Trójwymiarowe ilościowe obrazowanie fazowe w celu scharakteryzowania podtypów limfocytów

Załaduj zawiesinę podtypu limfocytów do komory obrazowania.

Umieść komorę na stoliku mikroskopu do ilościowego obrazowania fazowego 3D.

Dostosuj parametry mikroskopu i płaszczyznę ogniskowej, aby uzyskać optymalne obrazowanie.

Podczas obrazowania limfocytów wiązka lasera rozdziela się na wiązki referencyjne i próbki.

Cyfrowe urządzenie do mikrozwierciadła, wyposażone w układ mikroluster na ścieżce wiązki próbki, umożliwia obracanie wiązki o 360 stopni wokół osi optycznej.

Każda wiązka przechodząca przez limfocyty ulega przesunięciu fazowemu w oparciu o zmiany współczynnika załamania światła w komórce.

Otrzymana próbka i wiązki referencyjne łączą się, tworząc hologram 2D.

Sekwencja hologramów zawierających informacje o fazie i amplitudzie pod różnymi kątami jest rejestrowana poprzez rotację wiązki wokół limfocytów.

Uzyskaj wiele hologramów tła o różnych kątach oświetlenia, z wyłączeniem limfocytów.

Korzystając z algorytmu tomografii dyfrakcyjnej, zrekonstruuj hologramy do tomogramu 3D z indeksem załamania światła, dostarczając informacji morfologicznych i biochemicznych limfocytów bez konieczności znakowania.

Aby uzyskać optymalne obrazowanie, rozcieńczyć każdą próbkę komórek do stężenia 180 komórek na mikrolitr pożywki RPMI i powoli wstrzyknąć 120 mikrolitrów pierwszej rozcieńczonej próbki do komory obrazowania. Po potwierdzeniu braku pęcherzyków w komorze umieść kroplę wody destylowanej na soczewce obiektywu mikroskopu ilościowego 3D i umieść komorę obrazowania na stoliku translacyjnym mikroskopu. Dostosuj stolik tak, aby próbka była wyrównana z soczewką obiektywu, a następnie kliknij przycisk Ostrość i Powierzchnia na karcie Kalibracja perspektywy mikroskopu w oprogramowaniu do obrazowania, aby dostosować odpowiednio pozycje osiowe obiektywu i soczewek kondensora.

Kliknij opcję Auto Mode (Tryb automatyczny), aby wyrównać obiektyw i soczewki kondensatora. Aby zoptymalizować wyrównanie, otwórz tryb skanowania i ręcznie wyreguluj soczewki, aby wyrównać wzór cyfrowego urządzenia mikrolustrzanego do środka. Następnie wróć do trybu normalnego i dostosuj etap translacji, aby zlokalizować komórkę w polu widzenia. Dostosuj położenie osiowe soczewki obiektywu, aby znaleźć płaszczyznę ogniskowej, aż granica próbki zwizualizowana na ekranie będzie prawie niewidoczna.

Ważne jest, aby idealnie dostosować ostrość komórki, aby wygenerować optymalny tomogram 3D RI. Jeśli obraz nie zostanie wykonany prawidłowo, rekonstrukcja 3D zostanie zaburzona, co spowoduje zaszumienie tomogramu.

Dostosuj etap translacji, aby znaleźć lokalizację bez komórki, a następnie kliknij przycisk Kalibruj, aby zmierzyć wiele hologramów 2D o różnych kątach oświetlenia. Dostosuj etap translacji, aby zlokalizować komórkę w środku pola widzenia, a następnie na karcie Akwizycja nazwij próbkę, która ma być obrazowana.

Kliknij opcję 3D Snapshot (Migawka 3D), aby zmierzyć hologramy komórki przy użyciu tych samych kątów oświetlenia, co w przypadku właśnie zmierzonych hologramów 2D. Gdy uzyskane dane pojawią się w panelu zarządzania danymi, kliknij prawym przyciskiem myszy dane, a następnie kliknij Procesuj, aby zrekonstruować tomogram 3D indeksu refrakcji na podstawie hologramów 2D przy użyciu algorytmu tomografii dyfrakcyjnej zaimplementowanego w oprogramowaniu do obrazowania. Po zobrazowaniu w panelu Zarządzanie danymi kliknij prawym przyciskiem myszy Dane i kliknij polecenie Otwórz, aby zwizualizować dane.

Kliknij środek komórki, aby zmienić jej położenie, a następnie kliknij opcję RI Tomogram w panelu Menedżer danych. Na karcie Preset (Ustawienia wstępne) kliknij przycisk Load (Załaduj) i kliknij dwukrotnie pozycję lymphocytes.xml, która jest wstępnie zdefiniowaną funkcją transferu udostępnianą przez oprogramowanie do obrazowania w celu wizualizacji tomogramu zgodnie z rozkładami wystąpień zarezerwowanych 3D. Przewiń myszą, aby powiększyć, i przeciągnij komórkę, aby obrócić ją w dowolnym kierunku.