Izolacja i hodowla mysich komórek Kupffera

Komórki Kupffera to makrofagi rezydentne zlokalizowane w sinusoidach wątroby, które pomagają chronić wątrobę przed infekcjami.

Aby wyizolować mysie komórki Kupffera, weź świeżo zebraną perfundowaną wątrobę myszy w naczyniu zawierającym podłoże. Etap perfuzji wątroby z kolagenazą trawi macierz zewnątrzkomórkową, powodując dysocjację komórek wątroby.

Rozerwij torebkę wątroby, aby uwolnić zdysocjowane komórki wątroby, w tym komórki miąższowe, PC i komórki niemiąższowe, NPC, w tym komórki Kupffera, komórki śródbłonka, komórki gwiaździste i pozostałe erytrocyty.

Filtruj, aby usunąć zanieczyszczenia. Przeprowadzić wirowanie różnicowe przy niskiej prędkości na filtracie, aby selektywnie osadzać komputery. Zebrać supernatant zawierający NPC. Odwirować w celu zagęszczenia komórek.

Ponownie zawiesić komórki w pożywce i ułożyć warstwę na nieciągłym izotonicznym gradiencie gęstości z dwiema warstwami pożywki gradientowej o różnej gęstości. Podczas wirowania komórki rozdzielają się na podstawie ich gęstości w stosunku do podłoża gradientowego.

Zbierz wzbogaconą warstwę NPC na skrzyżowaniu warstwy gradientu. Przenieść do probówki zawierającej podłoże i odwirować. Umieść ponownie zawieszonych NPC na wielodołkowej płytce.

W ciągu kilku minut komórki Kupffera w zawiesinie łatwo przylegają do powierzchni plastikowej studzienki, podczas gdy inne NPC pozostają w pożywce. Zastąp pożywkę świeżą pożywką, aby wspomóc wzrost komórek Kupffera.

Aby oczyścić komórki Kupffera, umieść jedną perfundowaną wątrobę na szalce Petriego z 15 mililitrami pożywki do izolacji komórek Kupffera. Za pomocą nożyczek lub pęsety rozerwij kapsułkę Glissona i uwolnij wszystkie komórki wątroby do pożywki. Przefiltrować roztwór przez sitko o średnicy 100 mikrometrów do probówki wirówkowej. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o sile 50 g w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez dwie minuty.

Komórki miąższowe będą znajdować się w osadzie, a komórki niemiąższowe będą w supernatanicie. Zebrać sklarowany osad w czystej probówce wirówkowej i wirować przy 50 g przez 2 minuty. Powtórz tę czynność, co daje w sumie 4 transfery i spiny.

Następnie odwirować supernatant o stężeniu 1 350 g przez 15 minut, aby osadzać komórki niemiąższowe. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach pożywki do izolacji komórek Kupffera. Dodać niemiąższowy roztwór komórek do nieciągłego gradientu izotonicznego 25/50%, uprzednio przygotowanego zgodnie z protokołem tekstowym, i odwirować przy 850 g przez 15 minut bez przyspieszania i przerwy.

Za pomocą 10-mililitrowej pipety serologicznej odessać około 12 mililitrów wzbogaconej frakcji Kupffera, która wydaje się mętna w obrębie 25% frakcji SIP w pobliżu granicy faz 25/50% SIP. Przenieś komórki do probówki wirówkowej zawierającej od 35 do 40 mililitrów pożywki do izolacji komórek Kupffera i delikatnie wymieszaj. Następnie odwirować w temperaturze 1,350 g i 4 stopnie Celsjusza, aby granulować komórki.

Wyrzuć supernatant i użyj od 5 do 10 mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża do ponownego zawieszenia komórek. Za pomocą hemocytometru policz komórki i użyj barwienia błękitem trypanowym, aby zmierzyć żywotność. Oczyszczone komórki niemiąższowe należy umieścić na płytkach 24-dołkowych, o gęstości 5 x 10⁵ komórek na dołek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 30 minut. Następnie delikatnie usuń podłoże.

Użyj wstępnie podgrzanego HBSS do umycia komórek i zastąp go 500 mikrolitrami na studzienkę świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych Kupffera.