Name: Bezznacznikowa identyfikacja podtypów limfocytów przy użyciu trójwymiarowego ilościowego obrazowania fazowego i uczenia maszynowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj bezbarwną identyfikację podtypów limfocytów przy użyciu trójwymiarowej tomografii wskaźnika załamania światła i uczenia maszynowego. Ta metoda oferuje szybką i dokładną alternatywę dla konwencjonalnych technik fluorescencyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program KAIST BK21+, Tomocube, Inc. i Narodową Fundację Badawczą Korei (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018K000396). Y. Jo dziękuje za wsparcie ze strony Stypendium Prezydenckiego KAIST i Stypendium Nauk Biomedycznych Fundacji Asan.

Opieka nad zwierzętami i procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt KAIST (KA2010-21, KA2014-01 i KA2015-03). Wszystkie eksperymenty w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.
1. Izolacja limfocytów z krwi myszy
<ol>
	<li>Po uśpieniu myszy C57BL/6J poprzez inhalację CO2 należy wprowadzić igłę 26-G do serca myszy i pobrać 0,3 ml krwi. Bezpośrednio umieścić krew w probówce ze 100 j./ml roztworu heparyny rozcieńczonym 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). 
	UWAGA: Alternatywnie można wyizolować limfocyty ze śledziony.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml buforu lizującego chlorek amonu i potas do probówki i delikatnie odwrócić go kilka razy, aby wymieszać roztwór.</li>
	<li>Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 4,5 ml PBS i dwukrotnie odwirowując przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl świeżej pożywki RPMI-1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
	<li>Dodać 0,1 μg przeciwciała CD16/32 (2,4G2) do probówki w celu zablokowania.</li>
	<li>Trzymaj probówkę na lodzie.</li>
</ol>
2. Cytometria przepływowa i sortowanie podtypów limfocytów
UWAGA: Sortowanie limfocytów w zależności od typu komórki jest niezbędne do ustalenia podstawowych (tj. prawidłowych) etykiet typów komórek do trenowania i testowania klasyfikatora typów komórek w nadzorowanym uczeniu. Cytometria przepływowa, złoty standard, służy do identyfikacji i rozdzielania limfocytów42.
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę przeciwciał barwiących markery powierzchniowe w 100 μl świeżej pożywki RPMI-1640 [z 10% FBS, 0,1 μg CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D3), CD45R (B220, RA3-6B2) i NK1.1 (PK136)] oraz 0,25 μg przeciwciał CD4 (GK1,5) do docelowych limfocytów T, B, CD4+ i CD8+</li>.
	<li>Dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał do zawiesiny komórek (otrzymanej w kroku 1.8).</li>
	<li>Inkubować przez 25 minut na lodzie.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 5 ml PBS i dwukrotnie odwirowując przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 5 ml świeżej pożywki RPMI-1640 z 10% FBS i 2,5 μg DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol).</li>
	<li>Zebrać każdy typ limfocytów oddzielnie za pomocą cytometrii przepływowej, używając poziomów fluorescencji markerów opisanych powyżej. Jednocześnie wykluczaj martwe komórki za pomocą sygnałów DAPI. 
	UWAGA: Szczegółowe protokoły dotyczące sortowania komórek na podstawie cytometrii przepływowej zostały opisane wcześniej42.</li>
</ol>
3. 3D Ilościowe obrazowanie fazowe
<ol>
	<li>Trzymaj posortowane limfocyty na lodzie przez cały czas trwania procedur obrazowania, które powinny zostać zakończone w ciągu 5 godzin (od momentu izolacji limfocytów od myszy), aby uniknąć uszkodzenia komórek i zmian biochemicznych.</li>
	<li>Wybierz posortowany typ komórek (spośród limfocytów T B, CD4+ T i CD8+) i rozcieńczyć próbkę (uzyskaną w kroku 2.6) do 180 komórek/μl za pomocą pożywki RPMI w celu uzyskania optymalnych warunków obrazowania (tj. jedna komórka na pojedyncze pole widzenia).</li>
	<li>Załadować 120 μl rozcieńczonej próbki do komory obrazowania przez powolne wstrzykiwanie. Dokładnie sprawdzić obecność pęcherzyków w komorze obrazowania z próbką. Jeśli są bąbelki, ostrożnie je usuń, ponieważ pogorszą jakość pomiarów.</li>
	<li>Uzyskaj tomogramy 3D RI za pomocą komercyjnego ilościowego mikroskopu fazowego 3D lub holotomografii oraz oprogramowania do obrazowania. 
	UWAGA: Szczegółowe informacje na temat konfiguracji eksperymentalnej można znaleźć w oryginalnym manuskrypcie5.
	<ol>
		<li>Umieść kroplę wody destylowanej na soczewce obiektywu mikroskopu.</li>
		<li>Umieść komorę obrazowania z próbką na stoliku translacyjnym mikroskopu i dostosuj jej położenie tak, aby próbka zrównała się z soczewką obiektywu.</li>
		<li>Dostosuj pozycje osiowe soczewek obiektywu i kondensora, klikając odpowiednio Ostrość i Powierzchnia na karcie "Kalibracja" perspektywy "Mikroskop" w oprogramowaniu do obrazowania.</li>
		<li>Wyrównaj soczewki obiektywu i kondensatora, klikając przycisk Auto Mode (Tryb automatyczny). Możesz też użyć trybu skanowania i ręcznie wyregulować soczewki tak, aby wzorce oświetlenia były zlokalizowane w centralnym obszarze pola widzenia.</li>
		<li>Wróć do trybu normalnego i dostosuj etap translacji, aby zlokalizować komórkę w polu widzenia.</li>
		<li>Znajdź płaszczyznę ogniskowej, regulując położenie osiowe soczewki obiektywu. Idealne ogniskowanie sprawia, że granica próbki wizualizowana na ekranie jest prawie niewidoczna.</li>
		<li>Dostosuj etap tłumaczenia, aby znaleźć lokalizację bez komórki.</li>
		<li>Kliknij przycisk Kalibruj, aby zmierzyć wiele hologramów 2D o różnych kątach oświetlenia.</li>
		<li>Dostosuj etap translacji, aby zlokalizować komórkę w środku pola widzenia.</li>
		<li>Przejdź do zakładki "Akwizycja" i kliknij Migawka 3D, aby zmierzyć hologramy komórki o identycznych kątach oświetlenia, jak w kroku 3.4.8.</li>
		<li>Gdy pozyskane dane zostaną przedstawione w panelu "Zarządzanie danymi", kliknij prawym przyciskiem myszy na pozyskane dane i kliknij Procesuj, aby zrekonstruować tomogram 3D RI z hologramów zmierzonych w krokach 3.4.8 i 3.4.10, przy użyciu algorytmu tomografii dyfrakcyjnej9,10 zaimplementowanego w oprogramowaniu do obrazowania.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.4.5-3.4.11, aby zmierzyć więcej niż 100 komórek, aby zapewnić moc statystyczną dla uczenia maszynowego.</li>
		<li>Wszystkie obrazy, które są przetwarzane w kroku 3.4.11, mogą być wizualizowane. W panelu "Zarządzanie danymi" kliknij dane prawym przyciskiem myszy i kliknij polecenie Otwórz, aby je zwizualizować. Kliknij RI Tomogram w panelu "Menedżer danych". Na karcie "Preset" kliknij Załaduj i kliknij dwukrotnie "lymphocyte.xml", która jest predefiniowaną funkcją transferu dostarczaną przez oprogramowanie do obrazowania w celu wizualizacji tomogramu zgodnie z rozkładami 3D RI. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2-3.4, aby zmierzyć tomogramy 3D RI wszystkich podtypów limfocytów.</li>
</ol>
4. Ilościowa ekstrakcja cech morfologicznych i biochemicznych z tomogramów 3D RI
<ol>
	<li>Umieść wszystkie zmierzone powyżej dane tomograficzne w jednym folderze. Podziel typy komórek w podfolderach tego folderu. Przygotuj każdy tomogram tak, aby był pojedynczym plikiem .mat.</li>
	<li>Otwórz plik uzupełniający 1 — wyodrębnianie cech (napisany dla oprogramowania do przetwarzania obrazu).</li>
	<li>Edytuj wiersz 14, aby oznaczyć folder tomogramu przygotowany w kroku 4.1.</li>
	<li>Edytuj wiersz 15, aby wyznaczyć folder do zapisywania wyodrębnionych danych elementu.</li>
	<li>Opcjonalnie edytuj wiersz 17, aby dostosować parametry progu wystąpień zarezerwowanych dla wyodrębniania obiektów. Opcja domyślna to 20 progów wystąpień zarezerwowanych od 1,340 do 1,378, z przyrostem 0,002, zgodnie z wcześniejszym opisem5.</li>
	<li>Wykonaj kod. Dla każdego tomogramu w zbiorze danych kod oblicza pięć cech: pole powierzchni (SA), objętość komórkowa (CV), sferyczność (SI), gęstość białka (PD) i suchą masę (DM), na próg RI. Szczegółowe algorytmy wyodrębniania cech są opisane w innym miejscu5.</li>
	<li>Aby monitorować wyodrębnianie cech, podczas wykonywania sprawdź na ekranie wizualizację segmentacji komórek opartej na progach RI.</li>
	<li>Sprawdź wyodrębnione dane elementu, jako plik .mat na tomogram, zapisany w folderze wskazanym w kroku 4.4.</li>
</ol>
5. Nadzorowane uczenie i identyfikacja
<ol>
	<li>Losowo podziel dane funkcji uzyskane w kroku 4.8 na zestawy treningowe (70%) i testowe (30%) z oddzielnymi folderami.</li>
	<li>Otwórz plik uzupełniający 2 - Pociąg (napisany dla oprogramowania do przetwarzania obrazu).</li>
	<li>Edytuj wiersz 14, aby oznaczyć zestaw treningowy przygotowany w kroku 5.1.</li>
	<li>Edytuj wiersz 16, aby wyznaczyć folder do zapisania wytrenowanego klasyfikatora.</li>
	<li>Edytuj wiersz 17, aby ustawić nazwę pliku dla klasyfikatora.</li>
	<li>Opcjonalnie edytuj wiersz 19, aby wybrać funkcje do trenowania. Domyślna opcja, określona wcześniej5, została użyta do uzyskania reprezentatywnych wyników poniżej.</li>
	<li>Wykonaj kod. Korzystając z wybranych funkcji zestawu treningowego, kod trenuje klasyfikator za pomocą algorytmu k-najbliższego sąsiada (k-NN; k = 4), a następnie zapisuje klasyfikator (zgodnie z nazwą w kroku 5.5) w folderze wyznaczonym w kroku 5.4.</li>
	<li>Sprawdź na ekranie wizualizację wydajności klasyfikatora i dokładności krzyżowej walidacji.</li>
	<li>Opcjonalnie trenuj wiele klasyfikatorów z różnymi kombinacjami funkcji, powtarzając kroki 5.5–5.7. Następnie wybierz klasyfikator o najwyższej dokładności krzyżowej walidacji.</li>
	<li>Otwórz plik uzupełniający 3 — test (napisany dla oprogramowania do przetwarzania obrazu).</li>
	<li>Edytuj wiersze 14-15, aby wyznaczyć wyszkolony klasyfikator do przetestowania.</li>
	<li>Edytuj wiersz 17, aby oznaczyć zestaw testowy przygotowany w kroku 5.1.</li>
	<li>Wykonaj kod. Opisany powyżej klasyfikator identyfikuje typy komórek poszczególnych limfocytów w zbiorze testowym.</li>
	<li>Sprawdź na ekranie, wizualizując wydajność identyfikacji i dokładność testu.</li>
</ol>

Prof. Y. Park, Y. Jo, Y. S. Kim i S. Lee mają udziały finansowe w Tomocube, Inc., firmie, która komercjalizuje optyczne instrumenty do tomografii dyfrakcyjnej i ilościowego obrazowania fazowego i jest jednym ze sponsorów prac.

Przedstawiamy protokół, który umożliwia bezznacznikową identyfikację typów limfocytów z wykorzystaniem ilościowego obrazowania fazowego 3D i uczenia maszynowego. Krytycznymi etapami tego protokołu są ilościowe obrazowanie fazowe i wybór cech. Aby uzyskać optymalne obrazowanie holograficzne, gęstość komórek powinna być kontrolowana w sposób opisany powyżej. Stabilność mechaniczna ogniw jest również ważna dla uzyskania precyzyjnego rozkładu RI 3D, ponieważ pływające lub wibracyjne ruchy komórkowe zakłócają pomiary hologram...

Limfocyty można podzielić na różne podtypy, w tym B, pomocnicze (CD4+) T, cytotoksyczne (CD8+) T i regulatorowe limfocyty T. Każdy typ limfocytów odgrywa inną rolę w adaptacyjnym układzie odpornościowym; na przykład limfocyty B wytwarzają przeciwciała, podczas gdy limfocyty T wykrywają specyficzne antygeny, eliminują nieprawidłowe komórki i regulują limfocyty B. Funkcja i regulacja limfocytów jest ściśle kontrolowana i związana z różnymi chorobami, w tym nowotworami1, chorobami autoimmunologicznymi2 i infekcjami wirusowymi3. Dlatego identyfikacja typów limfocytów jest ważna, aby zrozumieć ich patofizjologiczne role w takich chorobach i immunoterapii w klinikach.
Obecnie, metody klasyfikacji typów limfocytów opierają się na reakcjach antygen-przeciwciało, celując w specyficzne białka błony powierzchniowej lub markery powierzchniowe4. Celowanie w markery powierzchniowe jest precyzyjną i dokładną metodą określania typów limfocytów. Wymaga to jednak drogich odczynników i czasochłonnych procedur. Ponadto niesie ze sobą ryzyko modyfikacji struktur białek błonowych i zmiany funkcji komórkowych.
Aby sprostać tym wyzwaniom, opisany tutaj protokół wprowadza bezznacznikową identyfikację typów limfocytów za pomocą ilościowego obrazowania fazowego 3D (QPI) i uczenia maszynowego5. Metoda ta umożliwia klasyfikację typów limfocytów na poziomie pojedynczej komórki na podstawie informacji morfologicznych uzyskanych z bezznacznikowego obrazowania 3D poszczególnych limfocytów. W przeciwieństwie do konwencjonalnych technik mikroskopii fluorescencyjnej, QPI wykorzystuje rozkłady indeksu refrakcji (RI) (wewnętrzne właściwości optyczne żywych komórek i tkanek) jako kontrast optyczny6,7. Tomogramy RI poszczególnych limfocytów reprezentują informacje fenotypowe specyficzne dla podtypów limfocytów. W tym przypadku, aby systemowo wykorzystać tomogramy 3D RI poszczególnych limfocytów, wykorzystano nadzorowany algorytm uczenia maszynowego.
Korzystając z różnych technik QPI, tomogramy 3D RI komórek były aktywnie wykorzystywane do badania patofizjologii komórek, ponieważ zapewniają one możliwość obrazowania ilościowego bez znaczników8,9,10,11,12,13. Ponadto rozkłady 3D RI poszczególnych komórek mogą dostarczać morfologicznych, biochemicznych i biomechanicznych informacji o komórkach. Tomogramy 3D RI były wcześniej wykorzystywane w dziedzinach hematologii14,15,16,17, choroby zakaźne18,19,20, immunologia21, biologia komórki22,23, zapalenie24, cancer25, neuroscience26,27, biologia rozwojowa28, toxicology29, and microbiology12,30,31,32.
Chociaż tomogramy 3D RI dostarczają szczegółowych informacji morfologicznych i biochemicznych komórek, klasyfikacja podtypów limfocytów jest trudna do osiągnięcia poprzez proste obrazowanie tomogramów 3D RI5. Aby systematycznie i ilościowo wykorzystać zmierzone tomogramy 3D RI do klasyfikacji typów komórek, wykorzystaliśmy algorytm uczenia maszynowego. Ostatnio opisano kilka prac, w których analizowano ilościowe obrazy fazowe komórek za pomocą różnych algorytmów uczenia maszynowego33, w tym wykrywanie mikroorganizmów34, klasyfikacja rodzaju bakteryjnego35,36, szybkie i bezznacznikowe wykrywanie zarodników wąglika37, automatyczna analiza plemników38, analiza raka cells39,40, oraz wykrywanie aktywacji makrofagów41.
Ten protokół zawiera szczegółowe kroki do przeprowadzenia bezznacznikowej identyfikacji typów limfocytów na poziomie poszczególnych komórek za pomocą 3D QPI i uczenia maszynowego. Obejmuje to: 1) izolację limfocytów z krwi myszy, 2) sortowanie limfocytów za pomocą cytometrii przepływowej, 3) QPI 3D, 4) ilościową ekstrakcję cech z tomogramów 3D RI oraz 5) nadzorowane uczenie się w celu identyfikacji typów limfocytów.

<table><tbody><tr><td>Mysz</td><td>Daehan Biolink</td><td>C57BL/6J&nbsp;</td><td>Dopasowany do płci i wieku, 6 i ndash; 8 tygodni</td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa Falcon</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanami&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>806544-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bufor lizujący chlorek amonu i potas&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 pożywka</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td>BD Biosciences</td><td>553140 (RRID:AB_394655)</td><td>CD16/32 (klon 2.4G2)</td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td>BD Biosciences</td><td>555275 (RRID:AB_395699)</td><td>CD3&epsilon; (klon 17A2)</td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td>Biolegnd</td><td>100734 (RRID:AB_2075238)</td><td>CD8&alpha; (Klon 53-6.7)</td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td>BD Biosciences</td><td>557655 (RRID:AB_396770)</td><td>CD19 (klon 1D3)Przeciwciało</td></tr> <tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>557683 (RRID:AB_396793)</td><td>CD45R/B220 (klon RA3-6B2)Przeciwciało</td></tr> <tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>552878 (RRID:AB_394507)</td><td>NK1.1 (klon PK136)</td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td>eBioscience</td><td>11-0041-85 (RRID:AB_464893)</td><td>CD4 (klon GK1.5)</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>4,6-diamidino-2-fenyloindol</td></tr><tr><td>Cytometria przepływowa&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Aria II lub III&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Komora obrazowania</td><td>Tomocube, Inc.</td><td>Holotomografia TomoDish</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tomocube, Inc.</td><td>HT-1H</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania holotomografii</td><td>Tomocube, Inc.</td>Oprogramowanie do wyznawania <td>obrazu TomoStudio</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MathWorks</td><td>Matlab R2017b</td><td></td></tr></tbody></table>

bezznacznikowa identyfikacja podtypów limfocytów przy użyciu trójwymiarowego ilościowego obrazowania fazowego i uczenia maszynowego

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

Opisujemy tutaj protokół do bezznacznikowej identyfikacji podtypów limfocytów za pomocą ilościowego obrazowania fazowego i uczenia maszynowego. Identyfikacja podtypów limfocytów jest ważna dla badań immunologicznych, a także diagnostyki i leczenia różnych chorób. Obecnie standardowe metody klasyfikacji typów limfocytów opierają się na znakowaniu określonych białek błonowych poprzez reakcje antygen-przeciwciało. Jednak te techniki etykietowania niosą ze sobą potencjalne ryzyko zmiany funkcji komórkowych. Opisany tutaj protokół pokonuje te wyzwania, wykorzystując wewnętrzne kontrasty optyczne mierzone za pomocą ilościowego obrazowania fazowego 3D i algorytmu uczenia maszynowego. Pomiar tomogramów 3D współczynnika załamania światła (RI) limfocytów dostarcza ilościowych informacji na temat morfologii 3D i fenotypów poszczególnych komórek. Parametry biofizyczne wyodrębnione z mierzonych tomogramów 3D RI są następnie analizowane ilościowo za pomocą algorytmu uczenia maszynowego, co umożliwia bezznacznikową identyfikację typów limfocytów na poziomie pojedynczej komórki. Mierzymy tomogramy 3D RI limfocytów T B, CD4+ T i CD8+ i zidentyfikowaliśmy ich typy komórek z ponad 80% dokładnością. W tym protokole opisujemy szczegółowe etapy izolacji limfocytów, ilościowego obrazowania fazowego 3D i uczenia maszynowego w celu identyfikacji typów limfocytów.

Rysunek 1  przedstawia schematyczny przebieg całego protokołu. Stosując zaprezentowaną tutaj procedurę, wyizolowaliśmy limfocyty B (n = 149), T CD4+ (n = 95) oraz T CD8+ (n = 112). Aby uzyskać informacje o fazie i amplitudzie pod różnymi kątami oświetlenia, zmierzono wiele hologramów 2D każdego limfocytu, zmieniając kąt oświetlenia (od -60° do 60°). Zazwyczaj do rekonstrukcji 3D tomogramu współczynnika załamania światła (RI) można wykorzystać 50 hologramó...

Opisujemy protokół do bezznacznikowej identyfikacji podtypów limfocytów za pomocą ilościowego obrazowania fazowego i algorytmu uczenia maszynowego. Pomiary tomogram 3D indeksu refrakcji limfocytów prezentują informacje morfologiczne i biochemiczne 3D dla poszczególnych komórek, które są następnie analizowane za pomocą algorytmu uczenia maszynowego w celu identyfikacji typów komórek.

Bezznacznikowa identyfikacja podtypów limfocytów przy użyciu trójwymiarowego ilościowego obrazowania fazowego i uczenia maszynowego

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

Metoda ta stanowi alternatywę dla konwencjonalnej procedury znakowania fluorescencyjnego i analizy cytometrii przepływowej, które są czasochłonne, kosztowne i wiążą się z ryzykiem zmiany funkcji komórkowej próbek. Główną zaletą tej techniki jest trójwymiarowa tomografia indeksu refrakcji i uczenie maszynowe, które są bezznacznikowymi i ilościowymi metodami, które umożliwiają szybką i dokładną identyfikację limfocytów. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii nowotworów krwi i chorób autoimmunologicznych, ponieważ identyfikacja limfocytów może mieć kluczowe znaczenie dla diagnozy choroby i odpowiedniego zastosowania leczenia.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w populacje limfocytów, można ją również zastosować do analizy innych pojedynczych komórek będących przedmiotem zainteresowania, w tym bakterii. Wizualna demonstracja technologii ilościowego obrazowania fazowego 3D ma kluczowe znaczenie, ponieważ ułatwia jasne instrukcje dotyczące wykonywania tej techniki i może zapewnić wgląd w jej zastosowania. Zacznij od zebrania każdego podzbioru limfocytów przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją.Aby uzyskać optymalne obrazowanie, rozcieńczyć każdą próbkę komórek do stężenia 180 komórek na mikrolitr pożywki RPMI i powoli wstrzyknąć 120 mikrolitrów pierwszej rozcieńczonej próbki do komory obrazowania. Po potwierdzeniu braku pęcherzyków w komorze umieść kroplę wody destylowanej na soczewce obiektywu mikroskopu ilościowego 3D i umieść komorę obrazowania na stoliku translacyjnym mikroskopu. Dostosuj stolik tak, aby próbka wyrównała się z soczewką obiektywu, a następnie kliknij ostrość i powierzchnia na karcie kalibracji perspektywy mikroskopu w oprogramowaniu do obrazowania, aby dostosować pozycje osiowe odpowiednio soczewek obiektywu i kondensatora.Kliknij opcję Auto mode (Tryb automatyczny), aby wyrównać obiektyw i soczewki kondensatora. Aby zoptymalizować wyrównanie, otwórz tryb skanowania i ręcznie wyreguluj soczewki, aby wyrównać wzór cyfrowego urządzenia z mikrolustrem do środka. Następnie wróć do trybu normalnego i dostosuj etap translacji, aby zlokalizować komórkę w polu widzenia.Dostosuj położenie osiowe soczewki obiektywu, aby znaleźć płaszczyznę ogniskową, aż granica próbki zwizualizowana na ekranie będzie prawie niewidoczna. Ważne jest, aby idealnie dostosować ostrość komórki, aby wygenerować optymalny tomogram 3DRI. Jeśli obraz nie zostanie wykonany prawidłowo, rekonstrukcja 3D zostanie zaburzona, co spowoduje zaszumienie tomogramu.Dostosuj etap translacji, aby znaleźć lokalizację bez komórki, a następnie kliknij przycisk Kalibruj, aby zmierzyć wiele hologramów 2D o różnych kątach oświetlenia. Dostosuj etap translacji, aby zlokalizować komórkę w środku pola widzenia. Na karcie Pozyskiwanie nazwij próbkę, która jest obrazowana.Kliknij opcję 3D Snapshot (Migawka 3D), aby zmierzyć hologramy komórki przy użyciu tych samych kątów oświetlenia, co w przypadku właśnie zmierzonych hologramów 2D. Gdy uzyskane dane pojawią się w panelu Zarządzanie danymi, kliknij je prawym przyciskiem myszy, a następnie kliknij przycisk Przetwarzaj, aby zrekonstruować tomogram 3D z hologramów 2D przy użyciu algorytmu tomografii defrakcyjnej zaimplementowanego w oprogramowaniu do obrazowania. Po zobrazowaniu w panelu Zarządzanie danymi kliknij dane prawym przyciskiem myszy, a następnie kliknij przycisk Otwórz, aby wyświetlić dane.Kliknij środek komórki, aby zmienić jej położenie, a następnie kliknij opcję RI Tomogram w panelu Menedżer danych. Na karcie Preset (Ustawienie wstępne) kliknij przycisk Load (Załaduj) i kliknij dwukrotnie pozycję lymphocyt (limfocyt). xml, który jest predefiniowaną funkcją transferu dostarczaną przez oprogramowanie do obrazowania w celu wizualizacji tomogramu zgodnie z rozkładami 3DRI.Przewiń myszą, aby powiększyć i przeciągnij komórkę, aby obrócić ją w dowolnym kierunku. W celu ilościowej ekstrakcji cech morfologicznych i biochemicznych umieść wszystkie dane tomograficzne w jednym folderze i podziel typy komórek w poszczególnych podfolderach w folderze głównym. Następnie otwórz plik ekstrakcji cech uzupełniających w odpowiednim oprogramowaniu do obrazowania i edytuj linię 14, aby wyznaczyć folder tomogramu, z którego mają zostać wyodrębnione dane.Edytuj wiersz 15, aby wyznaczyć folder, w którym mają zostać zapisane wyodrębnione dane elementu i wykonać kod. Dla każdego tomogramu w zbiorze danych kod obliczy powierzchnię, objętość komórkową, sferyczność, gęstość białka i suchą masę na próg współczynnika załamania światła. W przypadku uczenia nadzorowanego i identyfikacji użyj prostego algorytmu podziału losowego w programie MATLAB, aby losowo podzielić wyodrębnione dane funkcji na osobne foldery zestawu treningowego i testowego.Otwórz dodatkowy plik treningowy i edytuj wiersz 14, aby wyznaczyć folder zestawu treningowego, wiersz 16, aby wyznaczyć folder do zapisywania wytrenowanego klasyfikatora, a wiersz 17, aby ustawić nazwę pliku dla klasyfikatora. Następnie wykonaj kod. Korzystając z wybranych cech zestawu treningowego, kod wytrenuje klasyfikator za pomocą algorytmu K najbliższego sąsiada i zapisze klasyfikator w wyznaczonym folderze.Następnie otwórz dodatkowy plik testowy trzy i edytuj wiersze od 14 do 15, aby wyznaczyć wytrenowany klasyfikator do testowania, oraz wiersz 17, aby wyznaczyć wytrenowany zestaw testów. Następnie wykonaj kod. Klasyfikator zidentyfikuje typy komórek poszczególnych limfocytów w zestawie testowym.Tutaj pokazano reprezentatywne tomogramy limfocytów B z indeksem załamania światła renderowane w 3D limfocytów B, limfocytów T CD4-dodatnich i limfocytów T CD8-dodatnich o różnych schematach kolorów, przypisanych zgodnie z wartościami indeksu refrakcji przypisanymi za pomocą oprogramowania do obrazowania. Na podstawie wartości współczynnika załamania światła można obliczyć ilościowe cechy morfologiczne i biochemiczne. W tym eksperymencie dokładność klasyfikacji limfocytów T i B wynosiła odpowiednio 93,15% i 89,81% dla przypadków treningowych i testowych.Limfocyty T CD4 dodatnie i CD8-dodatnie zostały sklasyfikowane statystycznie, a dokładność wynosiła odpowiednio 87,41% i 84,38% dla zestawów treningowych i testowych. Wreszcie, dokładność wieloklasowego klasyfikatora typu komórkowego wyniosła odpowiednio 80,65% i 75,93% odpowiednio dla etapów szkolenia i testu. Jakość i liczba obrazów mają zasadnicze znaczenie dla sukcesu tej techniki.Im lepsza jakość obrazu i im większa ilość danych, tym lepsza dokładność identyfikacji. Głębokie uczenie może być wykorzystane do pełniejszej analizy złożonych danych tomogramów, co znacznie zwiększa wydajność identyfikacji. Ponadto fluorescencja i ilościowe obrazowanie fazowe 3D mogą być wykorzystane do zbadania ścieżki fizjologicznych ról zidentyfikowanych limfocytów.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii komórki i biomedycyny do badania konkretnych chorób będących przedmiotem zainteresowania w obrębie różnych organizmów. Rzeczywiście, w szczególności immunolodzy mogą odnieść korzyści z wykorzystania tej nowej technologii do identyfikacji populacji będącej przedmiotem zainteresowania.

label-free-identification-lymphocyte-subtypes-using-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na odkrycie ruchomości limfocytów oraz oddziaływań komórkowych w obrębie węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz podczas odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy demonstrujemy adoptywny transfer limfocytów T, izolację węzłów chłonnych oraz obrazowanie ruchomości limfocytów T CD4+ w wypreparowanym węźle chłonnym.

Disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy

Ten film demonstruje bezznacznikową identyfikację morfologii i biochemii limfocytów za pomocą ilościowego obrazowania fazowego 3D. Technika ta pozwala na dokładną analizę limfocytów, odkrywanie ich wewnętrznych struktur i właściwości bez konieczności stosowania procedur znakowania.

Trójwymiarowe ilościowe obrazowanie fazowe w celu scharakteryzowania podtypów limfocytów

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Mikroskopia wideo bez soczewek umożliwia nam monitorowanie kultur komórkowych bezpośrednio w inkubatorze. Tutaj opisujemy pełny protokół używany do pozyskiwania i analizowania trwającego 2,7 dnia pozyskiwania hodowanych komórek HeLa, co prowadzi do zestawu danych 2,2 x 106 pomiarów morfologii poszczególnych komórek i 10584 ścieżek cyklu komórkowego.

Bezsoczewkowa mikroskopia wideo do dynamicznej i ilościowej analizy przylegających kultur komórkowych

Uśpione i aktywne fenotypy komórek nowotworowych zostały scharakteryzowane za pomocą ilościowego obrazowania fazowego. Testy proliferacji, migracji i morfologii komórek zostały zintegrowane i przeanalizowane w jednej prostej metodzie.

Poklatkowe, bezznacznikowe, ilościowe badanie obrazowania fazowego uśpionych i aktywnych ludzkich komórek nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji komórek odpornościowych osadzonych w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenowej za pomocą mikroskopii świetlnej. Protokół ten wyjaśnia również, jak śledzić migrację komórek w 3D. Protokół ten można zastosować do innych typów komórek zawiesinowych w matrycy 3D.

Mikroskopia arkuszowa światła do trójwymiarowej wizualizacji ludzkich komórek odpornościowych

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

Ten artykuł opisuje protokół immunofluorescencji multipleksowej zoptymalizowany pod kątem charakterystyki trójwymiarowej architektury przerzutów otrzewnowych.

Trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne

Protokół ten przedstawia multimodalne podejście łączące spektroskopię Ramana i tomograficzną mikroskopię fazową w celu bezznacznikowego, nieinwazyjnego fenotypowania żywych ludzkich komórek raka piersi. Zawiera przyjazny dla użytkownika, wolny od uprzedzeń człowieka potok analityczny do szybkiej, ilościowej analizy morfochemicznej, dostarczając szczegółowych informacji molekularnych i strukturalnych z zastosowaniami w badaniach nad rakiem i biologii komórki.

Ramy obrazowania multimodalnego w celu przyspieszenia fenotypowania żywych, bezznacznikowych komórek raka piersi

Protokół ten opisuje bezznacznikową metodę szybkiej analizy liczby i aktywności komórek NK (Natural Cell ) bez użycia soczewek przy użyciu technologii obrazowania cieni bez soczewek. Metoda ta określa ilościowo zmiany morfologiczne w poszczególnych komórkach NK poprzez komputerową analizę ich wzorów dyfrakcyjnych.

Wdrażana w terenie platforma obrazowania bez soczewek do szybkiej analizy aktywacji komórek NK bez użycia znaczników

Poznaj bezbarwną identyfikację podtypów limfocytów przy użyciu trójwymiarowej tomografii wskaźnika załamania światła i uczenia maszynowego. Ta metoda oferuje szybką i dokładną alternatywę dla konwencjonalnych technik fluorescencyjnych.

Bezznacznikowa identyfikacja podtypów limfocytów przy użyciu trójwymiarowego ilościowego obrazowania fazowego i uczenia maszynowego (Wideo) | JoVE Journal

Bezznacznikowa identyfikacja podtypów limfocytów przy użyciu trójwymiarowego ilościowego obrazowania fazowego i uczenia maszynowego

Przeglądaj więcej filmów