSMZ</td><td>ACC 22</td><td>Linia</td></tr><tr><td>komórkowa Raji</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny/EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>R001100</td><td>Do oddzielania komórek adhezyjnych</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Żubry Inc.</td><td>81150</td><td>Aby zneutralizować trypsynę</td></tr><tr><td>Neutralna buforowana formalina</td><td>Protokół</td><td>245-684</td><td>Do mocowania granulek komórkowych</td></tr><tr><td>UltraPure agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Invitrogen</td><td>15517-022</td><td>Do odlewania granulek komórkowych</td></tr><tr><td>Mysie monoklonalne przeciwciało anty-ludzkie Bcl-2, klon 124</td><td>Dako (Agilent)</td><td>kat#: M088729-2, RRID: 2064429</td><td>Do wykrywania Bcl-2 metodą immunofluorencji i immunoblot (lot#:&nbsp; 00095786</td></tr><tr><td>Ventana Discovery XT</td><td></td> <td>Roche-Do</td> <td>automatyzacji barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>System EnVision+- Polimer znakowany HRP (anty-mysz)</td><td>Dako (Agilent)</td><td>K4000</td><td>Do immunofluorescencyjnego wzmocnienia sygnału</td></tr><tr><td>System EnVision+- Polimer znakowany HRP (anty-królik)</td><td>Dako (Agilent)</td><td>K4002</td><td>Do immunofluorescencyjnego wzmacniania sygnału</td></tr><tr><td>Cyjanina 5 odczynnik tyramidu</td><td>Perkin Elmer NEL745001KT</td><td></td><td>Do immunofluorescencji wzmocnienia sygnału</td></tr><tr><td>Aperio ImageScope</td><td>Leica Biosystems-Aby</td><td></td> <td>wyświetlić zeskanowane slajdy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu HALO</td><td>Indica Labs-Do</td><td></td> <td>kwantyfikacji immunofluorescencyjnych</td></tr><tr><td>inhibitorów proteazy (koktajl inhibitorów proteazy Halt, 100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td>Aby dodać do Bufor RIPA</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>BioShop</td><td>EDT001</td><td>Dla bufora RIPA</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>BDH Limited</td><td>56009</td><td>Dla bufora RIPA</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Dla buforu RIPA</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>FisherBiotech</td><td>BP229</td><td>Dla bufora Laemlli</td></tr><tr><td>Bromofenol niebieski</td><td>BioShop</td><td>BRO777</td><td>Do buforu Laemlli</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>Do buforu Laemlli</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>BioShop</td><td>ALB001</td><td>Do płukania immunoblot</td></tr><tr><td>Drabinka białkowa (Precision Plus Protein Dual Color Standards)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td>Do biegania żelu białkowego</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna (bardzo gruba bibuła)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703969</td><td>Do bibuły transfer</td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td>Do transferu bibuły</td></tr><tr><td>Półsucha komórka transferowa Trans-blot SD</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Do transferu półsuchego</td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku (beztłuszczowe mleko w proszku)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>9999S</td><td>Do blokowania bufora</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>Do bufora myjącego</td></tr><tr><td>GAPDH królik </td><td>przeciwciało monoklonalne Epitomics</td><td>2251-1</td><td>Pierwszorzędowe przeciwciało białka kontrolnego (lot#: YE101901C)</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (skoniugowane HRP)</td><td>abcam</td><td>cat#: ab6789, RRID: AB_955439</td><td>Przeciwciało drugorzędowe dla immunoblot</td></tr><tr><td>Goat anty-rabbit IgG (HRP sprzężone)</td><td>abcam</td><td>cat#: ab6721, RRID: AB_955447</td><td>Drugorzędowe przeciwciało przeciwko immunoblot (parti#: GR3192725-5)</td></tr><tr><td>Clarity Western Substraty ECL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td>Do wykrywania sygnału immunoblot</td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>29083461</td><td>Do wykrywania sygnału immunoblot</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>ImageJ Freeware, NIH-Do</td><td></td> <td>analizy densytometrycznej</td></tr></tbody></table>

ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Kwantyfikacja interesujących białek w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) jest ważna w zastosowaniach klinicznych i badawczych. Optymalna metoda oznaczania ilościowego jest dokładna, ma szeroki liniowy zakres dynamiczny i utrzymuje integralność strukturalną próbki, aby umożliwić identyfikację poszczególnych typów komórek. Obecne metody, takie jak immunohistochemia (IHC), spektrometria mas i immunoblotting, nie spełniają tych wymagań ze względu na ich kategoryczny charakter lub konieczność homogenizacji próbki. Jako alternatywną metodę proponujemy zastosowanie immunofluorescencji (IF) i analizy obrazu w celu określenia względnej obfitości białka będącego przedmiotem zainteresowania w tkankach FFPE. W tym miejscu pokazujemy, że metoda ta jest łatwa do optymalizacji, daje szeroki zakres dynamiki i jest liniowo kwantyfikowalna w porównaniu ze złotym standardem ilościowego immunoblottingu. Ponadto metoda ta pozwala na zachowanie integralności strukturalnej próbki i pozwala na rozróżnienie różnych typów komórek, co może mieć kluczowe znaczenie w zastosowaniach diagnostycznych. Ogólnie rzecz biorąc, jest to solidna metoda względnej kwantyfikacji białek w próbkach FFPE i może być łatwo dostosowana do potrzeb klinicznych lub badawczych.

Niniejszy protokół został zastosowany w celu potwierdzenia zdolności metody IF do określania względnej ilości białka antyapoptotycznego Bcl-2 w liniach komórkowych utrwalonych w blokach tkankowych FFPE. Selektywne oznaczanie ilościowe Bcl-2 w komórkach nowotworowych może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów onkogennych i może być przydatne w diagnostyce patomorfologicznej oraz w podejmowaniu decyzji dotyczących prowadzenia klinicznego pacjentów24. W szczególności Bcl-2 ...

Opisujemy użycie ilościowego immunoblottingu do walidacji histologii immunofluorescencyjnej w połączeniu z analizą obrazu jako sposobu ilościowego oznaczania interesującego białka w próbkach tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE). Nasze wyniki wskazują na przydatność histologii immunofluorescencyjnej do ustalania względnej ilości białek biomarkerowych w rutynowych próbkach biopsji.

Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patologii nowotworów poprzez ilościowe określenie białek biomarkerowych z rutynowo przetwarzanego materiału biopsyjnego. Głównymi zaletami tej techniki w stosunku do konwencjonalnej immunohistochemii jest to, że jest obiektywna, ma szeroki zakres dynamiki i pozwala na ilościowe oznaczanie białek w określonych typach komórek. Obecność lub brak pewnych tak zwanych białek biomarkerowych, a w szczególności względna obfitość tych białek w próbkach biopsji nowotworu może być bardzo przydatna w postawieniu specyficznej diagnozy patologicznej określonych rodzajów nowotworów.Ale może być również przydatna w przewidywaniu odpowiedzi na leczenie raka, dlatego ta technika jest istotna zarówno w diagnostyce, jak i leczeniu pacjentów z rakiem. Protokół ten dotyczy głównie sposobu wykorzystania kwantyfikacji białek w unieśmiertelnionych liniach komórkowych w celu walidacji ilościowego charakteru testu opartego na immunofluorescencji. Należy jednak zauważyć, że immunofluorescencję można łatwo włączyć do podejścia multipleksowego i zastosować do próbek z biopsji pierwotnej.Asystować i demonstrować tę procedurę będą Lee Boudreau, technik, i Shakeel Virk, dyrektor operacyjny. Oba z Queen's Laboratory for Molecular Pathology. Na początek odwiruj wcześniej zebrane komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów o sile 225 G przez pięć minut.Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach PBS. Następnie odwirować zawieszone komórki w temperaturze 225 g przez pięć minut. Zawieś osad komórkowy za pomocą 10 mililitrów 10% NBF.Następnie inkubuj komórki w temperaturze pokojowej na rockerze z prędkością 24 obr./min przez noc. Po utrwaleniu komórek odwirować komórki w temperaturze 225 G przez pięć minut. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach PBS.Przenieś komórki do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej i osadź komórki przez odwirowanie. Następnie odessać supernatant. Dodaj około 500 mikrolitrów 1% roztworu agarozy do każdej probówki zawierającej komórki.Następnie odpipetuj mieszaninę w górę i w dół, aby wymieszać. Po stwardnieniu roztworu komórek agarozy dodaj jeden mililitr 10% NBF do probówek. Później usuń NBF z próbek.Użyj żyletki, aby wyjąć zatyczkę komórkową i umieść zatyczkę w plastikowej kasecie na chusteczki. Przetwarzaj próbki przez noc za pomocą automatycznego procesora tkanek. Następnie zanurz próbki w wosku parafinowym, stosując standardowe metody histologiczne.Za pomocą przyrządu do układania tkanek zbierz zduplikowane 6-milimetrowe rdzenie z bloku parafiny i włóż je do pustego bloku parafinowego. Następnie za pomocą mikrotomu przygotuj dwie sekcje histologiczne nowo utworzonej linii komórkowej, TMA. Następnie zamontuj skrawki na szkiełku histologicznym i odparafinowaj je.Najpierw załaduj dwa szkiełka linii komórkowej TMA do automatycznego systemu barwienia. Zabarwić jedną stronę optymalnym rozcieńczeniem przeciwciał pierwotnych, pozostawiając drugą jako szkiełko kontroli ujemnej. Na obu szkiełkach nałóż przeciwbarwnik jądrowy i przeciwciało wtórne.Po procesie barwienia dodać odczynniki wzmacniające sygnał tyramidu. Następnie zeskanuj preparaty wybarwione immunologicznie, używając odpowiednich długości fal wzbudzenia i detekcji dla użytych fluoroforów. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby zidentyfikować interesujący przedział komórkowy, niezależnie od tego, czy jest to jądro, czy cytoplazma, i określić ilościowo średnią intensywność fluorescencji lub MFI dla każdej linii.Aby określić, która linia komórkowa ma największą obfitość białka docelowego, należy podwielokrotnie przygotowany lizat komórkowy do probówek do mikrowirówek. Następnie dodaj 2,5 mikrolitra 6x buforu laemly i wystarczającą ilość buforu do lizy RIPA, aby zwiększyć całkowitą objętość do 15 mikrolitrów. Następnie załaduj żel do strony SDS z drabinką białkową i wcześniej przygotowanymi próbkami.Następnie załaduj laemly bufor do pustych studzienek. Uruchom żel, aż niebieski barwnik dotrze do dna płytki. Po wykonaniu półsuchego transferu białka, użyj żyletki, aby przeciąć błonę poziomo, aby oddzielić białko będące przedmiotem zainteresowania od białka kontrolnego.Wykonaj inkubacje blokujące i przeciwciała zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie umieść paski membrany w przezroczystej plastikowej torbie. Za pomocą pipety P1000 pokryć membrany mieszaniną ECL.Następnie zamknij worek i inkubuj błony w temperaturze pokojowej w ciemności przez jedną do dwóch minut. Następnie umieść plastikową torbę zawierającą membrany na cyfrowej platformie obrazowania. Użyj chetekcji chemiluminescencji i markerów kolorymetrycznych, aby uchwycić różne ekspozycje membrany.Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu lub obserwacji wizualnej, określ, która linia komórkowa wykazuje największą ekspresję białka docelowego. Po immunoblottingu seryjnego rozcieńczenia tej linii komórkowej otwórz obrazy ekspozycji za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Użyj narzędzia do zaznaczania prostokątnego, aby wybrać pierwszy pas żelu.Następnie przejdź do analizy, żeli i wybierz pierwszy pas. Powtórz ten proces, przesuwając narzędzie do zaznaczania prostokątnego na następny pas, a następnie przejdź do opcji Analizuj, żeluje i wybierz następny pas. Następnie przejdź do analizy, żeli i wykreśl pasy.Użyj narzędzia Linia prosta, aby narysować linie u podstawy każdego szczytu, aby usunąć szum tła. Następnie użyj narzędzia różdżki, aby wybrać każdy szczyt i uzyskać intensywność pasma każdego piku z okna wyników. Utwórz wykres rozrzutu intensywności pasma w funkcji ilości całkowitego białka załadowanego dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego, korzystając z danych wyjściowych densytometrii.Następnie użyj linii najlepszego dopasowania i obserwacji wizualnej, aby określić lokalizację liniowego zakresu dynamicznego każdego przeciwciała. Wybierz stężenie białka, które daje intensywność pasma w zakresie liniowym, i wykonaj immunoblot wszystkich lizatów linii komórkowej o tym stężeniu białka, jak pokazano wcześniej. Następnie wykonaj densytometrię na skanach cyfrowych, wybierając ekspozycje, które dają sygnały w wcześniej zidentyfikowanych zakresach liniowych dla każdego przeciwciała.Następnie oblicz stosunek intensywności pasma białka docelowego do intensywności pasma kontrolnego obciążenia dla każdej linii komórkowej. Na koniec użyj oprogramowania statystycznego, aby wykonać test korelacji Pearsona między wartościami uzyskanymi z analizy obrazu barwienia IF a wartościami uzyskanymi z immunoblottingu. Protokół ten został wykorzystany do potwierdzenia zdolności IF do określenia względnej ilości białka antyapoptotycznego Bcl-2.Różne rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego testowano na ludzkiej tkance migdałków za pomocą barwnika immunohistologicznego. W tym eksperymencie ustalono, że rozcieńczenie od 1 do 50 jest optymalnym rozcieńczeniem, które daje silny sygnał z niewielkim szumem tła. To rozcieńczenie wykorzystano do barwienia linii komórkowej TMA za pomocą immunofluorescencji, a analizę obrazu wykorzystano do ilościowego określenia cytoplazmatycznego sygnału Cy5 przypisywanego Bcl-2.Opierając się na immunoblot dla wszystkich badanych linii komórkowych, Granta-519 miała największą obfitość Bcl-2. Następnie wykorzystano immunoblot seryjnego rozcieńczenia lizatu Granta-519 w celu znalezienia liniowego zakresu dynamicznego Bcl-2 i białka kontrolnego GAPDH. Zakres dynamiki dla Bcl-2 w tym teście wahał się od intensywności pasma prawie 0 do 7500 jednostek.Zakres dynamiki dla GAPDH wahał się od 3000 do 6500 jednostek. Immunoblot powtórzono z ekspozycjami w tym liniowym zakresie. Stosunek Bcl-2 do GAPDH obliczono dla każdej linii komórkowej.Test korelacji Pearsona wykazał, że współczynniki intensywności z immunoblottingu były silnie i dodatnio skorelowane z odczytami intensywności z ilościowego IF. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o naświetleniu końcowej membrany przez wiele punktów czasowych, aby znaleźć optymalną ekspozycję, w której wszystkie pasma znajdują się w odpowiednich zakresach liniowych. Po zweryfikowaniu ilościowego charakteru protokołu IF, można go zmodyfikować pod kątem multipleksu IF w rutynowo przetwarzanych próbkach tkanek w celu udzielenia odpowiedzi na pytania kliniczne, takie jak miejsce ekspresji białka docelowego.

quantitative-immunoblotting-cell-lines-as-standard-to-validate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Film demonstruje technikę western blottingu opartą na normalizacji całkowitego białka do ilościowego określania docelowej ekspresji białka w próbce. Wykorzystując całkowite barwienie białka w próbce, przeprowadza się analizę ratiometryczną w celu określenia względnego poziomu ekspresji białka docelowego.

Ilościowe Western Blot w celu oszacowania poziomów ekspresji białka

Tutaj opracowano nowatorski ilościowy test fluorescencyjny do pomiaru zmian poziomu białka szczególnie w centrosomach poprzez normalizację intensywności fluorescencji tego białka do odpowiedniego wzorca wewnętrznego.

Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Postęp western blottingu za pomocą fluorescencji pozwolił na wykrycie subtelnych zmian w ekspresji białek, umożliwiając analizy ilościowe. W tym miejscu opisujemy solidną metodologię wykrywania szeregu białek w różnych gatunkach i typach tkanek. Zapewniona jest również strategia przezwyciężania typowych problemów technicznych.

Przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym Western Blotting ze strategiami rozwiązywania problemów

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Ten protokół został opracowany do ilościowej identyfikacji składników mikrośrodowiska guza w resekcjach pacjentów z glejakiem przy użyciu immunohistochemii chromogennej i ImageJ.

Ilościowa immunohistochemia mikrośrodowiska komórkowego w resekcjach glejaka wielopostaciowego u pacjenta

Ta metoda opisuje solidne i powtarzalne podejście do porównywania poziomów białek w różnych tkankach i w różnych punktach czasowych rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego podejścia western blotting.

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) może być użyta do badania in vivo biodystrybucji przeciwciał i koniugatów przeciwciał do celów onkologicznych w organizmach żywych przy użyciu kombinacji metod celowania w nowotwory in vivo i barwienia immunologicznego ex vivo.

Lokalizacja immunofluorescencji in vivo do oceny terapeutycznej i diagnostycznej biodystrybucji przeciwciał w badaniach nad rakiem

Użycie podejścia opartego na RNA do określenia ilościowych profili immunologicznych tkanek guza litego i wykorzystania kohort klinicznych do odkrycia biomarkerów immunologicznych onkologicznych jest opisane za pomocą protokołów molekularnych i informatycznych.

Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

Prezentowany tutaj jest protokół generowania kontrolnych osadów komórkowych z utrwalonymi w formalinie, zatopionymi w parafinie dla immunohistochemii.

Standaryzowane przetwarzanie kontroli immunohistochemicznych osadów komórkowych utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Poznaj ilościowy immunoblotting linii komórkowych jako metodę walidacji immunofluorescencji do określania biomarkerów białkowych w próbkach FFPE. Technika ta wspiera precyzyjną diagnostykę onkologiczną i personalizację terapii.

Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowe immunoblotting linii komórkowych jako standard walidacji immunofluorescencji do ilościowego określania białek biomarkerowych w rutynowych próbkach tkanek

Przeglądaj więcej filmów