Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

Protokół ten ułatwia wykorzystanie ludzkich pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych do zastosowań przesiewowych o wysokiej zawartości. Szczególnie dobrze nadaje się do oznaczania synaps, które w ludzkich neuronach wymagają długich okresów hodowli. Pokazujemy ponowne platerowanie neuronów z naczyń wielkoformatowych do wielostudzienek kompatybilnych z HCS w sposób, który zachowuje ich żywotność.

Wbrew intuicji pokazujemy, że wydłużenie inkubacji proteazy przed ponownym wymieszaniem i ponownym posiewem poprawia przeżycie neuronów. Ludzkie neurony pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych są coraz bardziej istotne w obszarach badań podstawowych, opracowywania leków i medycyny zwyrodnieniowej. Ta delikatna metoda miareczkowania może być stosowana do ponownego zawieszania dowolnej dużej monowarstwy komórek o gęstej sieci procesów.

Oprócz ludzkich iPSC może być stosowany do ponownego platerowania hodowli neuronów pierwotnych lub do ich ponownego zawieszenia w celu sortowania faktów lub sekwencjonowania pojedynczych komórek. Ważne jest, aby uważnie postępować zgodnie z krokami protokołu i często monitorować odłączenie neuronów od płytki za pośrednictwem proteazy. Optymalny czas inkubacji może się różnić w zależności od kultury.

Demonstracja wizualna umożliwia nawet niedoświadczonym badaczom odtworzenie tej procedury. Zacznij od delikatnego przepłukania płytki zróżnicowanych neuronów za pomocą PBS. Rozproszyć PBS wzdłuż ścianki płytki, a nie bezpośrednio na komórkach, aby uniknąć ich zakłócenia.

Zasysaj PBS od krawędzi naczynia, przechylając je, uważając, aby nie dotknąć komórek. Zastosuj co najmniej jeden mililitr enzymu proteolitycznego na 10-centymetrową płytkę. I włóż komórki z powrotem do inkubatora na 40 do 45 minut.

Podczas inkubacji sprawdź neurony pod mikroskopem kontrastowym i kontynuuj leczenie proteazą, aż sieć neuronowa całkowicie odłączy się od płytki i zacznie się rozpadać. Kiedy neurony się odłączą, przerwij trawienie, dodając pięć mililitrów świeżej pożywki DEMEM na każdy mililitr proteazy. Użyj pipety serologicznej, aby delikatnie miareczkować komórki względem płytki pięć do ośmiu razy, upewniając się, że nie wywierasz zbyt dużego nacisku.

Przecedź komórki przez siatkę o grubości 100 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, kropla po kropli. I przepłucz sitko dodatkowymi pięcioma mililitrami świeżej pożywki DMEM. Użyj wirówki stołowej, aby wirować komórki w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut.

Po odwirowaniu włóż stożkową rurkę z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego i odessaj większość pożywki, pozostawiając 250 mikrolitrów, aby komórki były wilgotne. Delikatnie zawiesić komórki w dwóch mililitrach świeżej pożywki DMEM, a następnie przepuścić je przez koniec pięciomililitrowej pipety serologicznej. Na koniec odwróć rurkę dwa do trzech razy.

Użyj hemocytometru i tryptanu niebieskiego, aby policzyć żywe komórki. A następnie DMEM do pożądanego stężenia. Dodaj odpowiednie suplementy do probówki, w zależności od wymagań konkretnej linii komórkowej i delikatnie wymieszaj komórki, przechylając stożkową rurkę dwa do trzech razy.

Odessać powłokę lamininy z płytki 24-dołkowej i przepłukać ją raz PBS. Zassać PBS. I nałóż roztwór komórkowy do każdej studzienki ruchem ósemkowym, aby uniknąć zbrylania.

Po zakończeniu powlekania komórek włóż płytkę z powrotem do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Krótko zmieszaj roztwór podstawowy osoby zgłaszającej wczesną śmierć komórki i dodaj go do studzienek zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Poczekaj 20 minut.

A następnie wyobraź sobie żywe i martwe komórki w studzienkach ze szklanym dnem. Wydłużenie inkubacji proteazy pozwala na rozluźnienie sieci neuronalnej w obrębie uniesionej warstwy komórek. Powoduje to zmniejszenie śmierci komórki w momencie dysocjacji, a także skutkuje bardziej efektywną regeneracją w ciągu kolejnych dni.

Stosując procedurę rozszerzonej inkubacji enzymów, kultury wykazują przybliżone podwojenie żywotności komórek w ciągu kilku dni po ponownym posiewie i mniejszą gęstość martwych lub umierających komórek. Faza przejściowa różnicowania neuronów trwa kilka dni, podczas których komórki stopniowo wyrażają markery neuronalne w późnym stadium. Markery te są natychmiast wykrywane w kulturach, które zostały ponownie posiane po czterech tygodniach wstępnego różnicowania.

Rozszerzony protokół proteazy również umiarkowanie zwiększa przerost neurydów. Poprawia się zarówno całkowita długość neurydów, jak i wzrost dendrytów. Replatacja jest również przydatna do badania synaps.

Już tydzień po ponownym posiewie zaobserwowano markery dla białek pre- i postsynaptycznych. Co więcej, aktywność elektryczna wynikająca ze spontanicznej depolaryzacji i prądów napędzanych synaptycznie jest wykrywalna za pomocą obrazowania wapniowego lub układów wieloelektrodowych. Ta procedura powlekania może być dostosowana do wielu rodzajów zastosowań.

Oprócz badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji potencjalnych związków terapeutycznych, może być on wykorzystywany do obrazowania stożków wzrostu lub zapisów z matrycy wieloelektrodowej. Mechaniczna dysocjacja neuronów, które już utworzyły długie procesy, jest stresująca. Wydłużona inkubacja enzymatyczna i delikatne miareczkowanie komórek są niezbędnymi krokami dla powodzenia tej procedury.