Oznaczanie ilościowe bioaktywnych interferonów typu I przy użyciu testu reporterowego wydzielanej embrionalnej fosfatazy alkalicznej

0 views • 3:11 min • July 8th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby określić ilościowo bioaktywne interferony typu I, takie jak interferon-alfa i interferon-beta, w próbce testowej, należy pobrać płytkę wielodołkową zawierającą zmodyfikowane komórki reporterowe. Komórki te wyrażają wydzielaną embrionalną fosfatazę alkaliczną, SEAP, gen reporterowy pod kontrolą promotora indukowanego interferonem-alfa i beta.

Dodać badaną próbkę zawierającą nieznane stężenie interferonu typu I. Pipetować różne stężenia interferonu typu I u ludzi do innych studzienek, które działają jak standardowe kontrole. Inkubować.

Interferon typu I w teście dobrze wiąże się ze specyficznym receptorem powierzchniowym komórki, aktywując kinazy janusowe. Te kinazy białkowe fosforylują przetworniki sygnału i aktywatory transkrypcji, STAT, białka, które dimeryzują i tworzą kompleks ze specyficznym czynnikiem regulatorowym interferonu.

Po dostaniu się do jądra kompleks wiąże się ze specyficzną sekwencją DNA w indukowanym interferonem-alfa i beta promotorze, aktywując transkrypcję genu SEAP i wytwarzając enzymy SEAP, które są wydzielane do pożywki.

Przenieść pożywki zawierające SEAP do wielodołkowych studzienek płytkowych z substratem specyficznym dla SEAP. SEAP hydrolizuje różowe podłoże, wytwarzając produkt o fioletowo-niebieskim kolorze.

Za pomocą czytnika mikropłytek zmierzyć absorbancję produktu w studzience testowej i wzorcowej, wskazując poziomy SEAP i stężenie interferonu typu I.

Z wykreślonej wzorcowej krzywej interferonu typu I oznaczyć stężenie bioaktywnego interferonu typu I w badanej próbce.

Aby zmierzyć bioaktywny interferon typu I za pomocą komórek reporterowych interferonu alfa/beta HEK-Blue, najpierw płytkujemy komórki reporterowe o gęstości 50 000 komórek na dołek w 96-dołkowej płaskiej płytce dennej do końcowej objętości 180 mikrolitrów. Następnie dodaj 20 mikrolitrów właśnie zebranego supernatantu z kokultury do każdej studzienki w dwóch egzemplarzach. Dołącz zestaw wewnętrznych wzorców kontrolnych i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 18 do 22 godzin.

Aby określić poziomy fosfatazy alkalicznej uwalnianej z komórek reporterowych, dodaj 180 mikrolitrów roztworu QUANTI-Blue do każdego dołka nowej płytki o płaskim dnie. Następnie dodaj 20 mikrolitrów indukowanych supernatantów komórek interferonu HEK-blue alfa / beta do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż kolor rozwinie się w standardowych studzienkach kontrolnych interferonu.

Roztwór QUANTI-Blue zmienia kolor z różowego na fioletowo-niebieski w obecności enzymu. Na koniec użyj spektrofotometru, aby ocenić poziomy wydzielanej fosfatazy alkalicznej w odległości od 620 do 655 nanometrów i określić stężenie interferonu typu I przez ekstrapolację z liniowej części krzywej wzorcowej interferonu.

06:46

Izolacja egzosomów z osocza osób zakażonych wirusem HIV-1

Related Videos

0 Views

06:09

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Related Videos

0 Views

07:55

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

Related Videos

0 Views

09:13

Wykorzystanie genetyki odwrotnej do manipulowania genem NS wirusa gorączki doliny Rift szczepu MP-12 w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności szczepionek

Related Videos

0 Views

13:41

Zastosowanie testu immunopunktowego sprzężonego z interferonem-γ do scharakteryzowania nowych epitopów komórek T wirusa brodawczaka ludzkiego

Related Videos

0 Views

10:48

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Related Videos

0 Views

08:04

Opracowanie testu ELISpot IFN-γ do oceny odporności komórkowej specyficznej dla wirusa ospy wietrznej i półpaśca po przeszczepieniu krwi pępowinowej

Related Videos

0 Views

10:00

Wysokoprzepustowy ilościowy test RT-PCR w czasie rzeczywistym do określania profili ekspresji podtypów interferonu typu I i III

Related Videos

0 Views

11:44

Metoda wysokiej rozdzielczości do monitorowania aktywacji IRF3 zależnej od fosforylacji

Related Videos

0 Views

09:35

Opracowanie systemu zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B w celu monitorowania wczesnych etapów cyklu replikacji

Related Videos

0 Views

Last updated: 4 July 2026