Test kodów kreskowych do charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej komórek odpornościowych

Zacznij od próbek testowych zawierających stymulowane i utrwalone komórki odpornościowe.

Stymulacja indukuje ekspresję określonych markerów w komórkach, podczas gdy fiksacja zachowuje markery fenotypowe, w tym antygeny powierzchniowe komórki i markery stanu funkcjonalnego, w tym cytokiny.

Do każdej próbki dodać unikalną kombinację przeciwciał sprzężonych z izotopami metali ciężkich.

Technika ta pozwala na unikalne kodowanie kreskowe wielu próbek, wyróżniając każdą próbkę kombinacją izotopów metali ciężkich.

Przeciwciała wiążą się ze wspólnym epitopem, kodując kreskowo wszystkie komórki w próbkach.

Połącz wszystkie próbki oznaczone kodami kreskowymi w jednej probówce w celu dalszego przetwarzania.

Dodaj koktajl przeciwciał sprzężonych z metalem, aby zabarwić antygeny powierzchniowe.

Dodaj bufor przepuszczalności, aby zwiększyć przepuszczalność błony komórkowej dla barwienia wewnątrzkomórkowego.

Dodaj kolejny zestaw przeciwciał sprzężonych z metalami, aby wybarwić cytokiny wewnątrzkomórkowe.

Kody kreskowe umożliwiają jednoczesne barwienie i pobieranie próbek zbiorczych za pomocą cytometrii masowej. Technika ta maksymalizuje wydajność testu, poprawiając ocenę markerów stanu fenotypowego i funkcjonalnego.

Aby oznaczyć kreskowo utrwalone komórki, należy rozmrozić próbki z magazynu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, powoli na lodzie. Rozcieńczyć 10-krotny bufor perm do kodów kreskowych PBS przez 1 do 10 i zrobić wystarczającą ilość buforu na 3 mililitry na próbkę.

Napełnij jedno niesterylne koryto CSM, a drugie 1x buforem do trwałej ondulacji do kodów kreskowych. Następnie dodaj 1 mililitr lodowatego CSM do świeżo rozmrożonych próbek. Dokładnie wymieszaj i przenieś do odpowiednich, wstępnie oznakowanych probówek klastrowych z polipropylenu.

Teraz weź próbkę o pojemności 10 mikrolitrów i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Znormalizuj liczbę komórek w każdej probówce klastra, usuwając objętość nadmiaru komórek. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 600 razy g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w 1 mililitrze 1x bufora perm do kodów kreskowych za pomocą pipety wielokanałowej i odwirować przy 600 razy g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odessać supernatant.

Ułóż probówki aparatu udojowego na stojaku w tej samej kolejności, jak wskazano na kluczu kodu kreskowego, tak aby próbka była zgodna z jej kodem kreskowym. Dodaj 800 mikrolitrów 1x bufor do trwałej ondulacji do kodów kreskowych za pomocą pipety wielokanałowej do wszystkich próbek w probówkach zbiorczych, bez dotykania osadu komórkowego, aby zmniejszyć utratę komórek.

Następnie odłóż na bok stojak z rurkami zbiorczymi. Usuń paski probówek z zestawu do kodów kreskowych 20-plex Palladium z minus 20 stopni Celsjusza i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Dodaj 100 mikrolitrów 1x bufora do trwałej ondulacji kodów kreskowych, dokładnie wymieszaj i przenieś 120 mikrolitrów ponownie zawieszonej mieszanki kodów kreskowych do odpowiednich próbek komórek w probówkach zbiorczych.

Dokładnie wymieszać za pomocą pipety wielokanałowej, aby nie doszło do zanieczyszczenia krzyżowego między poszczególnymi próbkami oznaczonymi kodami kreskowymi. Inkubować probówki zbiorcze przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby kody kreskowe mogły oznaczyć komórki. Po 30 minutach odwirować próbki w temperaturze 600 razy g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant. Następnie umieść je ponownie w 1 mililitrze CSM. Następnie odwirować i ponownie zawiesić w CSM.

Następnie odwirować przy 600 razy g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Za pomocą jednej pipety i tej samej końcówki przenieś wszystkie granulki komórek i około 70 do 80 mikrolitrów pozostałej objętości do jednej rurki polistyrenowej. Nie wysuwaj końcówki pipety. Odłóż na bok pojedynczą pipetę z tą końcówką.

Za pomocą wielokanałowej pipety i nowych końcówek dodaj 100 mikrolitrów CSM do każdej oryginalnej probówki do aparatu udołowiowego, aby zmaksymalizować regenerację komórek. Za pomocą pojedynczej pipety z odłożoną na bok końcówką przenieś wszystkie granulki komórek w 100 mikrolitrach pozostałej objętości do tej samej rurki polistyrenowej. Dodaj CSM, aby uzupełnić rurkę polistyrenową do około 3 mililitrów. Policz i zapisz numer komórki w zbiorczym zestawie kodów kreskowych. Następnie odwirować 600 razy g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zassać supernatant. Przystąp do barwienia próbek oznaczonych kodami kreskowymi tego samego dnia.