Bezznacznikowa identyfikacja podtypów limfocytów przy użyciu trójwymiarowego ilościowego obrazowania fazowego i uczenia maszynowego

Metoda ta stanowi alternatywę dla konwencjonalnej procedury znakowania fluorescencyjnego i analizy cytometrii przepływowej, które są czasochłonne, kosztowne i wiążą się z ryzykiem zmiany funkcji komórkowej próbek. Główną zaletą tej techniki jest trójwymiarowa tomografia indeksu refrakcji i uczenie maszynowe, które są bezznacznikowymi i ilościowymi metodami, które umożliwiają szybką i dokładną identyfikację limfocytów. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii nowotworów krwi i chorób autoimmunologicznych, ponieważ identyfikacja limfocytów może mieć kluczowe znaczenie dla diagnozy choroby i odpowiedniego zastosowania leczenia.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w populacje limfocytów, można ją również zastosować do analizy innych pojedynczych komórek będących przedmiotem zainteresowania, w tym bakterii. Wizualna demonstracja technologii ilościowego obrazowania fazowego 3D ma kluczowe znaczenie, ponieważ ułatwia jasne instrukcje dotyczące wykonywania tej techniki i może zapewnić wgląd w jej zastosowania. Zacznij od zebrania każdego podzbioru limfocytów przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją.

Aby uzyskać optymalne obrazowanie, rozcieńczyć każdą próbkę komórek do stężenia 180 komórek na mikrolitr pożywki RPMI i powoli wstrzyknąć 120 mikrolitrów pierwszej rozcieńczonej próbki do komory obrazowania. Po potwierdzeniu braku pęcherzyków w komorze umieść kroplę wody destylowanej na soczewce obiektywu mikroskopu ilościowego 3D i umieść komorę obrazowania na stoliku translacyjnym mikroskopu. Dostosuj stolik tak, aby próbka wyrównała się z soczewką obiektywu, a następnie kliknij ostrość i powierzchnia na karcie kalibracji perspektywy mikroskopu w oprogramowaniu do obrazowania, aby dostosować pozycje osiowe odpowiednio soczewek obiektywu i kondensatora.

Kliknij opcję Auto mode (Tryb automatyczny), aby wyrównać obiektyw i soczewki kondensatora. Aby zoptymalizować wyrównanie, otwórz tryb skanowania i ręcznie wyreguluj soczewki, aby wyrównać wzór cyfrowego urządzenia z mikrolustrem do środka. Następnie wróć do trybu normalnego i dostosuj etap translacji, aby zlokalizować komórkę w polu widzenia.

Dostosuj położenie osiowe soczewki obiektywu, aby znaleźć płaszczyznę ogniskową, aż granica próbki zwizualizowana na ekranie będzie prawie niewidoczna. Ważne jest, aby idealnie dostosować ostrość komórki, aby wygenerować optymalny tomogram 3DRI. Jeśli obraz nie zostanie wykonany prawidłowo, rekonstrukcja 3D zostanie zaburzona, co spowoduje zaszumienie tomogramu.

Dostosuj etap translacji, aby znaleźć lokalizację bez komórki, a następnie kliknij przycisk Kalibruj, aby zmierzyć wiele hologramów 2D o różnych kątach oświetlenia. Dostosuj etap translacji, aby zlokalizować komórkę w środku pola widzenia. Na karcie Pozyskiwanie nazwij próbkę, która jest obrazowana.

Kliknij opcję 3D Snapshot (Migawka 3D), aby zmierzyć hologramy komórki przy użyciu tych samych kątów oświetlenia, co w przypadku właśnie zmierzonych hologramów 2D. Gdy uzyskane dane pojawią się w panelu Zarządzanie danymi, kliknij je prawym przyciskiem myszy, a następnie kliknij przycisk Przetwarzaj, aby zrekonstruować tomogram 3D z hologramów 2D przy użyciu algorytmu tomografii defrakcyjnej zaimplementowanego w oprogramowaniu do obrazowania. Po zobrazowaniu w panelu Zarządzanie danymi kliknij dane prawym przyciskiem myszy, a następnie kliknij przycisk Otwórz, aby wyświetlić dane.

Kliknij środek komórki, aby zmienić jej położenie, a następnie kliknij opcję RI Tomogram w panelu Menedżer danych. Na karcie Preset (Ustawienie wstępne) kliknij przycisk Load (Załaduj) i kliknij dwukrotnie pozycję lymphocyt (limfocyt). xml, który jest predefiniowaną funkcją transferu dostarczaną przez oprogramowanie do obrazowania w celu wizualizacji tomogramu zgodnie z rozkładami 3DRI.

Przewiń myszą, aby powiększyć i przeciągnij komórkę, aby obrócić ją w dowolnym kierunku. W celu ilościowej ekstrakcji cech morfologicznych i biochemicznych umieść wszystkie dane tomograficzne w jednym folderze i podziel typy komórek w poszczególnych podfolderach w folderze głównym. Następnie otwórz plik ekstrakcji cech uzupełniających w odpowiednim oprogramowaniu do obrazowania i edytuj linię 14, aby wyznaczyć folder tomogramu, z którego mają zostać wyodrębnione dane.

Edytuj wiersz 15, aby wyznaczyć folder, w którym mają zostać zapisane wyodrębnione dane elementu i wykonać kod. Dla każdego tomogramu w zbiorze danych kod obliczy powierzchnię, objętość komórkową, sferyczność, gęstość białka i suchą masę na próg współczynnika załamania światła. W przypadku uczenia nadzorowanego i identyfikacji użyj prostego algorytmu podziału losowego w programie MATLAB, aby losowo podzielić wyodrębnione dane funkcji na osobne foldery zestawu treningowego i testowego.

Otwórz dodatkowy plik treningowy i edytuj wiersz 14, aby wyznaczyć folder zestawu treningowego, wiersz 16, aby wyznaczyć folder do zapisywania wytrenowanego klasyfikatora, a wiersz 17, aby ustawić nazwę pliku dla klasyfikatora. Następnie wykonaj kod. Korzystając z wybranych cech zestawu treningowego, kod wytrenuje klasyfikator za pomocą algorytmu K najbliższego sąsiada i zapisze klasyfikator w wyznaczonym folderze.

Następnie otwórz dodatkowy plik testowy trzy i edytuj wiersze od 14 do 15, aby wyznaczyć wytrenowany klasyfikator do testowania, oraz wiersz 17, aby wyznaczyć wytrenowany zestaw testów. Następnie wykonaj kod. Klasyfikator zidentyfikuje typy komórek poszczególnych limfocytów w zestawie testowym.

Tutaj pokazano reprezentatywne tomogramy limfocytów B z indeksem załamania światła renderowane w 3D limfocytów B, limfocytów T CD4-dodatnich i limfocytów T CD8-dodatnich o różnych schematach kolorów, przypisanych zgodnie z wartościami indeksu refrakcji przypisanymi za pomocą oprogramowania do obrazowania. Na podstawie wartości współczynnika załamania światła można obliczyć ilościowe cechy morfologiczne i biochemiczne. W tym eksperymencie dokładność klasyfikacji limfocytów T i B wynosiła odpowiednio 93,15% i 89,81% dla przypadków treningowych i testowych.

Limfocyty T CD4 dodatnie i CD8-dodatnie zostały sklasyfikowane statystycznie, a dokładność wynosiła odpowiednio 87,41% i 84,38% dla zestawów treningowych i testowych. Wreszcie, dokładność wieloklasowego klasyfikatora typu komórkowego wyniosła odpowiednio 80,65% i 75,93% odpowiednio dla etapów szkolenia i testu. Jakość i liczba obrazów mają zasadnicze znaczenie dla sukcesu tej techniki.

Im lepsza jakość obrazu i im większa ilość danych, tym lepsza dokładność identyfikacji. Głębokie uczenie może być wykorzystane do pełniejszej analizy złożonych danych tomogramów, co znacznie zwiększa wydajność identyfikacji. Ponadto fluorescencja i ilościowe obrazowanie fazowe 3D mogą być wykorzystane do zbadania ścieżki fizjologicznych ról zidentyfikowanych limfocytów.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii komórki i biomedycyny do badania konkretnych chorób będących przedmiotem zainteresowania w obrębie różnych organizmów. Rzeczywiście, w szczególności immunolodzy mogą odnieść korzyści z wykorzystania tej nowej technologii do identyfikacji populacji będącej przedmiotem zainteresowania.