Test Dot Blot w celu ilościowego określenia genomu wirusa

Aby określić ilościowo DNA wirusa za pomocą testu igłowego, należy rozpocząć od izolowanej zawiesiny wirusowego DNA. Potraktuj roztworem alkalicznym, aby zdenaturować dwuniciowe DNA na pojedyncze nici w celu późniejszej hybrydyzacji.

Zmontuj aparat do igrania w kropki ze wstępnie zwilżoną membraną nylonową. Załaduj zdenaturowane DNA wirusa i zlinearyzowane standardowe roztwory plazmidowego DNA do studzienek. Zastosuj odpowiednią próżnię, ułatwiając skuteczny transfer jednoniciowego wirusowego DNA naładowanego ujemnie i wiążąc się z dodatnio naładowaną powierzchnią błony poprzez oddziaływania elektrostatyczne, tworząc wzory kropek.

Po przebiegu przemyj membranę buforem cytrynianu sodu, co pomaga poprawić czułość testu. Po wysuszeniu wystaw membranę na działanie światła ultrafioletowego, sieciując plamiste DNA z membraną.

Dodaj do błony zdenaturowany termicznie, nieheterologiczny fragment DNA i specyficzną dla genomu wirusa, radioaktywną zawiesinę sondy DNA znakowaną fosforem w buforze hybrydyzacyjnym. Inkubuj, ułatwiając hybrydyzację.

Fragmenty DNA działają jako środki blokujące, wiążąc się z pozostałymi regionami błony, minimalizując niespecyficzne wiązanie sondy. Radioaktywna sonda hybrydyzuje z komplementarną sekwencją na jednoniciowym DNA wirusa.

Przemyć buforem do mycia, aby usunąć niehybrydyzowane sondy. Korzystając z systemu skanowania obrazów luminoforowych, określ ilościowo sygnały radioaktywne emitowane przez sondy radioaktywne zhybrydyzowane z genomem wirusa na membranie, aby uzyskać sygnały dot blot.

Na podstawie krzywej standardowej intensywność sygnału każdej kropki na membranie można wykorzystać do obliczenia ilości wirusowego DNA w próbce.

Aby przeprowadzić test dot blot, należy przygotować wzorce plazmidowego DNA, rozcieńczając DNA plazmidu genomu wektora AAV do 10 nanogramów na mikrolitr w wodzie lub buforze Tris-HCl. Przenieść 25-mikrolitrową porcję rozcieńczonego plazmidowego DNA do świeżej probówki i poddać ją linearyzacji za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego w objętości reakcyjnej 50 mikrolitrów przez jedną godzinę.

Dodaj 450 mikrolitrów wody lub TE do probówki zawierającej wzorzec strawionego plazmidowego DNA i dokładnie wymieszaj. Następnie przenieś 70 mikrolitrów tej mieszaniny do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej z 1,330 mikrolitrami wody lub TE, aby uzyskać rozcieńczony wzorzec plazmidu.

Aby ustawić aparat do igłowania punktowego, za pomocą nożyczek przyciąć membranę do bibuły do rozmiaru odpowiedniego dla liczby próbek i wzorców. Namocz membranę w wodzie przez 10 minut, przed umieszczeniem jej na aparacie dot blot. Następnie przykryj nieużywane studnie. Dodaj wodę do studni, do których zostaną załadowane próbki. Zastosuj podciśnienie, przeciągnij wodę przez studzienki, sprawdź, czy nie ma błędów, a następnie ponownie dokręć. W razie potrzeby przetestuj ponownie.

Nałożyć 400 mikrolitrów każdego rozcieńczonego wzorca plazmidowego DNA do każdej studzienki i uruchomić cztery pasy standardowych rozcieńczeń. Użyj dwóch oddzielnych podwielokrotności standardowego skrótu i załaduj każdą z nich w dwóch egzemplarzach. Następnie nałóż 200 mikrolitrów na studzienkę każdej próbki DNA wirusa. Zastosuj delikatną próżnię, aby zebrać roztwory DNA przez studzienki. Następnie, gdy wszystkie studzienki zostaną opróżnione, uwolnij próżnię, regulując zawór trójdrogowy.

Dodaj 400 mikrolitrów roztworu alkalicznego 1X do każdej studzienki. Następnie odczekaj pięć minut przed ponownym zastosowaniem próżni w celu opróżnienia studzienek. Ponownie zastosuj próżnię i zdemontuj aparat do igłówek. Następnie zdejmij membranę i przepłucz ją 2X SSC.

Umieść membranę na czystym ręczniku papierowym, stroną związaną z DNA skierowaną do góry, aby usunąć nadmiar buforu. Użyj odpowiedniego środka sieciującego UV, aby usieciować UV oplamione DNA z błoną. Membrana jest teraz gotowa do hybrydyzacji.

Umieść błonę w butelce do hybrydyzacji stroną związaną z DNA do góry. Przepłukać membranę 5 do 10 mililitrami wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego i wyrzucić bufor. Następnie dodaj 10 mililitrów wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego i umieść butelkę w obrotowym piekarniku do hybrydyzacji ustawionym na 65 stopni Celsjusza. Obracaj butelkę przez co najmniej pięć minut.

Szybko dodaj zdenaturowane DNA plemników i radioaktywną sondę do buforu hybrydyzacyjnego w butelce i potrząsaj nim przez 10 sekund, aby wymieszać. Włóż butelkę z powrotem do piekarnika o temperaturze 65 stopni Celsjusza i inkubuj ją obracając w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny.

Po zakończeniu hybrydyzacji zatrzymaj obrót, wyjmij butelkę do hybrydyzacji, a następnie wlej roztwór sondy radioaktywnej do 50-mililitrowej stożkowej rurki z szczelną zatyczką. Aby umyć membranę, dodaj 20 do 30 mikrolitrów wstępnie podgrzanego buforu do płukania do butelki hybrydyzacyjnej i obracaj ją przez pięć minut. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.

Po trzecim praniu wyjmij membranę z butelki do hybrydyzacji i ręcznikami papierowymi usuń nadmiar buforu z membrany. Następnie umieść membranę w przezroczystym plastikowym uchwycie na papier. Za pomocą licznika Geigera sprawdź sygnały radioaktywne na membranie.

[TRYLOWANIE]

Po wystawieniu wymazanego ekranu obrazowania luminoforowego na membranę, zeskanuj ekran za pomocą systemu skanowania obrazu luminoforowego i uzyskaj dane o intensywności sygnału każdej kropki.