Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronach przy użyciu zmodyfikowanych lentiwirusów

Potraktuj przylegające ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste zmodyfikowanymi lentiwirusami w odczynniku do transfekcji.

Wirus jest nosicielem genów oporności na antybiotyki i neurogennego czynnika transkrypcyjnego, kontrolowanego przez elementy reagujące na tetracykliny i regulatorowe.

Dodatnio naładowany odczynnik do transfekcji wzmacnia fuzję wirusa i uwalnianie jego zawartości.

Wirusowe RNA ulega odwrotnej transkrypcji do DNA i integruje się z DNA komórki macierzystej, umożliwiając ekspresję elementów regulatorowych, które wytwarzają białka aktywujące.

Dodaj podłoże podstawowe z pochodną tetracykliny, która tworzy kompleks z białkami aktywującymi.

Kompleks ten wiąże się z elementem reagującym na tetracyklinę, promując ekspresję genów i wytwarzając neurogenne czynniki transkrypcyjne, które indukują różnicowanie komórek macierzystych w neuronach.

Dodaj podłoże podstawowe z antybiotykiem, aby wyeliminować nietransfekowane komórki.

Potraktuj komórki roztworem oddzielającym zawierającym enzymy proteolityczne, które degradują macierz zewnątrzkomórkową lub ECM i uwalniają komórki.

Usuń enzymy i ponownie umieść komórki w studzienkach pokrytych ECM pożywką do dojrzewania, promując dojrzewanie neuronów.

Dwa dni przed indukcją różnicowania odłącz komórki ES, dodając 1 mililitr roztworu do odrywania komórek i inkubując w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przenieś komórki do probówki. Następnie umyj studzienkę 2 mililitrami pożywki i dodaj ją do tej samej probówki. Odwirować komórki 300 razy g przez 5 minut. Następnie ponownie zawiesić osad w pożywce i umieścić komórki na pokrytych matrycą sześciodołkowych płytkach o gęstości osadzenia 1 razy 10 do piątej komórki na studzienkę.

Następnego dnia dodać lentiwirusy z ekspresją Ngn2 plus PuroR i transaktywator tetracykliny wraz z polibrenem w świeżej pożywce podtrzymującej komórki ES. W dniu zerowym dodać 2 mikrogramy na mililitr doksycykliny w pożywce DMEM/F12 uzupełnionej N2 i bez morfogenów. Pierwszego dnia dodaj puromycynę do świeżego DMEM/F12 plus N2 i doksycykliny do końcowego stężenia 1 mikrograma na mililitr.

Wybrać transdukowane komórki w puromycynie przez co najmniej 24 godziny. Drugiego dnia odłącz różnicujące neurony roztworem do odłączania komórek i ponownie umieść je na 24-dołkowych płytkach pokrytych roztworem macierzy. Utrzymuj je w pożywce NBA/B27 bez doksycykliny. Hoduj czyste indukowane neurony na płytkach pokrytych roztworami opartymi na macierzy zewnątrzkomórkowej.