Name: Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Poznaj metodę powtórzenia ludzkich neuronów pochodzących z komórek pluripotencjalnych w celu badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps. Protokół optymalizuje czas inkubacji proteazowej, poprawiając przeżywalność komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częścią National Cooperative Reprogrammed Cell Research Groups (NCRCRG) do badania chorób psychicznych i była wspierana przez grant NIH U19MH107367. Początkowe prace były również wspierane przez grant NIH NS070297. Dziękujemy doktorom Carol Marchetto i Fredowi Gage'owi z Instytutu Salka za dostarczenie linii komórek progenitorowych WT 126 oraz doktorom Eugene'owi Yeo i Lawrence'owi Goldsteinowi z UC San Diego za dostarczenie linii komórek progenitorowych CVB WT24. Dziękujemy Deborah Pre z laboratorium dr Anne Bang z Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute za przydatne dyskusje.

1. Okres różnicowania przed powtórzeniem
<ol>
	<li>Różnicuj neurony na 10-centymetrowych szalkach, korzystając z wybranego protokołu7,8, aż neurony utworzą grubą sieć ze swoimi procesami i nie wyrażają nie tylko wczesne markery neuronalne, takie jak MAP2 lub TuJ1, ale także późne markery, takie jak NeuN.</li>
	<li>Zmieniaj połowę wybranej pożywki co 4 dni podczas procesu różnicowania neuronów. 
	UWAGA: Bardziej rozległe lub częste zmiany podłoża rozcieńczają istotne czynniki troficzne i mogą niekorzystnie wpływać na dojrzewanie.
	<ol>
		<li>W przypadku neuronów WT126 pochodzących z iPSC należy użyć następujących pożywek do hodowli po różnicowaniu: 5 ml 100x suplementu N2, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 μg / ml lamininy, 200 μM kwasu askorbinowego, 1 μM dibutyryl-cAMP i 10 ml SM1 dla 500 ml zmodyfikowanej mieszanki Eagle / składników odżywczych F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12). Stopniowo, stosując zmiany półpożywki, zastąp je podstawowym podłożem neuronalnym (Tabela materiałów) i tymi samymi suplementami.</li>
		<li>W przypadku neuronów CVB WT pochodzących z iPSC należy użyć następującej pożywki do hodowli po różnicowaniu: 500 ml neuronalnej podstawowej pożywki A (tabela materiałów) i 500 ml pożywki DMEM/F12 z 2 μg/ml lamininy, 10 ml suplementu glutaminy (tabela materiałów), 0,75 mg/ml wodorowęglanu sodu, 5 ml minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) aminokwasów endogennych, 0,2 mM kwasu askorbinowego, 10 ng/ml BDNF, 20 ml 50x B27 i 10 ml 100x suplement N2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Powlekanie wielostudzienek
<ol>
	<li>Dzień przed ponownym poszyciem pokryć poli-L-ornityną (PLO). Rozpuścić PLO w sterylnej wodzie, aby uzyskać roztwór podstawowy (10 mg/ml). Przechowuj ten bulion w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć PLO w stosunku 1:100 w wodzie, aby uzyskać stężenie 50 μg/ml podczas powlekania szkła i w stosunku 1:1 000 (10 μg/ml) podczas powlekania tworzywa sztucznego.</li>
	<li>Powłokę należy nakładać bezpośrednio na płyty docelowe. Użyć objętości powłoki odpowiedniej do wielkości płytki (tj. w przypadku płytki 24-dołkowej należy zastosować 500 μl roztworu PLO na dołek).</li>
	<li>Pozostaw talerze na noc w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Pobrać powlekane płytki w dniu ponownego powlekania i przenieść do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Zassać roztwór PLO i spłukać dwukrotnie sterylną wodą.</li>
	<li>Rozcieńczyć lamininę (1,15 mg/ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w rozcieńczeniu 1:400. 
	nuta: Rozmrozić lamininę w temperaturze 4 °C i szybko dodać do PBS, aby uniknąć agregacji lamininy i nierównomiernego powlekania.</li>
	<li>Odessać sterylną wodę i nałożyć 500 μl powłoki lamininowej na studzienki uprzednio pokryte PLO.</li>
	<li>Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na minimum 4-6 godzin. W przypadku powierzchni szklanych należy stosować dłuższe inkubacje, do 16 godzin. Stosuj stałe czasy inkubacji.</li>
</ol>
3. Odtwarzanie zróżnicowanych neuronów
<ol>
	<li>Raz delikatnie przepłukać płytkę zróżnicowanych neuronów PBS. Delikatnie rozprowadź PBS wzdłuż ścianki płytki, a nie bezpośrednio na komórkach, aby uniknąć ich zakłócenia.</li>
	<li>Delikatnie zasysaj PBS, uważając, aby nie dotykać komórek bezpośrednio, ale odsysać od krawędzi naczynia, przechylając je w kierunku badacza.</li>
	<li>Nałożyć co najmniej 1 ml enzymu proteolitycznego (tabela materiałów) na 10 cm płytkę i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze. Dodaj nieco większe objętości, jeśli pomieszczenie do hodowli tkankowej wykazuje wysoką szybkość parowania z powodu niskiej wilgotności.</li>
	<li>Inkubuj komórki enzymem proteolitycznym przez 40-45 minut, aby oderwać je od płytki i odłączyć od innych neuronów w sieci neuronalnej. 
	nuta: Czas na tym etapie ma kluczowe znaczenie. Zbyt wczesne wygaszenie proteazy może prowadzić do zwiększonej śmierci komórki po ponownym posianiu. Producent enzymu proteolitycznego zaleca, aby w przypadku pasażowania linii komórkowych (np. przez noc w temperaturze 4 °C stosować temperatury znacznie niższe niż 37 °C przy dłuższych okresach inkubacji). Należy jednak unikać obchodzenia się z neuronami w temperaturze 4 °C, ponieważ często wykazują one słabą przeżywalność po ekspozycji na zimno. Producent podaje również, że 60-minutowa inkubacja z enzymem w temperaturze 37 °C prowadzi do jego enzymatycznej inaktywacji. Jednak z doświadczenia autorów wynika, że 40-45 minutowa inkubacja kultur neuronalnych pochodzących z hiPSC w temperaturze 37 °C jest wystarczająca do skutecznej dysocjacji i doskonałego przeżycia neuronów po ponownym posiewie.</li>
	<li>Sprawdź neurony pod mikroskopem z kontrastem fazowym w czasie inkubacji i pozwól na kontynuowanie leczenia proteazą, dopóki sieć neuronowa całkowicie nie odłączy się od płytki i nie zacznie rozpadać się na mniejsze arkusze po krótkim potrząśnięciu płytką pod mikroskopem.</li>
	<li>Stłumić aktywność proteazy za pomocą 5 ml świeżej pożywki DMEM na 1 ml proteazy na 10 cm płytce, aby zatrzymać trawienie. Delikatnie rozcieraj komórki na płytce 5-8 razy, aby przerwać sieć, używając pipet serologicznych. Uważaj, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku podczas trituringu, ponieważ zróżnicowane neurony są delikatne. Nie używaj końcówki P1000, ponieważ jej koniec jest zbyt ostry i wąski, a tym samym może prześwitywać lub uszkodzić neurony.</li>
	<li>Roztwór z komórkami należy nakładać kropla po kropli przez sitko o średnicy 100 μm do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przepłucz sitko dodatkowymi 5 ml świeżej pożywki DMEM, po przefiltrowaniu komórek.</li>
	<li>Wirować komórki w wirówce stołowej przy 1 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Włóż stożkową rurkę z powrotem do szafy bezpieczeństwa biologicznego i odessaj większość pożywki, pozostawiając około 250 μl, aby zapewnić zatrzymanie wilgoci przez komórki.</li>
	<li>Delikatnie zawieś komórki w 2 ml świeżej pożywki DMEM. Nie pipetować granulki do boku probówki. Zamiast tego delikatnie odwróć stożkowy 2-3 razy i przepuść komórki przez koniec pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby je usunąć.</li>
	<li>Nałóż 10 μl zawieszonych neuronów na krawędź hemocytometru.</li>
	<li>Dodać 8-10 μl błękitu trypanowego do kropelki komórek, aby ocenić żywotność komórek na tym etapie ponownego zawieszania. Nanieść 10 μl tej mieszaniny na hemocytometr lub inne automatyczne liczniki komórek. Oceń jako żywotne te komórki, które są jasne fazowo i wykluczają barwnik błękitu trypanowego.</li>
	<li>Określ ilość żywotnych komórek/ml i przygotuj się do rozcieńczenia zawartości stożkowej probówki zgodnie z pożądaną gęstością komórek.</li>
	<li>Płytka ~ 10 000 komórek na dołek dla płytki 384-dołkowej; płytka ~ 150 000-200 000 komórek na studzienkę dla płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Dodać świeży DMEM do stożkowej probówki z zawieszonymi komórkami, aby uzyskać odpowiednie rozcieńczenie i dodać dodatkowe odpowiednie suplementy, takie jak B27 i/lub BDNF, w zależności od wymagań konkretnej linii komórkowej.</li>
	<li>Delikatnie przechyl stożkową rurkę, aby wymieszać 2-3 razy.</li>
	<li>Odessać powłokę lamininową z płytki 24-dołkowej lub z płytki wielodołkowej 384-dołkowej za pomocą 16-kanałowej pipety i przepłukać raz PBS.</li>
	<li>Zassać PBS za pomocą P1000 w przypadku płytki 24-dołkowej lub pipety 16-kanałowej w przypadku płytek 384-dołkowych.</li>
	<li>Nałóż roztwór komórkowy do każdej studzienki ruchem ósemkowym, aby uniknąć zbrylania. Jednorodność posiewu można również zoptymalizować za pomocą zautomatyzowanych urządzeń do obsługi cieczy. 
	nuta: Dodanie lamininy do pożywki rozpoczynające się 2-4 dni po ponownym posiewie pomaga również w utrzymaniu jednorodnego rozmieszczenia komórek.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.19 i 3.20 dla każdej studzienki.</li>
	<li>Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze ustawionym na temperaturę 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po 2 dniach należy rozpocząć wymianę połowy pożywki co 4 dni, używając pożywek do hodowli po różnicowaniu opisanych w punkcie 1.2. Po upływie pożądanego czasu dojrzewania utrwalić kultury przy użyciu 3,7% formaldehydu w temperaturze 37 °C i wybarwić komórki zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi.</li>
</ol>
4. Testy żywotności komórek po ponownym posiewie
<ol>
	<li>Dodać reporter wczesnej śmierci komórki (VivaFix: 0,5 μl roztworu podstawowego 50 μl na 500 μl pożywki hodowlanej na basenik) po krótkim wirowaniu roztworu podstawowego.</li>
	<li>Zobrazować żywe i martwe komórki hodowane na studzienkach ze szklanym dnem, po 20 minutach, bez żadnego etapu mycia, ponieważ barwnik fluoryzuje tylko raz wewnątrz komórek, lub utrwalić i wybarwić za pomocą 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i / lub innych przeciwciał przed obrazowaniem przy użyciu mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>
5. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Utrwal kultury z 3,7% formaldehydem w PBS plus 120 mM sacharozy przez 20 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Płukać i przepuszczać przez 0,2% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie blokować na 30 minut 2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	<li>Odessać BSA bez płukania i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z króliczym przeciwciałem anty-MAP2 1:1,000, mysim przeciwciałem anty-β3-tubulinowym (TuJ1) 1:2,000, przeciwciałem anty-NeuN kurczaka (1:100) i szczurzym przeciwciałem anty-CTIP2 (1:500) lub z mysim przeciwciałem anty-PSD95 (1:200), króliczą antysynapsyną 1 (1:200) i przeciwciałem anty-MAP2 kurczaka do barwienia synaptycznego.</li>
	<li>Przepłukać PBS i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluorem Alexa oraz DAPI przez 45 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Na koniec przemyj dwukrotnie PBS przed obrazowaniem.</li>
</ol>
6. Obrazowanie wapnia
<ol>
	<li>Zakażone hodowane komórki za pomocą AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (The Salk Institute for Biological Studies, GT3 Core Facility) po 10 dniach od ponownego posiewu i obrazowanie w celu oceny spontanicznych stanów przejściowych wapnia po 3-4 tygodniach od ponownego posiewu.</li>
</ol>
7. Akwizycja i analiza obrazu
UWAGA: Szczegółowe informacje na temat systemu akwizycji można znaleźć w Calabrese et al.12.
<ol>
	<li>Do pomiarów morfometrycznych należy użyć modułu obrazowania do ręcznej lub automatycznej akwizycji obrazu oraz modułu oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak CellProfiler13.</li>
	<li>Oblicz średnią długość neurytów TuJ1 dodatnich i dendrytów dodatnich MAP2, mierząc całkowitą długość na pole widzenia podzieloną przez liczbę neuronów (komórki dodatnie DAPI + MAP2 lub TuJ1) w tym samym polu.</li>
</ol>

<ol><li>Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+pitfalls+of+stem+cell+differentiation%3A+a+guide+to+improving+protocols+for+neurodegenerative+disease+models+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research.</a> Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).</li>
<li>Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109(2014).</li>
<li>Amin, N. D., Paşca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+Models+of+Brain+Disorders+with+Three-Dimensional+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids.</a> Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).</li>
<li>Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Passaging+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLangdon%2C+SP+%22Cancer+Cell+Culture%22">Cancer Cell Culture</a>. , Humana Press. New York, NY. (2010).</li>
<li>Picot, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPicot%2C+J+%22Human+Cell+Culture+Protocols%22">Human Cell Culture Protocols</a>. 107, Springer Science & Business Media. Berlin, Germany. (2005).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).</li>
<li>Calabrese, B., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+the+PKC+target+MARCKS+in+maintaining+dendritic+spine+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology.</a> Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).</li>
<li>Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuN%2C+a+neuronal+specific+nuclear+protein+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates.</a> Development. 116 (1), 201-211 (1992).</li>
<li>Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+spine+shrinkage+and+growth+involve+downregulation+of+cofilin+via+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms.</a> PLOS One. 9 (4), 94787(2014).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biology. 7 (10), 100(2006).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+Dorsal+Spinal+Sensory+Interneurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).</li>
<li>Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+induction+of+dorsal%2C+intermediate+and+ventral+spinal+cord+tissues+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells.</a> Development. 145, (2018).</li>
<li>Playne, R., Jones, K., Connor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopamine+neuronal-like+cells+from+induced+neural+precursors+derived+from+adult+human+cells+by+non-viral+expression+of+lineage+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stem+Cells+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors.</a> Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).</li>
<li>Rao, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illustrating+the+potency+of+current+Good+Manufacturing+Practice-compliant+induced+pluripotent+stem+cell+lines+as+a+source+of+multiple+cell+lineages+using+standardized+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols.</a> Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).</li>
<li>Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+hypothalamic+and+pituitary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells.</a> Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).</li>
<li>Endaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+dividing+neural+and+brain+tumour+cells+for+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).</li>
<li>Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+activated+cell+sorting+%28FACS%29%3A+a+rapid+and+reliable+method+to+estimate+the+number+of+neurons+in+a+mixed+population%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population.</a> Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).</li>
<li>Frega, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Neuronal+Differentiation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Measuring+Network+Activity+on+Micro-electrode+Arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54900(2017).</li>
<li>Grainger, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Models+for+Seizure-Liability+Testing+Using+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 590(2018).</li>
<li>Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+screening+of+primary+neurons%3A+ready+for+prime+time%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">High-content screening of primary neurons: ready for prime time.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykazaliśmy prostą procedurę ponownego zawieszania i ponownego powlekania ludzkich kultur neuronalnych, która optymalizuje żywotność, sukces różnicowania i obrazowanie subkomórkowe w sposób zgodny z platformami przesiewowymi o wysokiej zawartości i innymi testami istotnymi dla odkrywania leków. Rysunek 6 ilustruje ogólny przepływ pracy i przykłady takich zastosowań.
Chociaż tutaj skupiliśmy się na neuronach pochodzących z hiPSC, które są skierowane na los neuronów...

Neurony pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) są coraz bardziej istotne w obszarach badań podstawowych, rozwoju leków i medycyny regeneracyjnej. Przepływy pracy i procedury mające na celu optymalizację ich hodowli i utrzymania oraz poprawę efektywności różnicowania w określone podtypy neuronów szybko ewoluują1,2. Aby poprawić użyteczność i opłacalność neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych jako systemów modelowych podatnych na analizy o wysokiej zawartości w procesie odkrywania leków i walidacji celów, przydatne jest skrócenie czasu hodowli wymaganego do wygenerowania dojrzałych, funkcjonalnych neuronów, przy jednoczesnym zachowaniu maksymalnej odporności, odtwarzalności i istotności fenotypu. Chociaż trójwymiarowe hodowle organoidów są motorem przełomu w badaniach nad neurorozwojem3, 2-wymiarowe hodowle jednowarstwowe są szczególnie kompatybilne z aplikacjami opartymi na zautomatyzowanym obrazowaniu ze względu na ich minimalną grubość tkanki.
Jednak adaptacja metod badań przesiewowych opartych na obrazowaniu do modeli ludzkich chorób neurologicznych i neurorozwojowych stoi przed poważnym wyzwaniem. Wydłużone ramy czasowe, w których ludzki układ nerwowy dojrzewa in vivo, wymagają wydłużenia czasu w hodowli, aby dostosować się do naturalnych programów ekspresji genów i osiągnąć dojrzałość neuronalną.
Jedną z praktycznych konsekwencji długotrwałego programu różnicowania neuronów jest to, że utrzymanie kultur jednowarstwowych pochodzących z hiPSC musi być utrzymywane przez wiele tygodni, aby osiągnąć odpowiednią dojrzałość synaps. W tym czasie neuronalne komórki progenitorowe, które pozostają niezróżnicowane, nadal się dzielą. Mogą one szybko przerosnąć kulturę i przywłaszczyć sobie zawartość składników odżywczych niezbędną do utrzymania żywotnych neuronów postmitotycznych. Energicznie dzielące się nerwowe komórki progenitorowe (NPC) mogą również konkurować z neuronami o substrat wzrostu. Może to spowodować, że takie kultury będą narażone na problemy ze słabą adhezją, co jest stanem nieodpowiednim do testów opartych na obrazowaniu. Co więcej, wielu badaczy stwierdza, że im mniejsza objętość hodowli, tym większa trudność w utrzymaniu zdrowych populacji zróżnicowanych neuronów wystarczająco długo, aby zaobserwować późne stadia różnicowania neuronów. Innymi słowy, testy dojrzewania synaps przy użyciu metod badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) mogą być bardzo trudne dla neuronów pochodzenia ludzkiego.
Aby obejść niektóre z tych problemów, zastosowano procedurę ponownego zawieszania i ponownego powlekania wcześniej zróżnicowanych neuronów pochodzących z hiPSC. Po pierwsze, pozwala na badanie wzrostu neurytów (a dokładniej ich regeneracji) w populacji w pełni zaangażowanych neuronów. Po drugie, ponowne rozszczepienie wcześniej zróżnicowanych neuronów z formatu o dużej objętości (np. płytki 10 cm lub większej) do formatów o małej objętości (takich jak 96- lub 384-dołkowe płytki mikromiareczkowe zgodne z HCS) umożliwia znaczne skrócenie całkowitego czasu hodowli w warunkach małej objętości. Ułatwia to badanie montażu i dojrzewania synaps w kolejnych tygodniach in vitro.
Jednak ponowne tworzenie dojrzałych neuronów, które już mają długie neuryty i złożoną sieć połączeń, stanowi kilka wyzwań, jednym z nich jest czasami wysokie i zmienne tempo śmierci komórek. W tym miejscu opisujemy procedurę ponownego powlekania, która skutkuje doskonałą przeżywalnością i odtwarzalnością komórek. Zwykle neurony są wystawione na działanie enzymów proteolitycznych przez krótkie okresy inkubacji (zwykle ~ 3-10 min) w celu odłączenia komórek od substratu przed roztarciem. Ten krótki czas proteolizy jest zwyczajowo używany do ponownego zawieszania i przechodzenia wielu typów dzielących się komórek, w tym komórek nieneuronalnych i niezróżnicowanych komórek progenitorowych4,5,6. Jednak w przypadku zróżnicowanych neuronów zawierających długie, połączone ze sobą neuryty, konieczne jest nie tylko oderwanie komórek od substratu, ale także przerwanie sieci dendrytycznej i aksonalnej w celu wyizolowania pojedynczych komórek przy jednoczesnej minimalizacji uszkodzeń. Rzeczywiście, gruba siatka neuronów zwykle ma tendencję do odrywania się od podłoża jako pojedynczy arkusz, a nie jako pojedyncze komórki. Jeśli nie zadba się o rozluźnienie gęstej sieci neurytów, neurony nie tylko ulegają nieodwracalnemu uszkodzeniu podczas trituracji, ale wiele z nich nie przechodzi przez filtr używany do usuwania grudek, co skutkuje słabą wydajnością komórek. Poniżej opisujemy prostą modyfikację szeroko stosowanej procedury inkubacji proteazy, aby przeciwdziałać tym trudnościom.
W opisanym poniżej protokole, neurony są inkubowane przez 40-45 minut z łagodną proteazą, taką jak enzym proteolityczny (np. Accutase). W ciągu pierwszych 5-10 minut po dodaniu enzymu sieć neuronalna unosi się z podłoża w postaci arkusza. Inkubacja z proteazą trwa dodatkowe 30-40 minut, a następnie przechodzi do delikatnego rozcierania i filtrowania. Ten dodatkowy czas inkubacji pomaga zapewnić, że trawienie materiału rozluźnia sieć międzykomórkową, zapewniając w ten sposób, że późniejsze trituration wytwarza zawieszenie poszczególnych komórek. Ta procedura maksymalizuje jednorodność rozmieszczenia komórek po ponownym posiewaniu, jednocześnie minimalizując śmierć komórki. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę remembraningu do kultur neuronalnych pochodzących z hiPSC generowanych przez różne protokoły różnicowania7,8 oraz z różnych linii hiPSC. Procedura jest nominalnie odpowiednia do stosowania z większością lub wszystkimi liniami neuronów pochodzących z komórek macierzystych. Zaobserwowaliśmy, że wydłużony czas inkubacji proteazy nie jest absolutnie niezbędny do ponownego posiewu kultur z płytek małoformatowych (np. o średnicy 35 mm); Jednak, jak pokazujemy tutaj, zapewnia to znaczące korzyści podczas ponownego powlekania z płytek o dużej średnicy (np. o średnicy 10 cm lub większej), prawdopodobnie dlatego, że neuryty w takich płytkach mogą rozciągać bardzo długie procesy i tworzyć gęsto połączony układ.
Tutaj demonstrujemy tę metodę i krótko ilustrujemy jej zastosowanie w testach wczesnej neurytogenezy i dojrzewania synaps, które obejmują grupowanie białek pre- i postsynaptycznych wzdłuż dendrytów i aksonów, a następnie ich późniejszą kolokalizację w miejscach synaptycznych. Przykłady te podkreślają korzyści, jakie oferuje ten protokół w zakresie zachowania żywotności i odtwarzalności komórek. Po pierwsze, pozwala badaczom badać wczesne etapy neurytogenezy człowieka. Warunki eksperymentalne są podobne do powszechnie stosowanych pierwotnych kultur neuronów korowych lub hipokampowych gryzoni, w których komórki są ekstrahowane z mózgu późnego płodu lub wczesnego okresu poporodowego, dysocjowane przez triturację po delikatnym leczeniu proteazą i pozwalają na inicjację neurytów lub regenerację neurytów, które zostały odcięte w procedurze9,10. Podobnie jak w przypadku takich pierwotnych neuronów gryzoni, neurony pochodzące z hiPSC zaczynają tworzyć lub regenerować swoje neuryty w ciągu kilku godzin po ponownym posiewaniu, umożliwiając obrazowanie stożków wzrostu i morfologii neurytów w środowisku optymalnym dla obrazowania w czasie o dużej liczbie otaczających niezróżnicowanych komórek. Zaobserwowaliśmy, że wzrost neurytów jest bardziej zsynchronizowany w porównaniu ze zmiennymi opóźnieniami i różnymi wskaźnikami wzrostu obserwowanymi, gdy neurony po raz pierwszy zaczynają różnicować się od populacji progenitorowej. Ponadto ponowne powlekanie umożliwia testowanie neuronów wyrażających markery podtypu neuronalnego, które zwykle pojawiają się później w rozwoju neuronalnym, takie jak czynnik transkrypcyjny warstwy korowej 5/6 CTIP2 (białko oddziałujące z czynnikiem transkrypcyjnym promotora białka 2 w warstwie kurzej) lub marker panneuronalny NeuN11. Szczególnie przydatną cechą podejścia opartego na posiewach jest to, że synaptogeneza przebiega w ramach czasowych zgodnych z HCS.

<table><tbody><tr><td>Post Replating Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>Dodaj 1 ml 200 mM bulionu do 1 l pożywki N2B27</td></tr><tr><td>Dibutyryl-cAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>Dodaj 1 &mikro; M</td></tr><tr><td>Human BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17504044</td><td>Dodać 20 ml do 1 l pożywki N2B27</td></tr><tr><td>DMEM/F12 z Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>31331093</td><td>Dodać N2 i rozprowadzić w 50 ml stożkach; pokrywki do owijania parafilmu</td></tr><tr><td>Human GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/ml stężenie końcowe</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>35050038</td><td>Dodać 10 ml do 1 l pożywki N2B27; suplement glutaminy</td></tr><tr><td>Mysz Laminin</td><td>Sigma</td><td>P3655-10mg</td><td>Dodaj 100 &mikro; L do 50 ml N2B27</td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Dodaj 5 ml do 1 l pożywki N2B27 Suplement N2B27</td></tr><tr><td>17502048</td><td>Dodaj</td><td></td><td>5 ml do 500 ml</td></tr> podłoża <tr><td>Neurobaseal A</td> Media <td>Thermofisher Scientific</td><td>10888022</td><td>Połącz z DMEM/F12, aby wygenerować pożywkę N2B27 dla komórek CVB wt; neuronalny podstawowy A</td></tr><tr><td>media Neuropodstawowy</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>21103049</td><td>do komórek WT126; Neuronalne podłoże podstawowe</td></tr><tr><td>SM1 Suplement</td><td>StemCell Technologies</td><td>5711</td><td>Dodaj 1:50 do podłoża</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25080-094</td><td>Dodać 10 ml do 1 l N2B27 pożywka</td></tr><tr><td><mocna>talerz Przygotowanie</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>08772-E</td><td>Plastikowe naczynia poddane działaniu TC</td></tr><tr><td>6-dołkowe naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Thomas Scientific</td><td>1194Y80</td><td>Talerze NEST</td></tr><tr><td>Mysz Laminin</td><td>Life Technologies</td><td>23017-015</td><td>Dodaj 1:400 na plastiku</td></tr><tr><td>Poli-Ornityna</td><td>Sigma</td><td>P3655-10mg</td><td>Dodaj 1:1,000 na plastiku</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>Do rozcieńczenia Odczynniki</td></tr> do <tr><td>< odczynników > odczynników</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>431752</td><td>Sterylna, pojedynczo pakowana</td></tr><tr><td>płytka 384-dołkowa, niepowlekana</td><td>PerkinElmer</td><td>6007550</td><td>Coat z PLO i Lamininą</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td>soli fizjologicznej</td></tr> <tr><td>buforowanej fosforanem DulbeccoPłytki 384-dołkowe powlekane poli-D-lizyną</td><td>PerkinElmer</td><td>6057500</td><td>Spłukać przed pokryciem lamininą</td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Nakładać 1 ml/10 cm płytkę przez 30-45 min; enzym proteolityczny</td></tr> <tr><td> materiały utrwalające</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-1</td><td>rozpuszczony w PBS</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-12</td><td>0,8 g na 10 ml utrwalacza</td></tr><tr><td><silnego>immunologicznego materiału barwiącego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Koza anty-mysie</td><td>przeciwciało drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Koza anty-kurczak</td><td>Invitrogen</td><td>A-11041</td><td>przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Koza anty-kurczak</td><td>Przeciwciało</td><td>drugorzędowe</td>Invitrogen <td>A-21449</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 561 Koza antyszczura</td> Przeciwciało <td>drugorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>A-11077</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td>wizualizuje DNA</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało przeciwko b3-tubulinie (TuJ-1)</td><td>Neuromika</td><td>MO15013</td><td>marker neuronalny wczesnego stadium</td></tr><tr><td>Przeciwciało szczura przeciwko CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td>warstwa 5/6 korowa neurony</td></tr><tr><td>Przeciwciało kurczaka przeciwko MAP2</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B290</td><td>marker neuronalny wczesnego stadium</td></tr><tr><td>Przeciwciało kurczaka przeciwko markerowi</td><td>neuronalnemu późnego stadium</td>NeuN <td>Millipore</td><td>ABN91</td></tr><tr><td>Przeciwciało królika przeciwko MAP2</td><td>Shelley Halpain</td><td>N/A</td><td>marker neuronalny wczesnego stadium</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało przeciwko markerowi postsynaptycznemu PSD-95</td><td>Sigma</td><td>P-246</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało królicze przeciwko synapsynie 1</td><td>Millipore</td><td>AB1543</td><td>marker presynaptyczny</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30574,02</td><td>10% w PBS do blokowania</td></tr><tr><td>Titon X-100</td><td>Sigma</td><td>9002931</td><td>Rozcieńczony do 0,2% na PBS w celu przepuszczalności</td></tr><tr><td>Markery żywotności</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vivafix 649/660</td><td>Biorad</td><td>135-1118</td><td>marker śmierci komórkowej</td></tr> <tr><td>Calcium Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Nazwa odczynnika/ Firma produkująca sprzęt</td><td></td> Numer <td>katalogowy</td><td>Uwagi/</td></tr><tr><td>Opis AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE</td><td>THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility</td><td>N/A</td><td>reporter wapnia w systemie dostarczania wirusa</td></tr><tr><td>hiPSC NPC pochodzący z hiPSC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>WT 126 (Y2610)</td><td>Gage lab</td><td>N/A</td><td>Marchetto et al., 2010</td></tr><tr><td>CVB WT24</td><td>Yeo i Goldstein labs</td><td>N/A</td><td>nieopublikowane</td></tr></tbody></table>

powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Neurony zróżnicowane w dwuwymiarowej kulturze od ludzkich pluripotencjalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek macierzystych (NPC) reprezentują potężny system modelowy do badania mechanizmów chorobowych i przeprowadzania badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) w celu zbadania bibliotek związków lub identyfikacji fenotypów mutacji genów. Jednak w przypadku komórek ludzkich przejście od NPC do funkcjonalnego, dojrzałego neuronu trwa kilka tygodni. Synapsy zazwyczaj zaczynają się tworzyć po 3 tygodniach różnicowania w kulturze jednowarstwowej, a kilka białek specyficznych dla neuronów, na przykład późniejszy marker panneuronalny NeuN lub marker neuronu korowego warstwy 5/6 CTIP2, zaczyna ulegać ekspresji około 4-5 tygodni po różnicowaniu. Ten długi czas różnicowania może być niezgodny z optymalnymi warunkami hodowli stosowanymi w przypadku wielodołkowych platform HCS o małej objętości. Wśród wielu wyzwań znajduje się potrzeba dobrze przylegających, równomiernie rozmieszczonych komórek z minimalnym grupowaniem komórek oraz procedury hodowli, które sprzyjają długoterminowej żywotności i funkcjonalnemu dojrzewaniu synaps. Jednym z podejść jest różnicowanie neuronów w formacie o dużej objętości, a następnie ponowne platerowanie ich w późniejszym punkcie czasowym w wielodołkowych pojemnikach kompatybilnych z HCS. Niektóre główne wyzwania związane ze stosowaniem tego podejścia do posiewu dotyczą odtwarzalności i żywotności komórek ze względu na stresujące zakłócenia sieci dendrytycznej i aksonalnej. Tutaj demonstrujemy szczegółową i niezawodną procedurę enzymatycznego ponownego zawieszania neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) po ich różnicowaniu przez 4-8 tygodni w formacie o dużej objętości, przenoszeniu ich na 384-dołkowe płytki mikromiareczkowe i hodowli przez kolejne 1-3 tygodnie z doskonałą przeżywalnością komórek. To ponowne powlekanie ludzkich neuronów nie tylko pozwala na badanie składania i dojrzewania synaps w ciągu dwóch tygodni od ponownego posiewania, ale także umożliwia badania nad regeneracją neurytów i charakterystyką stożków wzrostu. Przedstawiamy przykłady skalowalnych testów neurytogenezy i synaptogenezy przy użyciu platformy 384-dołkowej.

Ponowne wysiewanie neuronów pochodzących z hiPSC, które różnicowały się przez wiele tygodni, oferuje szereg zalet. Jednakże odrywanie i ponowne wysiewanie zróżnicowanych neuronów posiadających długie, połączone ze sobą dendryty i aksony (Rycina 1A) może skutkować dużym odsetkiem nieodwracalnie uszkodzonych neuronów.
Zgodnie z opisem w sekcji protokołu, w celu odłączenia neuronów od podłoża zastosowano inkubację z enzymem proteolitycznym. Zazwyczaj...

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę ponownego zawieszania i hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, które wcześniej były odróżniane od progenitorów nerwowych in vitro przez wiele tygodni. Procedura ułatwia oparte na obrazowaniu testy neurytów, synaps i markerów neuronalnych o późnej ekspresji w formacie zgodnym z mikroskopią świetlną i badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.

Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

Protokół ten ułatwia wykorzystanie ludzkich pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych do zastosowań przesiewowych o wysokiej zawartości. Szczególnie dobrze nadaje się do oznaczania synaps, które w ludzkich neuronach wymagają długich okresów hodowli. Pokazujemy ponowne platerowanie neuronów z naczyń wielkoformatowych do wielostudzienek kompatybilnych z HCS w sposób, który zachowuje ich żywotność.Wbrew intuicji pokazujemy, że wydłużenie inkubacji proteazy przed ponownym wymieszaniem i ponownym posiewem poprawia przeżycie neuronów. Ludzkie neurony pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych są coraz bardziej istotne w obszarach badań podstawowych, opracowywania leków i medycyny zwyrodnieniowej. Ta delikatna metoda miareczkowania może być stosowana do ponownego zawieszania dowolnej dużej monowarstwy komórek o gęstej sieci procesów.Oprócz ludzkich iPSC może być stosowany do ponownego platerowania hodowli neuronów pierwotnych lub do ich ponownego zawieszenia w celu sortowania faktów lub sekwencjonowania pojedynczych komórek. Ważne jest, aby uważnie postępować zgodnie z krokami protokołu i często monitorować odłączenie neuronów od płytki za pośrednictwem proteazy. Optymalny czas inkubacji może się różnić w zależności od kultury.Demonstracja wizualna umożliwia nawet niedoświadczonym badaczom odtworzenie tej procedury. Zacznij od delikatnego przepłukania płytki zróżnicowanych neuronów za pomocą PBS. Rozproszyć PBS wzdłuż ścianki płytki, a nie bezpośrednio na komórkach, aby uniknąć ich zakłócenia.Zasysaj PBS od krawędzi naczynia, przechylając je, uważając, aby nie dotknąć komórek. Zastosuj co najmniej jeden mililitr enzymu proteolitycznego na 10-centymetrową płytkę. I włóż komórki z powrotem do inkubatora na 40 do 45 minut.Podczas inkubacji sprawdź neurony pod mikroskopem kontrastowym i kontynuuj leczenie proteazą, aż sieć neuronowa całkowicie odłączy się od płytki i zacznie się rozpadać. Kiedy neurony się odłączą, przerwij trawienie, dodając pięć mililitrów świeżej pożywki DEMEM na każdy mililitr proteazy. Użyj pipety serologicznej, aby delikatnie miareczkować komórki względem płytki pięć do ośmiu razy, upewniając się, że nie wywierasz zbyt dużego nacisku.Przecedź komórki przez siatkę o grubości 100 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, kropla po kropli. I przepłucz sitko dodatkowymi pięcioma mililitrami świeżej pożywki DMEM. Użyj wirówki stołowej, aby wirować komórki w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut.Po odwirowaniu włóż stożkową rurkę z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego i odessaj większość pożywki, pozostawiając 250 mikrolitrów, aby komórki były wilgotne. Delikatnie zawiesić komórki w dwóch mililitrach świeżej pożywki DMEM, a następnie przepuścić je przez koniec pięciomililitrowej pipety serologicznej. Na koniec odwróć rurkę dwa do trzech razy.Użyj hemocytometru i tryptanu niebieskiego, aby policzyć żywe komórki. A następnie DMEM do pożądanego stężenia. Dodaj odpowiednie suplementy do probówki, w zależności od wymagań konkretnej linii komórkowej i delikatnie wymieszaj komórki, przechylając stożkową rurkę dwa do trzech razy.Odessać powłokę lamininy z płytki 24-dołkowej i przepłukać ją raz PBS. Zassać PBS. I nałóż roztwór komórkowy do każdej studzienki ruchem ósemkowym, aby uniknąć zbrylania.Po zakończeniu powlekania komórek włóż płytkę z powrotem do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Krótko zmieszaj roztwór podstawowy osoby zgłaszającej wczesną śmierć komórki i dodaj go do studzienek zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Poczekaj 20 minut.A następnie wyobraź sobie żywe i martwe komórki w studzienkach ze szklanym dnem. Wydłużenie inkubacji proteazy pozwala na rozluźnienie sieci neuronalnej w obrębie uniesionej warstwy komórek. Powoduje to zmniejszenie śmierci komórki w momencie dysocjacji, a także skutkuje bardziej efektywną regeneracją w ciągu kolejnych dni.Stosując procedurę rozszerzonej inkubacji enzymów, kultury wykazują przybliżone podwojenie żywotności komórek w ciągu kilku dni po ponownym posiewie i mniejszą gęstość martwych lub umierających komórek. Faza przejściowa różnicowania neuronów trwa kilka dni, podczas których komórki stopniowo wyrażają markery neuronalne w późnym stadium. Markery te są natychmiast wykrywane w kulturach, które zostały ponownie posiane po czterech tygodniach wstępnego różnicowania.Rozszerzony protokół proteazy również umiarkowanie zwiększa przerost neurydów. Poprawia się zarówno całkowita długość neurydów, jak i wzrost dendrytów. Replatacja jest również przydatna do badania synaps.Już tydzień po ponownym posiewie zaobserwowano markery dla białek pre- i postsynaptycznych. Co więcej, aktywność elektryczna wynikająca ze spontanicznej depolaryzacji i prądów napędzanych synaptycznie jest wykrywalna za pomocą obrazowania wapniowego lub układów wieloelektrodowych. Ta procedura powlekania może być dostosowana do wielu rodzajów zastosowań.Oprócz badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji potencjalnych związków terapeutycznych, może być on wykorzystywany do obrazowania stożków wzrostu lub zapisów z matrycy wieloelektrodowej. Mechaniczna dysocjacja neuronów, które już utworzyły długie procesy, jest stresująca. Wydłużona inkubacja enzymatyczna i delikatne miareczkowanie komórek są niezbędnymi krokami dla powodzenia tej procedury.

post-differentiation-replating-human-pluripotent-stem-cell-derived

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Film demonstruje metodę generowania pobudzających neuronów korowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Po indukcji doksycykliny hiPSC wykazują nadekspresję neurogeniny-2, czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla neuronów. Dzięki zastosowaniu specyficznych pożywek i wspólnej hodowli z astrocytami, proces ten ułatwia różnicowanie się hiPSC w neurony z połączeniami synaptycznymi.

Różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w neurony na układach mikroelektrod

Film prezentuje metodę oddzielania i ponownego sadzenia ludzkich pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą łagodnego enzymu proteolitycznego. Po filtracji i odwirowaniu neurony są ponownie powlekane na powlekanej płytce wielodołkowej w celu inkubacji, co sprzyja przyczepianiu i dojrzewaniu.

Replikacja zróżnicowanych neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

My, opierając się na wiedzy z biologii rozwojowej i opublikowanych badaniach, opracowaliśmy zoptymalizowany protokół do efektywnego generowania neuronów dopaminergicznych A9 śródmózgowia zarówno z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, jak i ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co byłoby przydatne do modelowania chorób i terapii zastępczej w chorobie Parkinsona.

Ukierunkowane różnicowanie neuronów dopaminergicznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisany jest niestandardowy protokół różnicowania komórek ES myszy w zdefiniowane populacje wysoce czystych neuronów wykazujących działające synapsy i emergentne zachowanie sieci. Analiza elektrofizjologiczna wykazała utratę przekaźnictwa synaptycznego po ekspozycji na serotypy neurotoksyny botulinowej /A-/G i neurotoksynę tężcową.

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Prezentowany protokół opisuje metodę badania wzrostu neurytów i oceny neurotoksyczności związków małocząsteczkowych.

Test wzrostu neurytów i ocena neurotoksyczności z ludzkimi neuronami pochodzącymi z neuronów progenitorowych

Pokazujemy automatyzację indukowanych przez człowieka hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i różnicowanie neuronów zgodne z automatycznym obrazowaniem i analizą.

Zautomatyzowana produkcja indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów korowych i dopaminergicznych pochodzących z komórek macierzystych ze zintegrowanym monitorowaniem żywych komórek

Opisujemy produkcję mieszanych kultur astrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów pochodzących z płodowych lub dorosłych nerwowych komórek macierzystych różnicujących się w dojrzałe oligodendrocyty, oraz modelowanie in vitro szkodliwych bodźców. Połączenie z techniką badań przesiewowych o wysokiej zawartości komórek tworzy niezawodny i solidny system badań przesiewowych leków.

Analiza przesiewowa, różnicowanie i dojrzewanie płodowych i dorosłych komórek macierzystych pochodzących z płodowych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego

Poznaj metodę powtórzenia ludzkich neuronów pochodzących z komórek pluripotencjalnych w celu badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps. Protokół optymalizuje czas inkubacji proteazowej, poprawiając przeżywalność komórek.

Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości (Wideo) | JoVE Journal

Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

Przeglądaj więcej filmów