Wizualizacja rekombinowanych kompleksów DNA i białek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Ogólnym celem tej procedury jest obrazowanie biomolekuł, takich jak DNA i białka w wodnych, w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie biomolekuł do obrazowania. Następnie ustawiany jest mikroskop sił atomowych i ustawiana jest sonda wspornikowa FM.

Powierzchnia próbki i interesujące biomolekuły są następnie obrazowane i analizowane. Ostatecznie za pomocą mikroskopii sił atomowych można uzyskać wyniki, które pokazują ogólną wielkość, ilość i organizację DNA i białek oraz heterogenicznych kompleksów biomolekularnych w warunkach buforowych. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć klientowi na kluczowe pytania w dziedzinie molekularnych białek opiekuńczych, takie jak geometria STO kompleksu białek opiekuńczych i opiekuńczych.

Białko Wizualna demonstracja tej metody jest korzystna, ponieważ etapy przygotowania sondy dźwigniowej A FM i Kent mogą być trudne do nauczenia się z drukowanych instrukcji, głównie ze względu na zawiłości związane z ich fizyczną manipulacją. Procedurę zademonstrują Morgan Shannon i John Gertz, dwaj studenci z mojego laboratorium, aby rozpocząć izolowanie cząsteczek białka lub DNA, które mają być zobrazowane i zawiesić je w wodnym buforze. Po potwierdzeniu czystości próbki, inkubować ją w buforze absorpcyjnym FM na lodzie, aby ułatwić przyleganie próbki do miki.

W przypadku próbek białek należy użyć 10-milimolowego buforu na sterty. A dla buforu DNAA zawierającego magnez składającego się z 10 milimolowych trisów, pH 7,5 10-milimolowy chlorek sodu, dwumilimolowy chlorek magnezu jest odpowiedni do zamontowania sondy A FM. Umieść uchwyt sondy z komórką cieczową na odpowiedniej stacji dokującej do instalacji wspornikowej.

Zlokalizuj długą, grubą kantylację ostrej sondy dźwigni azotkowej, która ma być używana do obrazowania. Ostrożnie przenieś go do uchwytu sondy z płynnymi komórkami, upewniając się, że końcówka pozostaje w pozycji pionowej. Następnie zbadaj wspornik pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że jest nienaruszony i prawidłowo osadzony w uchwycie sondy z płynnymi komórkami.

Następnie ostrożnie wyjmij głowicę FM z zespołu jaskółczego ogona instrumentu, dokręcając zaciskową głowicy neuronowej. Odwróć głowicę FM i mocno dociśnij uchwyt sondy z ogniwami cieczowymi do czterech styków u podstawy głowicy FM. Na koniec ostrożnie włóż głowicę FM do instrumentu montażu ogona.

Aby dodatkowo przygotować FM przed obrazowaniem próbek, przesuń pokrętła wbudowanego mikroskopu świetlnego, aby zlokalizować końcówkę wspornika, wyreguluj strzałki w górę iw dół kontrolera optyki w oprogramowaniu, aby ustawić ostrość końcówki wspornika. Użyj pokręteł regulacji lasera, aby wyrównać laser z końcówką wspornika. Jest to jeden z najtrudniejszych technicznie kroków w protokole: pozycjonowanie odbywa się ręcznie i wymaga precyzyjnej regulacji pokrętła.

Dokładne monitorowanie lasera w miejscu odbicia i w miejscu oświetlenia zwiększa prawdopodobieństwo pomyślnego wyrównania. Następnie wyreguluj pokrętła detektora zdjęć na głowicy FM, aby wyśrodkować detektor zdjęć. Umieść świeżo rozcięty arkusz MICA przymocowany do metalowego dysku próbki FM na namagnesowanym uchwycie próbki na górze płytki uchwytu FM.

Obróć płytkę uchwytu FM tak, aby krążek próbki był ustawiony do wstępnego obrazowania. Użyj sterowania powierzchnią ostrości w oprogramowaniu instrumentu, aby przesunąć głowicę FM w dół w kierunku powierzchni dysku próbki MICA. Dopóki wyraźne cechy na powierzchni MICA lub odbicie końcówki nie będą ostre, wybierz ikonę strojenia w oprogramowaniu instrumentu i dostrój wspornik.

Częstotliwość rezonansowa zalecanych sond MSNL lub SNL wynosi od 20 do 60 kiloherców. Wybierz 5% przesunięcia szczytu, aby zobrazować próbkę MICA. Najpierw przyłóż sondę do powierzchni MICA, ustaw początkowy rozmiar skanowania na 10 mikrometrów, a szybkość skanowania na jeden herc.

Uchwyć pełne obrazy skanowania pola o wielkości 10 mikrometrów. Następnie zmniejsz rozmiar skanu do pięciu jeden i 0,5 mikrometra i uchwyć pełne obrazy każdego pola. Odłącz sondę, klikając raz ikonę odłączania w oprogramowaniu przyrządu.

Aby zobrazować interesujące nas biomolekuły, wymieszaj pięć mikrolitrów przygotowanej próbki z 45 mikrolitrami świeżego buforu absorpcyjnego. Ostrożnie dodać 50 mikrolitrów roztworu zawierającego biomolekułę o stężeniu 0,5 mikrograma na mililitr bezpośrednio na powierzchnię MICU. Zatrzymaj się na pięć minut, aby biomolekuły w próbce przylgnęły do powierzchni Micah'a.

Następnie odpipetować dodatkowe 50 do 100 mikrolitrów buforu absorpcyjnego do uchwytu sondy z płynnymi komórkami. Uważając, aby nie dotknąć końcówki pipety sondy, głowicy FM lub MICA, wyreguluj fotodetektor i w razie potrzeby ustaw laser na wsporniku. Następnie użyj oprogramowania przyrządu, aby ponownie włączyć sondę.

Zwiększ rozmiar skanowania, aby zidentyfikować obszary zainteresowania. Po zakończeniu obrazowania kilkakrotnie wybierz ikonę wycofania w oprogramowaniu instrumentu, aby odłączyć sondę. Na koniec użyj wody destylowanej, aby dokładnie wypłukać uchwyt sondy z płynną komórką i krążek próbki.

Następnie spróbuj tego ze sprężonym powietrzem. Przykładowy obraz A FM jest pokazany tutaj. Substrat miki zapewnia molekularnie płaską powierzchnię, na którą DNA i białko mogą się wchłonąć.

Obrazowanie MICA przed próbkami biomolekuł zapewnia kontrolę negatywną i ocenę szumu obrazowania. Zapewnia również pewien poziom pewności, że wspornik jest odpowiednio dostrojony, a późniejsze obrazowanie próbki zakończy się sukcesem. Dwuniciowe DNA plazmy, przypuszczalnie super zwinięte, jest łatwo identyfikowane po jego asymetrycznym wyglądzie i równomiernym osadzaniu się na wcześniej niepozornym podłożu Micah.

Kompleksy białkowe o dyskretnych rozmiarach cząstek są również jednoznacznie odróżnialne od substratu Micah. Różnice w wielkości cząstek wskazują na niejednorodność próbki i mogą być przydatne do przybliżania białka, złożonej geometrii stoickiej lub aktywności biochemicznej. Zaobserwowano ogólny kształt przekątnej i stałą orientację cząstek białka.

Oto artefakt obrazowania, ponieważ białka zgodnie z oczekiwaniami byłyby zorientowane na podłożu Micheasza w losowy sposób. Możliwe przyczyny zaobserwowanego artefaktu lub nieprawidłowości fizycznej końcówki lub obrazowania FM przy dwóch szybkościach skanowania, podczas gdy splot końcówki uniemożliwia bezwzględne obliczenia pomiaru długości w pomiarze wysokości osi x i y lub osi Z i względnych pomiarach X i Y, mogą być jednak przydatne do oszacowania właściwości biofizycznych obrazowanych biomolekuł. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dokładnym dostrojeniu wspornika i wyrównaniu fotodetektora Postępując zgodnie z tą podstawową procedurą FM.

Inne kroki, w tym użycie komórki płynu do wymiany buforu, można dodać, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zdolność molekularnych białek opiekuńczych do wpływania na uwalnianie receptorów steroidowych z ich elementów odpowiedzi DNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak obrazować białka DNA i kompleksy biomolekularne za pomocą mikroskopii sił atomowych w warunkach buforowych.