Technika fotokonwersji do badania dynamiki komórek zapalnych w poczwarkach owadów

Zacznij od naczynia ze szklanym dnem zawierającego transgeniczne poczwarki Drosophila z oznakowanym uszkodzonym nabłonkiem z białkami na powierzchni komórek wykazującymi zieloną fluorescencję.

Komórki odpornościowe poczwarek - lub hemocyty - wyrażają fotokonwertowalne zielone fluorofory w cytoplazmie i czerwone białka fluorescencyjne w jądrze, ułatwiając śledzenie komórek.

Zranione komórki uwalniają chemoatraktanty – lub cząsteczki zapalne, przyciągając hemocyty do zranionego miejsca.

Mikroskopia konfokalna ujawnia zraniony obszar otoczony zielonymi komórkami nabłonka.

Podczas gojenia zielone hemocyty z czerwonymi jądrami w pobliżu rany rozciągają wypukłości błony — filopodia i blaszki i migrują w kierunku zranionego obszaru.

Z biegiem czasu, gdy chemoatraktant dyfunduje, odległe hemocyty migrują w kierunku rany, tworząc falę komórek odpornościowych.

Oświetl subpopulację migrujących hemocytów za pomocą długości fali 405 nanometrów. To nieodwracalnie przekształca fotokonwertowalny fluorofor hemocytów z zielonego na czerwony.

Te fotoprzekształcone hemocyty naprawiają zraniony nabłonek i oddalają się od miejsca rany, różnicując fotoprzekształcone hemocyty od hemocytów niefotokonwertowanych i wyjaśniając dynamikę komórek zapalnych.

Po nawinięciu brzegów skrzydełek źrenicy należy szybko przenieść naczynie ze szklanym dnem do odpowiedniego mikroskopu w celu wykonania zdjęcia poklatkowego. Następnie otwórz odpowiednie oprogramowanie do przechwytywania obrazu.

W oprogramowaniu włącz odpowiednie lasery i dostosuj ich moc oraz przesunięcie wzmocnienia, aby uzyskać wystarczającą ilość sygnału fluorescencyjnego bez nasycenia pikseli. Ogólnie rzecz biorąc, najniższa możliwa moc lasera w zakresie od 5% do 20% najlepiej sprawdza się w celu zminimalizowania fotowybielania.

Skoncentruj się na całym skrzydle źrenicy w małym powiększeniu lub skup się na ranie w dużym powiększeniu, aby zbadać gojenie się rany. Aby uchwycić zarówno naprawczy nabłonek, jak i rekrutację komórek zapalnych, najpierw ustaw mikroskop tak, aby rejestrował stos z za pomocą precyzyjnej regulacji ostrości na panelu sterowania. Skanuj od zranionego nabłonka do przestrzeni zewnątrzkomórkowej poniżej, zawierającej migrujące hemocyty.

Następnie ustaw oprogramowanie tak, aby rejestrowało przekroje z przez skrzydło źrenicy co 3 mikrony lub w jeszcze ciaśniejszych odstępach czasu. W przypadku obrazowania poklatkowego nagrywaj stosy z co najmniej co 30 sekund przez co najmniej godzinę.

W przypadku korzystania z fotokonwertowalnych sond do selektywnej fotokonwersji i etykietowania podzbioru komórek podczas obrazowania, należy otworzyć odpowiednie moduły w oprogramowaniu do obrazowania, aby przeprowadzić fotokonwersję i aktywować laser 405-nanometrowy. Następnie wybierz komórki, które mają zostać przekonwertowane na zdjęcia w oprogramowaniu FRAP za pomocą narzędzia do zaznaczania.

Następnie ustaw przebieg czasowy konwersji zdjęć na pojedynczą klatkę iteracji i ustaw laser 405-nanometrowy na 20% mocy lasera, a następnie kliknij Rozpocznij eksperyment, aby przeprowadzić konwersję zdjęć. Po zakończeniu wyjdź z modułu FRAP i wróć do oryginalnego ekranu obrazowania. Tam dostosuj lasery do używanych fluoroforów i zobrazuj komórki przekonwertowane i nieprzekonwertowane na zdjęcie za pomocą nagrań poklatkowych.