Wykrywanie wiązania witronektyny z powierzchniami bakteryjnymi za pomocą cytometrii przepływowej

Weźmy probówki cytometru przepływowego zawierające dzikie i zmutowane szczepy Haemophilus influenzae, typu f.

Odpipetować bufor zawierający białka blokujące i witronektynę. Inkubować.

Białka blokujące redukują niespecyficzne interakcje na powierzchni bakterii, podczas gdy cząsteczki witronektyny wiążą się z białkiem H, białkiem wiążącym witronektynę, na powierzchniach bakterii typu dzikiego. W zmutowanym szczepie witronektyna nie wiąże się z powodu braku białka H.

wirówka. Usuń niezwiązaną witronektynę i białka blokujące.

Dodać bufor zawierający pierwszorzędowe przeciwciała anty-witronektyny, które specyficznie wiążą się z witronektyną przyczepioną do powierzchni bakterii typu dzikiego.

Następnie wprowadź przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem, które wiążą się z pierwszorzędowymi przeciwciałami na witronektynie i ułatwiają wykrywanie witronektyny.

wirówka. Usuń niezwiązane przeciwciała drugorzędowe. Ponownie zawieś bakterie w buforze.

Wykonaj cytometrię przepływową, aby określić wiązanie witronektyny z powierzchnią bakterii.

Porównaj sygnały fluorescencji szczepów typu dzikiego i zmutowanego. Przesunięcie sygnału fluorescencyjnego u bakterii typu dzikiego potwierdza wiązanie witronektyny z powierzchnią bakterii.

Aby przygotować się do cytometrii przepływowej, należy ponownie zawiesić osady bakteryjne za pomocą 50 mikrolitrów buforu blokującego zawierającego 250 nanomolowych witronektyny. Następnie inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Po inkubacji osadzać bakterie przez odwirowanie przy 3,500 x g przez 5 minut. Następnie umyj granulki trzy razy za pomocą PBS i podobnych etapów wirowania.

Po umyciu dodać 50 mikrolitrów pierwotnych przeciwciał poliklonalnych przeciwko ludzkiej witronektynie owcom do osadu bakteryjnego, w rozcieńczeniu od 1 do 100 w PBS/BSA. Inkubować zawiesinę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj bakterie trzykrotnie PBS, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów PBS / BSA zawierających poliklonalne przeciwciała poliklonalne przeciwko owcom skoniugowane izotiocyjanianem fluoresceiny do osadu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności. Na koniec, po trzech etapach mycia, ponownie zawieś osad bakteryjny za pomocą 300 mikrolitrów PBS i przeanalizuj za pomocą cytometrii przepływowej.