Mikroskopia arkuszowa światła do trójwymiarowej wizualizacji ludzkich komórek odpornościowych

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak to, jak dokładnie zachowują się komórki odpornościowe w fizjologicznie istotnym kontekście, np. jak skutecznie wyszukiwać komórki docelowe w środowisku trójwymiarowym. Główną zaletą tej metody jest wygenerowanie bardzo cienkiego arkusza światła, aby oświetlić tylko płaszczyznę ogniskową bez wpływu na komórki poza płaszczyzną. Umożliwia to bardzo szybką akwizycję przy wyraźnym zmniejszeniu bielenia i fotocytotoksyczności.

Tę procedurę zademonstruje dr Renping Zhao, post-doc z mojego laboratorium. Na początek pod kapturem do hodowli komórkowej przenieś 400 mikrolitrów schłodzonego roztworu wyjściowego kolagenu do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Powoli dodawaj 50 mikrolitrów schłodzonego 10X PBS.

Następnie wymieszaj roztwór, delikatnie przechylając probówkę. Dodaj 48 mikrolitrów 0,1 molowego wodorotlenku sodu do roztworu kolagenu, aby dostosować pH do 7,2 do 7,6. Użyj pasków testowych pH, aby określić wartość pH mieszaniny.

Dodaj dwa mikrolitry sterylnej destylowanej wody dejonizowanej, aby uzyskać ostateczną objętość do 500 mikrolitrów. Dobrze wymieszaj i przechowuj roztwór kolagenu na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia. Po fluorescencyjnym znakowaniu żywych komórek zgodnie z protokołem tekstowym, pod kapturem hodowli komórkowej, przenieś jedną komórkę razy 10 do szóstej do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Odwirować probówkę o ciśnieniu 200 g przez osiem minut. Następnie wyrzucić supernatant i użyć 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej do ponownego zaparcia osadu. Dodaj 85,9 mikrolitrów zneutralizowanego roztworu kolagenu do zawiesiny komórkowej i odpowiednio wymieszaj, aby osiągnąć stężenie kolagenu 2,5 miligrama na mililitr.

Pozostaw mieszankę kolagenu komórkowego na lodzie w kapturze. Następnie włóż tłok do pasującej kapilary, aż tłok wystanie na jeden milimetr z kapilary. Następnie zwilżyć tłok, zanurzając go w pożywce hodowlanej.

Pominięcie tego kroku może spowodować niepożądane wprowadzenie pęcherzyków powietrza między tłok a matrycę kolagenową. Zanurz kapilar w mieszaninie kolagenu komórkowego i powoli pociągnij tłok do tyłu o 10 do 20 milimetrów. Następnie za pomocą butelki z rozpylaczem 70% etanolu zwilż ręcznik papierowy i użyj go do wytarcia zewnętrznej ściany naczynia włosowatego, aby usunąć pozostały roztwór kolagenu.

Teraz użyj modeliny, aby przymocować kapilarnę do wewnętrznej ścianki pięciomililitrowej rurki. Popchnij mieszankę kolagenu komórkowego do krawędzi naczynia włosowatego. Następnie inkubuj probówkę z kapilarą w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez godzinę w celu polimeryzacji kolagenu.

Po inkubacji dodaj od jednego do dwóch mililitrów pożywki hodowlanej do probówki. Następnie ostrożnie wyrzuć spolimeryzowany pręt kolagenowy do pożywki, aż około połowa kolagenu będzie zwisać w podłożu. Inkubuj naczynia włosowate przez kolejne 30 minut.

Aby przeprowadzić mikroskopię arkuszową światła, należy zmontować komorę na próbkę zgodnie z instrukcjami producenta. Po włączeniu mikroskopu i inkubatora w przypadku obrazowania na żywo umieść kapilarnę w komorze próbki, zlokalizuj próbkę i znajdź obszar zainteresowania do uzyskania obrazu. Aktywuj odpowiednie lasery.

Następnie ustaw moc lasera i czas naświetlania. Ustaw również rozmiar kroku stosu Z, pozycję początkową i końcową stosu Z oraz interwał czasu dla obrazowania komórek na żywo. Następnie rozpocznij akwizycję obrazu.

Przenieś jeden mililitr 4% paraformaldehydu w PBS do pięciomililitrowej probówki pod kapturem chemicznym. Następnie zanurz kapilatę ze spolimeryzowanym kolagenem w roztworze paraformaldehydu i użyj gliny modelarskiej, aby zamontować kapilarnę na wewnętrznej ściance rurki. Delikatnie naciśnij tłok, aż połowa pręcika kolagenowego będzie wisiała w roztworze paraformaldehydu.

Następnie odciągnij tłok, aby wprowadzić pręt kolagenowy z powrotem do naczynia włosowatego. Usuń kapilary z probówki i wyrzuć paraformaldehyd. Zamontuj kapilar w świeżej probówce i dodaj jeden mililitr PBS.

Upewnij się, że kapilara jest zanurzona w PBS. Delikatnie naciśnij tłok, aż połowa pręcika kolagenowego będzie zwisać w roztworze i inkubować przez pięć minut. Odciągnąć tłok, aby podnieść pręt kolagenowy w kapilarze.

Następnie zastąp PBS świeżym PBS i wyrzuć pałeczkę kolagenową do roztworu. Po trzecim przemyciu dodaj jeden do dwóch mililitrów blokującego buforu przepuszczalności do probówki. Wyrzuć pałeczkę kolagenową do roztworu i inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 minut.

Zastąp blokujący bufor permeabilizacji 200 do 500 mikrolitrami przeciwciał pierwszorzędowych w blokującym buforze przepuszczalności i inkubuj zanurzony pręt kolagenowy w roztworze przez jedną godzinę. Po użyciu PBST do trzykrotnego przemycia pałeczki kolagenowej, inkubuj pręcik w przeciwciałach drugorzędowych w buforze blokującym przepuszczalność w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po trzech kolejnych płukaniach w PBS wciągnij pręt kolagenowy z powrotem do kapilary i trzymaj próbkę w PBS do czasu obrazowania.

Jak widać na tym filmie, podczas migracji komórki CTL transfekowane białkiem fuzyjnym aktyny EGFP utworzyły główne wypukłości w kształcie cytryny, otoczone drobnymi strukturami przypominającymi wrzecionowate. Trajektorie CTL są tutaj zilustrowane za pomocą prędkości i trwałości lub przemieszczenia podzielonych przez całkowitą długość toru jako mierzone parametry. Prędkości wahają się od 0,01 do 0,19 mikrona na sekundę z prawie 20-krotną różnicą, a trwałość waha się od zera do 0,7.

Ten rysunek przedstawia utrwalone komórki CTL w żelu kolagenowym 3D wybarwionym endogenną perforyną-1 i aktyną. Próbka była oświetlana z jednej strony lub z obu stron. Z różnych pozycji Z komórki są równomiernie wybarwione, co wskazuje na dobrą penetrację przeciwciał do żeli kolagenowych.

Naprawiono CTL wykazywał taką samą morfologię jak żywe komórki, co wskazuje, że morfologia jest dobrze zachowana w tym protokole. Próbując wykonać tę procedurę, bardzo ważne jest, aby pamiętać o unikaniu pęcherzyków powietrza i odpowiednim dostosowaniu wartości pH. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak barwienie żywych komórek określonymi cząsteczkami powierzchniowymi, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak skorelowanie zachowania komórki z różnicowaniem lub z różnymi podtypami komórek lub zbadanie interakcji komórka-komórka i losu komórki.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny biologii komórki, immunologii i badań nad rakiem do badania zachowania komórek, losu komórek, różnicowania i interakcji komórek w najbardziej fizjologicznie istotnym systemie in vitro. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki z komórkami osadzonymi w trójwymiarowej matrycy kolagenowej, jak wizualizować próbki za pomocą mikroskopii świetlnej, na żywo lub stacjonarnie, oraz jak śledzić migrację komórek w 3D.