Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości
August 28th, 2019
Ten protokół opisuje szczegółową procedurę ponownego zawieszania i hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, które wcześniej były odróżniane od progenitorów nerwowych in vitro przez wiele tygodni. Procedura ułatwia oparte na obrazowaniu testy neurytów, synaps i markerów neuronalnych o późnej ekspresji w formacie zgodnym z mikroskopią świetlną i badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.
Protokół ten ułatwia wykorzystanie ludzkich pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych do zastosowań przesiewowych o wysokiej zawartości. Szczególnie dobrze nadaje się do oznaczania synaps, które w ludzkich neuronach wymagają długich okresów hodowli. Pokazujemy ponowne platerowanie neuronów z naczyń wielkoformatowych do wielostudzienek kompatybilnych z HCS w sposób, który zachowuje ich żywotność.
Wbrew intuicji pokazujemy, że wydłużenie inkubacji proteazy przed ponownym wymieszaniem i ponownym posiewem poprawia przeżycie neuronów. Ludzkie neurony pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych są coraz bardziej istotne w obszarach badań podstawowych, opracowywania leków i medycyny zwyrodnieniowej. Ta delikatna metoda miareczkowania może być stosowana do ponownego zawieszania dowolnej dużej monowarstwy komórek o gęstej sieci procesów.
Oprócz ludzkich iPSC może być stosowany do ponownego platerowania hodowli neuronów pierwotnych lub do ich ponownego zawieszenia w celu sortowania faktów lub sekwencjonowania pojedynczych komórek. Ważne jest, aby uważnie postępować zgodnie z krokami protokołu i często monitorować odłączenie neuronów od płytki za pośrednictwem proteazy. Optymalny czas inkubacji może się różnić w zależności od kultury.
Demonstracja wizualna umożliwia nawet niedoświadczonym badaczom odtworzenie tej procedury. Zacznij od delikatnego przepłukania płytki zróżnicowanych neuronów za pomocą PBS. Rozproszyć PBS wzdłuż ścianki płytki, a nie bezpośrednio na komórkach, aby uniknąć ich zakłócenia.
Zasysaj PBS od krawędzi naczynia, przechylając je, uważając, aby nie dotknąć komórek. Zastosuj co najmniej jeden mililitr enzymu proteolitycznego na 10-centymetrową płytkę. I włóż komórki z powrotem do inkubatora na 40 do 45 minut.
Podczas inkubacji sprawdź neurony pod mikroskopem kontrastowym i kontynuuj leczenie proteazą, aż sieć neuronowa całkowicie odłączy się od płytki i zacznie się rozpadać. Kiedy neurony się odłączą, przerwij trawienie, dodając pięć mililitrów świeżej pożywki DEMEM na każdy mililitr proteazy. Użyj pipety serologicznej, aby delikatnie miareczkować komórki względem płytki pięć do ośmiu razy, upewniając się, że nie wywierasz zbyt dużego nacisku.
Przecedź komórki przez siatkę o grubości 100 mikrometrów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, kropla po kropli. I przepłucz sitko dodatkowymi pięcioma mililitrami świeżej pożywki DMEM. Użyj wirówki stołowej, aby wirować komórki w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut.
Po odwirowaniu włóż stożkową rurkę z powrotem do szafki bezpieczeństwa biologicznego i odessaj większość pożywki, pozostawiając 250 mikrolitrów, aby komórki były wilgotne. Delikatnie zawiesić komórki w dwóch mililitrach świeżej pożywki DMEM, a następnie przepuścić je przez koniec pięciomililitrowej pipety serologicznej. Na koniec odwróć rurkę dwa do trzech razy.
Użyj hemocytometru i tryptanu niebieskiego, aby policzyć żywe komórki. A następnie DMEM do pożądanego stężenia. Dodaj odpowiednie suplementy do probówki, w zależności od wymagań konkretnej linii komórkowej i delikatnie wymieszaj komórki, przechylając stożkową rurkę dwa do trzech razy.
Odessać powłokę lamininy z płytki 24-dołkowej i przepłukać ją raz PBS. Zassać PBS. I nałóż roztwór komórkowy do każdej studzienki ruchem ósemkowym, aby uniknąć zbrylania.
Po zakończeniu powlekania komórek włóż płytkę z powrotem do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Krótko zmieszaj roztwór podstawowy osoby zgłaszającej wczesną śmierć komórki i dodaj go do studzienek zgodnie ze wskazówkami manuskryptu. Poczekaj 20 minut.
A następnie wyobraź sobie żywe i martwe komórki w studzienkach ze szklanym dnem. Wydłużenie inkubacji proteazy pozwala na rozluźnienie sieci neuronalnej w obrębie uniesionej warstwy komórek. Powoduje to zmniejszenie śmierci komórki w momencie dysocjacji, a także skutkuje bardziej efektywną regeneracją w ciągu kolejnych dni.
Stosując procedurę rozszerzonej inkubacji enzymów, kultury wykazują przybliżone podwojenie żywotności komórek w ciągu kilku dni po ponownym posiewie i mniejszą gęstość martwych lub umierających komórek. Faza przejściowa różnicowania neuronów trwa kilka dni, podczas których komórki stopniowo wyrażają markery neuronalne w późnym stadium. Markery te są natychmiast wykrywane w kulturach, które zostały ponownie posiane po czterech tygodniach wstępnego różnicowania.
Rozszerzony protokół proteazy również umiarkowanie zwiększa przerost neurydów. Poprawia się zarówno całkowita długość neurydów, jak i wzrost dendrytów. Replatacja jest również przydatna do badania synaps.
Już tydzień po ponownym posiewie zaobserwowano markery dla białek pre- i postsynaptycznych. Co więcej, aktywność elektryczna wynikająca ze spontanicznej depolaryzacji i prądów napędzanych synaptycznie jest wykrywalna za pomocą obrazowania wapniowego lub układów wieloelektrodowych. Ta procedura powlekania może być dostosowana do wielu rodzajów zastosowań.
Oprócz badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji potencjalnych związków terapeutycznych, może być on wykorzystywany do obrazowania stożków wzrostu lub zapisów z matrycy wieloelektrodowej. Mechaniczna dysocjacja neuronów, które już utworzyły długie procesy, jest stresująca. Wydłużona inkubacja enzymatyczna i delikatne miareczkowanie komórek są niezbędnymi krokami dla powodzenia tej procedury.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje procedurę ponownego zawieszania i hodowli ludzkich neuronów pochodzących z komórek macierzystych, które zostały zróżnicowane in vitro. Metoda ta pozwala na opracowanie testów opartych na obrazowaniu neurytów, synaps i markerów neuronowych, nadających się do zastosowań w badaniach wysoko-zawartościowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórek macierzystych
- Techniki hodowania komórek
Tło
- Neurony pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych są kluczowe dla badań synaps.
- Neurony te wymagają długiego okresu hodowli do wykształcenia dojrzałości.
- Poprawa żywotności neuronów podczas hodowli jest niezbędna dla dokładnych badań.
- Procedura poprawia odzyskiwanie i żywotność komórek po ponownym zawieszeniu.
Cel badania
- Stworzyć niezawodną metodę hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych.
- Przedstawić skuteczne ponowne zawieszenie dla badań wysoko-zawartościowych.
- Optymalizacja czasu inkubacji proteazy dla poprawy zdrowia komórek.
Stosowane metody
- Metoda hodowli komórek z użyciem ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych.
- Wykorzystanie szczegółowego leczenia proteazami do delikatnego oderwania komórek.
- Włączenie wizualnych kontroli w celu monitorowania oderwania neuronów podczas protokołów.
- Przestrzeganie ścisłego harmonogramu inkubacji i procesów ponownego zawieszania.
- Metoda jest przystosowana do innych typów neuronów i zastosowań.
Główne wyniki
- Przedłużona inkubacja proteazy poprawiła przeżywalność neuronów i zmniejszyła śmierć komórek.
- Wykazano zwiększony wzrost neurytów i żywotność przez kilka dni po ponownym zawieszeniu.
- Markery białek synaptycznych obserwowano w ciągu tygodnia po ponownym zawieszeniu.
- Aktywność elektryczna była wykrywalna, co wskazuje na funkcjonalne sieci neuronowe.
Wnioski
- Badanie zapewnia odtwarzalny protokół dla hodowania neuronów i zastosowań testowych.
- Poprawiona przeżywalność i wzrost neurytów ułatwia dalsze badania nad funkcjonalnością neuronów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów neuronowych i potencjalnych kierunków terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Replating human pluripotent stem cell-derived neurons enables high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation within a compressed timeline, addressing the bottleneck of lengthy differentiation cycles in drug discovery. This approach supports scalable, reproducible assays for target validation and phenotypic screening in neurodegenerative disease models. By improving cell viability and preserving functional networks post-replating, the method enhances predictive confidence in early-stage compound evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through scalable assessment of neurite outgrowth and synaptic marker expression in human neurons.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation using late-stage neuronal markers such as NeuN and CTIP2.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid detection of compounds affecting neurite regeneration and synapse assembly within two weeks post-replating.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of uniformly distributed, viable neurons in 384-well formats for high-content imaging of neurite length and synaptic puncta.
- Operational Value: Ensures assay standardization through enzymatic dissociation and gentle titration, minimizing variability from mechanical stress.
- Scalability: Enables platform reuse across compound libraries and gene perturbation studies with consistent cell recovery and viability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant neuronal phenotypes from discovery through preclinical validation by preserving synapse maturation trajectories.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of pre- and post-synaptic protein expression and electrical activity as functional readouts for target engagement.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on quantitative neuritogenesis and synaptogenesis readouts prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The replating method bridges early discovery and preclinical workflows by providing a scalable neuronal model compatible with high-content screening timelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via quantitative imaging of neurite outgrowth and dendritic arborization.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized dissociation and replating in multi-well formats.
- Analytics: Enables comparison of conditions via measurable outputs such as total neurite length, dendrite growth, and synaptic protein signal intensity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through detection of spontaneous electrical activity and synaptically-driven currents post-replating.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal plating capability applicable across multiple assay types and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurite and synapse formation assays.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through defined protease titration and gentle resuspension steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by shortening the time-to-assay for mature neuronal phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on early-stage neuritogenesis and synaptogenesis efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell-derived neuronal culture and enzymatic dissociation techniques.
- Depends on access to phase-contrast microscopy for monitoring neural network detachment during protease incubation.
- Necessitates standardized protocols for protease concentration, incubation time, and titration to ensure cross-lot consistency.
- Requires adaptation of coating and seeding densities when transitioning between different multi-well formats.
- Practical limitations include variability in optimal protease incubation time across cell lines and differentiation stages.
