JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Immunologia
0 wyświetleń • 3:11 min. • July 8th, 2025
Aby określić ilościowo bioaktywne interferony typu I, takie jak interferon-alfa i interferon-beta, w próbce testowej, należy pobrać płytkę wielodołkową zawierającą zmodyfikowane komórki reporterowe. Komórki te wyrażają wydzielaną embrionalną fosfatazę alkaliczną, SEAP, gen reporterowy pod kontrolą promotora indukowanego interferonem-alfa i beta.
Dodać badaną próbkę zawierającą nieznane stężenie interferonu typu I. Pipetować różne stężenia interferonu typu I u ludzi do innych studzienek, które działają jak standardowe kontrole. Inkubować.
Interferon typu I w teście dobrze wiąże się ze specyficznym receptorem powierzchniowym komórki, aktywując kinazy janusowe. Te kinazy białkowe fosforylują przetworniki sygnału i aktywatory transkrypcji, STAT, białka, które dimeryzują i tworzą kompleks ze specyficznym czynnikiem regulatorowym interferonu.
Po dostaniu się do jądra kompleks wiąże się ze specyficzną sekwencją DNA w indukowanym interferonem-alfa i beta promotorze, aktywując transkrypcję genu SEAP i wytwarzając enzymy SEAP, które są wydzielane do pożywki.
Przenieść pożywki zawierające SEAP do wielodołkowych studzienek płytkowych z substratem specyficznym dla SEAP. SEAP hydrolizuje różowe podłoże, wytwarzając produkt o fioletowo-niebieskim kolorze.
Za pomocą czytnika mikropłytek zmierzyć absorbancję produktu w studzience testowej i wzorcowej, wskazując poziomy SEAP i stężenie interferonu typu I.
Z wykreślonej wzorcowej krzywej interferonu typu I oznaczyć stężenie bioaktywnego interferonu typu I w badanej próbce.
Aby zmierzyć bioaktywny interferon typu I za pomocą komórek reporterowych interferonu alfa/beta HEK-Blue, najpierw płytkujemy komórki reporterowe o gęstości 50 000 komórek na dołek w 96-dołkowej płaskiej płytce dennej do końcowej objętości 180 mikrolitrów. Następnie dodaj 20 mikrolitrów właśnie zebranego supernatantu z kokultury do każdej studzienki w dwóch egzemplarzach. Dołącz zestaw wewnętrznych wzorców kontrolnych i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 18 do 22 godzin.
Aby określić poziomy fosfatazy alkalicznej uwalnianej z komórek reporterowych, dodaj 180 mikrolitrów roztworu QUANTI-Blue do każdego dołka nowej płytki o płaskim dnie. Następnie dodaj 20 mikrolitrów indukowanych supernatantów komórek interferonu HEK-blue alfa / beta do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż kolor rozwinie się w standardowych studzienkach kontrolnych interferonu.
Roztwór QUANTI-Blue zmienia kolor z różowego na fioletowo-niebieski w obecności enzymu. Na koniec użyj spektrofotometru, aby ocenić poziomy wydzielanej fosfatazy alkalicznej w odległości od 620 do 655 nanometrów i określić stężenie interferonu typu I przez ekstrapolację z liniowej części krzywej wzorcowej interferonu.