Kwantyfikacja mediatorów stanu zapalnego w zakażonych komórkach pochodzących z tkanek ludzkich

Podczas infekcji aktywowane limfocyty uwalniają mediatory stanu zapalnego – cytokiny – w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej.

Aby określić ilościowo mediatory stanu zapalnego w zakażonej tkance, należy rozpocząć od zawiesiny komórkowej zawierającej ludzkie komórki odpornościowe pochodzące z tkanki płucnej.

Inkubuj komórki z Haemophilus influenzae — bakterią chorobotwórczości układu oddechowego. Antygeny powierzchniowe bakterii oddziałują z receptorami rozpoznawania wzorców na fagocytarnych komórkach odpornościowych. Inicjuje to internalizację bakterii, przetwarzanie na mniejsze peptydy i prezentację peptydu przez główną cząsteczkę kompleksu zgodności tkankowej.

Cząsteczka antygenu MHC-II na komórkach fagocytarnych wiąże się z limfocytami T poprzez receptory limfocytów T, wraz z kostymulującymi interakcjami receptorów, co powoduje aktywację limfocytów T i produkcję cytokin prozapalnych.

Potraktuj komórki blokerami Golgiego, upośledzając uwalnianie cytokin - powodując ich akumulację wewnątrz komórek. Umyj komórki buforem blokującym, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania.

Wybarwić zawiesinę komórkową mieszanką przeciwciał znakowanych fluoroforem, które wiążą się specyficznie z ludzkimi markerami powierzchniowymi limfocytów T, umożliwiając znakowanie limfocytów.

Napraw komórki i przeniknij je środkiem powierzchniowo czynnym tworzącym pory. Inkubuj permeabilizowane komórki z przeciwciałami antycytokinowymi znakowanymi fluoroforem, które dostają się do komórek i wchodzą w interakcje ze specyficznymi cytokinami.

Za pomocą cytometrii przepływowej zmierz sygnał fluorescencji cytokin w znakowanych limfocytach, korelujący z wytwarzaniem mediatorów stanu zapalnego w wyniku infekcji bakteryjnej.

Pokrój około 20 do 40 gramów próbki po lobektomii na sekcje o objętości od 3 do 5 milimetrów sześciennych. Umieść je w sterylnej komorze o pojemności 50 mikrolitrów, a tkankę mechanicznie rozdrobnij za pomocą odpowiedniego deagregatora. Po dezagregacji tkanek poddać lizie czerwone krwinki, jak pokazano, i ponownie zawiesić komórki w sterylnym RPMI. Następnie przefiltruj komórki przez sterylną siatkę nylonową o długości 100 mikrometrów i policz liczbę żywotnych komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego.

W teście infekcji należy ponownie zawiesić komórki płuc w RPMI do końcowego stężenia 4 milionów komórek na mililitr na probówkę. Następnie zainfekuj komórki przy MOI 100 bakterii na komórkę. Poluzuj nasadkę o pół obrotu, aby umożliwić przepływ gazu w rurkach. Umieść komórki w rotatorze probówkowym i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza, obracając się z prędkością 12 obr./min. Godzinę po stymulacji dodać Brefeldin A, aby zapobiec zewnątrzkomórkowemu eksportowi cytokin, i inkubować zawiesiny komórkowe przez kolejne 16 do 22 godzin z rotacją.

Następnego dnia przemyć zawiesinę komórkową 500 mikrolitrami PBS zawierającego 1% albuminy surowicy bydlęcej i 0,01% azydku sodu. Następnie pozostań w zawiesinie komórek dla określonych markerów powierzchni ludzkich komórek limfocytów przez godzinę. Następnie umyj komórki PBS i utrwal je i przepuszczalność, jak pokazano wcześniej. Następnie inkubuj komórki z wewnątrzkomórkowymi przeciwciałami barwiącymi cytokiny przez godzinę. Następnie umyj komórki i ponownie zawieś je w 100 mikrolitrach PBS, przed pobraniem danych na cytometrze przepływowym.